Summary
Denne protokol viser den nøjagtige og reproducerbare måling af iltforbrug i ikke-humane primat pancreas-Holme. Den ø-læsse teknik og belægning af mikropladen giver en ramme for effektiv måling af respiration i andre typer af kultiverede sfæroider.
Abstract
Målingen af iltforbrug i sfæide klynger af celler, såsom ex vivo pancreas-Holme, har historisk set været udfordrende. Vi demonstrerer målingen af ø-iltforbrug ved hjælp af en 96-brønd mikroplade designet til måling af iltforbrug i sfæroider. I denne analyse er sfæroide-mikropladerne belagt med en celle-og vævsklæber på dagen forud for analysen. Vi udnytter en lille mængde klæbemiddel løsning til at tilskynde Islet tilslutning til kun bunden af brønden. På dagen for analysen indlæses 15 Holme direkte i bunden af hver brønd ved hjælp af en teknik, der sikrer optimal positionering af Holme og nøjagtig måling af iltforbrug. Forskellige aspekter af mitokondrie respiration er probed farmakologisk i ikke-humane primat islets, herunder ATP-afhængige respiration, maksimal respiration, og proton lækage. Denne metode giver mulighed for ensartede, reproducerbare resultater ved hjælp af kun et lille antal Holme per brønd. Det kan teoretisk set anvendes på alle kultiverede sfæroider af samme størrelse.
Introduction
For at opretholde normale blodsukkerniveauer, bugspytkirtlen β celle skal fornemme stigninger i glucose og udskiller insulin i overensstemmelse hermed. Koblingen af insulinsekretion med glukose niveauer er direkte forbundet med glukose metabolisme og produktion af ATP gennem mitokondrie oxidativ fosforylering. Således, mitokondrier spiller en afgørende rolle i stimulus-sekretion kobling1. Vurdering af β-celle mitokondrie funktion kan afsløre defekter, der fører til nedsat insulinsekretion. Sekretionen af Glucagon af pancreas α celler er også tæt knyttet til mitokondrie funktion2. Selv om udødeliggjort Islet cellelinjer har vist sig nyttige for nogle typer af assays, fysiologi af disse celler ikke præcist rekapitulere hele ø-funktion, som illustreret ved potensering af insulinsekretion ved Glucagon3,4 og hæmning af Glucagon sekretion af insulin/somatostatin5,6 i intakt Holme. Dette viser behovet for at måle iltforbrug ved brug af hele, intakte Holme.
Teknikker til måling af ø-celle respirometri har udviklet sig over tid, fra brugen af ilt-følsomme fluorescerende farvestoffer7 til solid-state sensorer, der direkte måler iltforbrug8. Oprindeligt designet til monolayer, vedsiddende celler, almindeligt anvendte cellekultur plade systemer har vist sig at være ineffektiv for bugspytkirtlen Holme. Da Holme ikke naturligt holder sig til brøndene, er de tilbøjelige til at blive skubbet til periferien af kulturen godt resulterer i unøjagtige måling af iltforbrug9. For at bekæmpe dette problem, specialiserede 24-brønd plader med en central depression, der kunne indeholde Holme blev udviklet9. 24-brøndens plade system var dog begrænset af det store antal Holme, der kræves (50-80 pr. brønd), og antallet af betingelser, der kan testes samtidigt10. Den seneste udvikling af 96-brønd mikroplader designet specielt til ekstracellulær flux analyse i sfæroider har overvundet disse barrierer, gør det muligt at måle ø-respirometri med 20 eller færre Holme pr godt10.
Her viser vi brugen af dette system til at måle iltforbrug i Holme fra den japanske makak (Macaca fuscata), en dyremodel med lignende ø-biologi til mennesker11,12. I denne protokol analyseres 15 makaque Holme pr. brønd. I vores hænder, 15 Holme pr brønd produceret højere baseline ilt forbrug end færre Holme, med robust aktivering og undertrykkelse af respiration som reaktion på farmakologisk manipulation. Vi fremhæver trinene for at forberede analysen, en effektiv metode til konsekvent lastning af Holme i midten af hver brønd, og fælles udfordringer, når du udfører denne analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af mikropladen og sensor patron på dagen før kørsel af analysen
Holme blev isoleret fra tre år gamle japanske macaques som tidligere beskrevet13. Denne metode er meget lig den, der anvendes til at isolere menneskelige Holme fra Kadaver donorer, men adskiller sig fra mus, hvor pancreas er ofte oppustet med kollagenase opløsning, mens dyret er under sedation og før organ fjernelse. Ø-hentning blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) i Oregon national Primate Research Center (ONPRC) og Oregon Health and Science University og blev godkendt af ONPRC IACUC. ONPRC overholder loven om dyrevelfærd og forordninger, der håndhæves af Usa's landbrugsministerium (USDA) og den offentlige sundhedstjeneste politik om human pleje og anvendelse af forsøgsdyr i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af National Institutes of Health.
- Fremstilling af Sfæide mikropladen
- Forbered 3 mL af en 0,1 M opløsning af natriumbicarbonat. Filter Steriliser opløsningen. Vi udnyttede et 0,45 μm filter (tabel over materialer).
- I en cellekultur hætte tilsættes 200 μL celle-og vævsklæber (tabel over materialer) til 2,8 ml 0,1 m natriumbicarbonat. Derefter tilsættes 20 μl af denne opløsning til bunden af hver brønd af 96-Well sfæroide Micro Plate (tabel over materialer). Sørg for, at luftbobler fjernes fra pipet spidsen, og at kun bunden af pladen er dækket. Belægning af mikropladen forhindrer Holme i at bevæge sig op i siderne af brøndene, når stofferne tilsættes og blandes ind i brønden under analysen.
Bemærk: det er kun nødvendigt at belægge så mange brønde, som vil blive brugt til Holme, når analysen er kørt. Hvis kun et par brønde vil blive brugt, kan den celle klæbende opløsning skaleres ned korrekt. Den celle lim, der anvendes i analysen, er en formuleret proteinopløsning udvundet fra marine Mussel. Alternativt kan mikropladen brønde være belagt med 20 μL af 100 μg/mL poly-D-lysin. - Pladen inkubates i en 37 °C, ikke-CO2 -inkubator i en time.
- I et sterilt miljø, aspirere celle klæbende opløsning fra pladen. Vask hver brønd to gange med 400 μL 37 °C sterilt vand ved hjælp af et multikanals pipet. Lad lufttørre.
- Efter 30-40 minutter dækkes pladen og opbevares natten over ved 4 °C.
- Hydrering af sensor patronen
- I et sterilt miljø, Åbn sensor patron pakken (tabel over materialer) og fjern indholdet. Anbring sensor patronen på hovedet ved siden af brugs pladen.
- Fyld hver brønd på brugs pladen med 200 μL sterilt vand, og sænk sensor patronen tilbage i brugs pladen. Placer monteret sensor patron og brugs plade i en 37 °C, ikke-CO2 inkubator natten over.
- Klargøring af Kalibrant
- Aliquot 25 mL kalibrant (tabel over materialer) til et 50 ml konisk rør. Placer røret i en 37 °C, ikke-CO2 inkubator natten over.
2. protokol for medie klargøring, lastning af Holme og lastning af sensor patron på dagen for analysen
- Udarbejdelse af medier
- Til 48,5 mL base medier (minimal DMEM, se tabel over materialer), tilsæt 500 μl hver af 1 mm natrium pyruvat og 2 mm glutamin. Derudover tilsættes 496 μL af 200 mg/ml glukose (den endelige koncentration af glukose i medierne er 5,5 mM).
Bemærk: baseline glukose koncentrationen blev holdt konstant for disse eksperimenter. Men, glucose kan også bruges til at stimulere respiration ud over de farmakologiske manipulationer beskrevet slag10. - Bekræft, at pH-værdien er 7,4 +/-0,1, og Juster om nødvendigt.
- Til 48,5 mL base medier (minimal DMEM, se tabel over materialer), tilsæt 500 μl hver af 1 mm natrium pyruvat og 2 mm glutamin. Derudover tilsættes 496 μL af 200 mg/ml glukose (den endelige koncentration af glukose i medierne er 5,5 mM).
- Klargøring af sensor patron
- Tag sensor patronen ud af inkubator, Fjern dækslet til sensor patronen, og smid vandet ud af brøndene. Placer 200 mL pre-opvarmet kalibrant i hver brønd og Udskift sensor patron låget.
- Placer sensor patronen tilbage i inkubator i ca. 1 time (indtil det er nødvendigt).
- Forberedelse af lægemidler til mitokondriel stress analyse
- Åbn stress testkit (tabel over materialer) og fjern indholdet. Opløs lager og arbejds løsninger for oligomycin, Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) og Rotenone/Antimycin A (AA) som følger.
- Oligomycin: Tilsæt 630 μL af samlede medier til rør for at gøre 100 μM bestand. Derefter fortyndes til 45 μM med medier for at opnå port koncentration (endelig brønd koncentration efter injektion vil være 4,5 μM)
- FCCP: Tilsæt 720 μL af samlet medie til rør for at gøre 100 μM bestand. Fortyndes til 10 μM med medier for at opnå portkoncentration (endelig brønd koncentration vil være 1 μM)
Bemærk: BSA og/eller FBS bør ikke tilsættes til medierne, da dette kan påvirke virkningen af mitokondrie uncouplers14. - Rotenone/AA: Tilsæt 540 μL af samlet medie til rør for at gøre 50 μM bestand. Fortyndes til 25 μM med medier for at opnå portkoncentration (endelig brønd koncentration vil være 2,5 μM)
Bemærk: ovenstående koncentrationer har givet konsistente resultater i vores hænder. Yderligere FCCP førte ikke til yderligere stigning i respiration. Det kan dog være nødvendigt at justere lægemiddel koncentrationerne afhængigt af ølets størrelse og især med Holme fra forskellige arter eller ikke-ø-sfæroider. For reference, den gennemsnitlige diameter af en ikke-menneskelig primat Islet er omkring 150 μm15.
- Åbn stress testkit (tabel over materialer) og fjern indholdet. Opløs lager og arbejds løsninger for oligomycin, Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) og Rotenone/Antimycin A (AA) som følger.
- Fremstilling af sfæidplade og overførsel af Holme
- Håndplukkede pancreas-Holme i en 60 mm x 15 mm cellekultur skål indeholdende samlede medier for at opnå nær 100% renhed.
Bemærk: Holme skal vises afrundet, med en klart defineret periferi, og synes tættere end exokrine vævs forurenende stoffer. Undgå Holme, der ser beskadigede eller flossede ud. I dette eksperiment blev øen størrelse ikke målt direkte, selv om vi forsøgte at plukke Holme af omtrent tilsvarende størrelse for hver brønd og prøve. - Læg hver brønd af sfæide mikropladen med 175 μL samlede medier ved hjælp af en multikanals pipette.
- Ved hjælp af en P20-pipette, der er indstillet til 15 μL, Aspirér 15 Holme fra cellekultur parabol. Islets skal være synlige i pipettespidsen til det blotte øje.
- For at overføre Holme til sfæroide-mikropladen skal du sænke pipettespidsen til bunden af brønden, knap løfte op og langsomt pipettere en meget lille mængde (~ 5 μl). Bekræft, at alle Holme har forladt pipettespidsen. Hver brønd bør modtage 15 Holme. Lejlighedsvis kontrollere sfæide mikropladen under mikroskopet for at kontrollere, at Holme er i bunden af hver brønd i stedet fast til siderne.
Bemærk: undgå at indlæse hjørne hullerne med Holme. Oxygen og pH flux ud af plastik kan forekomme under analysen, og dette er forværret i de fire hjørne brønde. - Når alle Holme er blevet overført til sfæroide-mikropladen, Inkubér du mikropladen i en 37 °c, ikke-Co2 -inkubator, mens du udfører trinene nedenfor.
- Håndplukkede pancreas-Holme i en 60 mm x 15 mm cellekultur skål indeholdende samlede medier for at opnå nær 100% renhed.
- Isæning af sensor patronen og kørsel af analysen
- Fjernsensor patronen fra inkubator. Porte A-C for hver brønd skal læsses med enten stof eller medier. Brønde, der indeholder Holme og de fire hjørne brønde skal læsses med stof. Ikke-hjørne brønde uden Holme skal indlæses med mediet. Port D kan stå tomt. Indlæs port A (øverst til venstre for hver sensor) med 20 μL oligomycin eller medier. Indlæs port B (øverst til højre) med 22 μL FCCP eller medier. Indlæs port C (nederst til venstre) med 25 μL rotenon/AA eller medier.
- Program mere en ekstracellulær flux Analyzer assay for en 30 minutters baseline respiration periode (5 cyklusser af 3 minutters mix, 3 minut mål), 42 minutters oligomycin måleperiode (7 cyklusser af 3 minutters mix, 3 minut mål), 30 minutter FCCP (5 cyklusser af 3 minutters mix, 3 minutters måling), og 30 minutter Rotenone/AA (5 cyklusser af 3 minutters mix, 3 minut mål).
- Kør analysen og følg instruktionerne på skærmen for kalibrering af sensoren og indsættelse af mikropladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at indlæse Holme i mikropladen skal 15 Holme aspireres i 15 μl medier, som vist i figur 1A. Islets vil naturligt bosætte sig mod bunden af pipet spidsen inden for et par sekunder. Derefter sænkes pipet spidsen ned til bunden af brønden. Spidsen er meget let løftet, og en lille volumen (ca. 5 μL) er pipetteret ud sammen med Holme. Denne teknik resulterer i konsekvent placering af ø i bunden af mikropladen godt (figur 1B) giver mulighed for nøjagtige iltforbrug målinger.
Figur 2 viser repræsentative resultater ved individuel brønd for iltforbrug i hele analysen. Dette særlige eksperiment viser, hvad der kan ske, når brønde er lastet dårligt, med mange Holme stukket op på siderne af brønden snarere end i bunden af brønden. Dette kan skyldes pipettering for meget medier i brønden efter at Holme allerede er blevet pipetteret ud af spidsen. Strømmen af ekstra medier skubber Holme ud af bunden af brønden. Når dette sker, det oprindelige niveau af iltforbrug vil være meget lav, og dette godt vil vise lidt at ingen reaktion på FCCP. Den fed linje i figur 2 viser dette fænomen.
Figur 3 viser et andet eksperiment, hvor de fleste brønde viste signifikant respiration og respons på lægemidler. Men to brønde (med fed linjer) viste ingen respons på rotenone/AA. Dette tyder på, at stoffet ikke var korrekt frigivet i brønden. I dette tilfælde, som med tilfælde af ingen basal ilt forbrug, disse brønde kan udelukkes fra yderligere analyse.
Figur 4 viser resultaterne af en vellykket analyse. Her viser vi et eksempel på summariske data fra et separat eksperiment, hvor brønde blev korrekt lastet med Holme og korrekt injiceret med narkotika. ATP-afhængige mitokondrie ilt forbrug blev effektivt hæmmet af oligomycin, maksimal respiration-godt over basal niveauer-blev induceret af FCCP, og mitokondrie respiration var helt lukket ned-under oligomycin niveauer-ved hæmning af elektrontransportkæden med rotenone/AA.
Figur 1: pipetteringsteknik til Ilægning af Holme i mikropladen. A) ca. 15 Holme (rød pil) pipetteres med 15 μl medier. (B) Holme centreret i bunden af sfæomikropladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Well-to-Well variabilitet på grund af forskellen i ø-lastning. Wells indlæst forkert (fed blå linje) viser lidt at ingen basal ilt forbrug og minimal respons på celle stresstest narkotika. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mislykket lægemiddel indsprøjtning. To brønde (fed blå linjer) blev ikke injiceret med rotenone/AA og viser ingen signifikant fald i iltforbrug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: gennemsnitlige data på tværs af alle brønde i et eksperiment efter udelukkelse af dårligt belastede eller injicerede brønde. Gennemsnitligt iltforbrug gennem hele cellen stresstest analyse i et separat eksperiment, herunder 16 tekniske replikater. Fejllinjer viser standardafvigelsen for n = 16 brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af ø-iltforbrug har tidligere været hæmmet af den sfæriske form af Holme, deres manglende overholdelse af kultur overflader og antallet af Holme, der kræves pr. brønd. I denne protokol fremhæver vi effekten af 96-Well sfæroide-mikropladen til måling af ø-iltforbrug på et lille antal Holme og viser en teknik til håndtering og lastning af Holme, som er teknisk gennemførlig og giver ensartede Resultater.
For at Holme kan holde sig til bunden af mikropladen og være upertureret under blandings trinene i hele analysen, er 96-brønd-mikropladen belagt med en celle klæbende opløsning dagen før analysen. Selv om dette er generelt gavnligt, hvis Holme ikke er indlæst ordentligt de er tilbøjelige til at holde sig til siden af brønden snarere end bunden, hvilket påvirker eller udelukker nøjagtig måling. For at bekæmpe dette, anbefaler vi belægning brønde med en meget lille mængde af klæbende opløsning-kun 20 μL. Derudover sikrer den pipetteringsteknik, vi demonstrerer, at Holme er lastet til bunden af brønden og ikke skubbet op i siderne ved strømmen af ekstra medier .
96-Well sfæroide Micro Plate har overvundet tidligere begrænsninger i målingen af ø-iltforbrug, herunder det høje antal Holme, der kræves, og antallet af betingelser, som kan testes samtidigt. Faktisk, en nylig undersøgelse10 demonstrerede brugen af dette system med en enkelt menneskelige ø per brønd. Men måling af iltforbrug ved hjælp af enkelt Holme resulterede i meget lave basal målinger af iltforbrug, som var betydeligt over baggrunden i kun de største Holme (diameter over 290 μm). NHP-Holme har tendens til at være mindre end humane Holme, med en gennemsnitlig diameter på kun 150 μm15. I vores hænder viste 15 NHP-Holme pr. brønd højere baseline og en mere responsiv profil under celle stresstesten end færre Holme. Vi testede også fem og ti Holme per brønd, men fandt ud af, at basal iltforbrug og signal til støj blev reduceret betydeligt.
Ud over evnen til at bruge et lavt antal Holme per brønd, den 96-brønd mikropladen giver mulighed for afprøvning af flere forskellige betingelser på én gang. Dette er gavnligt i tilfælde, hvor Holme behandles med forskellige forbindelser eller genetisk manipulerede. Men når man sammenligner grupper af menneskelige eller ikke-menneskelige primat Holme, der kommer fra forskellige kilder (f. eks diabetisk versus ikke-diabetisk Holme), prøver er ofte modtaget på forskellige dage. I disse tilfælde er det således ikke muligt at udnytte dette system fuldt ud.
For at kvantificere forskellige aspekter af mitokondriel iltforbrug, manipulerede vi forskellige aspekter af respiration farmakologisk. De anvendte lægemiddelkoncentrationer var baseret på en perviøs undersøgelse i humane Holme10. Dosen af FCCP blev optimeret til at inducere maksimal mitokondriel respiration i vores hænder. Specifikt var koncentrationen af oligomycin 4,5 μM, FCCP var 1 μM, og rotenone/AA var 2,5 μM. Disse koncentrationer skal dog sandsynligvis kalibreres til forskellige anvendelser af denne protokol.
De producerede data kan enten analyseres direkte eller normaliseret ved hjælp af en række metoder. I dette eksperiment blev der anvendt lige mange Holme af samme størrelse til hver prøve, og data blev ikke normaliseret efter celle nummer eller ø-størrelse, hvilket kan være vanskeligt at kvantificere direkte. En alternativ metode til normalisering er ved total cellulære protein, som involverer lyserende celler efter analysen udføres og kvantificerer protein niveauer. Data kan også normaliseres til basal respiration niveauer. Dette kan være oplysende i visse tilfælde, såsom kvantificering af reservekapacitet i procent af basal niveauer. Men med disse normaliserings metoder og andre, kan oplysninger gå tabt under normalisering som tidligere beskrevet16.
Det system, der er beskrevet her, giver et unikt værktøj til bedre at forstå øen fysiologi. Faktisk er betydningen af iltforbrug i Islet sundhed illustreret ved den observation, at øen ilt forbrug er tæt knyttet til Islet sundhed og sandsynligheden for en vellykket ø transplantation17. Dette system giver en fremragende platform for konsekvent kvantificering af ø-iltforbrug, som i teorien også kan anvendes på enhver tilsvarende størrelse kultiverede sfæroider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Vanderbilt High gennemløb screening kerne for brugen af deres faciliteter, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) for ikke-menneskelig primat Islet isoleringer, og Eric Donahue (Vanderbilt University) for assistance med figur 1. J.M.E. blev støttet af NIGMS fra National Institutes of Health underpris nummer T32GM007347. M.G. blev støttet af NIH/NIDDK (R24DK090964-06) og Department of Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
