Summary
Este protocolo demonstra a medida precisa e reproduzível do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos. As técnicas de carregamento de ilhotas e revestimento da microplaca fornecem uma estrutura para a medição eficiente da respiração em outros tipos de esferóides cultivados.
Abstract
A medição do consumo de oxigênio em aglomerados esferóides de células, como ilhotas pancreáticas ex vivo, tem sido historicamente desafiadora. Demonstramos a medição do consumo de oxigênio de ilhota usando uma microplaca de 96 poços projetada para a medição do consumo de oxigênio em esferóides. Neste ensaio, as microplacas esferóides são revestidas com um adesivo de células e tecidos no dia anterior ao ensaio. Utilizamos um pequeno volume de solução adesiva para incentivar a adesão ao ilhota apenas ao fundo do poço. No dia do ensaio, 15 ilhotas são carregadas diretamente na base de cada poço usando uma técnica que garante o posicionamento ideal das ilhotas e a medição precisa do consumo de oxigênio. Vários aspectos da respiração mitocondrial são sondados farmacologicamente em ilhotas de primatas não humanos, incluindo respiração dependente de ATP, respiração máxima e vazamento de prótons. Este método permite resultados consistentes e reproduzíveis usando apenas um pequeno número de ilhotas por poço. Teoricamente, pode ser aplicado a quaisquer esferóides cultivados de tamanho semelhante.
Introduction
A fim de manter os níveis normais de glicose no sangue, a célula β pancreática deve sentir elevações na glicose e secretar insulina em conformidade. O acoplamento da secreção de insulina com os níveis de glicose está diretamente ligado ao metabolismo da glicose e à produção de ATP através da fosforia oxidativa mitocondrial. Assim, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no acoplamento de estímulo-secreção1. Avaliar a função mitocondrial das células β pode revelar defeitos que levam à secreção de insulina prejudicada. A secreção de glucagon por células α pancreáticas também está intimamente ligada à função mitocondrial2. Embora as linhas imortalizadas da pilha da ilhota tenham provado úteis para alguns tipos de ensaios, a fisiologia destas pilhas não recapitula résível a função inteira da ilhota, como ilustrado pela potentiação do secretion do insulin pelo glucagon3,4 e pela inibição do secretion do glucagon pelo insulin/somatostatin5,6 em ilhotas intatas. Isso demonstra a necessidade de medir o consumo de oxigênio usando ilhotas inteiras e intactas.
Técnicas para a medição da respirometria de células ilhotas evoluíram ao longo do tempo, desde o uso de corantes fluorescentes sensíveis ao oxigênio7 a sensores de estado sólido que medem diretamente o consumo de oxigênio8. Inicialmente projetado para monocamada, células aderentes, sistemas de placa de cultura celular comumente usados provaram ser ineficazes para ilhotas pancreáticas. Como as ilhotas não aderem naturalmente aos poços, eles são propensos a serem empurrados para a periferia da cultura, resultando em medição imprecisa do consumo de oxigênio9. Para combater esse problema, placas especializadas de 24 poços com uma depressão central que poderia conter ilhotas foram desenvolvidas9. No entanto, o sistema de placas de 24 poços foi limitado pelo grande número de ilhotas necessárias (50-80 por poço) e pelo número de condições que poderiam ser testadas simultaneamente10. O recente desenvolvimento de microplacas de 96 poços projetadas especificamente para análise de fluxo extracelular em esferóides superou essas barreiras, permitindo a medição da respirometria de ilhotas com 20 ou menos ilhotas por poço10.
Aqui, demonstramos o uso deste sistema para medir o consumo de oxigênio em ilhotas do macaco japonês (Macaca fuscata), um modelo animal com biologia de ilhotas semelhante aos seres humanos11,12. Neste protocolo, 15 ilhotas de macacosão são analisadas por poço. Em nossas mãos, 15 ilhotas por poço produziram maior consumo de oxigênio de base do que menos ilhotas, com ativação robusta e repressão da respiração em resposta à manipulação farmacológica. Destacamos os passos para se preparar para o ensaio, um método eficaz para o carregamento consistente de ilhotas no centro de cada poço, e desafios comuns ao realizar este ensaio.
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Protocol
1. Preparação de microplaca e cartucho de sensor no dia anterior à execução do ensaio
Ilhotas foram isoladas de três anos de idade macacos japoneses como descrito anteriormente13. Este método é muito semelhante ao usado para isolar ilhotas humanas de doadores de cadáveres, mas difere dos ratos, em que pancreata são muitas vezes inflados com solução de colagem, enquanto o animal está sedação e antes da remoção de órgãos. A recuperação de ilhotas foi realizada de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e da Oregon Health and Science University e foi aprovada pelo ONPRC IACUC. O ONPRC cumpre a Lei de Bem-Estar Animal e regulamentos aplicados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e pela Política de Serviços de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde.
- Preparação da microplaca esferóide
- Prepare 3 mL de uma solução de 0,1 m de bicarbonato de sódio. Filtro esterilizar a solução. Utilizamos um filtro de 0,45 μm(Tabela de Materiais).
- Em um capuz de cultura celular, adicione 200 μL de adesivo celular e tecido(Tabela de Materiais)a 2,8 mL de 0,1 M de bicarbonato de sódio. Em seguida, adicione 20 μL desta solução para o fundo de cada poço da microplaca esferóide de 96 poços(Tabela de Materiais). Certifique-se de que as bolhas de ar são removidas da ponta do tubo e apenas a parte inferior da placa é coberta. Revestimento da microplaca impede ilhotas de subir os lados dos poços quando as drogas são adicionadas e misturadas no poço durante o ensaio.
NOTA:Só é necessário revestir tantos poços como será usado para ilhotas quando o ensaio é executado. Se apenas alguns poços serão usados, a solução adesiva celular pode ser reduzida adequadamente. O adesivo celular usado no ensaio é uma solução de proteína formulada extraída do mexilhão marinho. Alternativamente, os poços de microplaca podem ser revestidos com 20 μL de 100 μg/mL poli-D-lisina. - Incubar a placa em uma incubadora de 37 °C, não CO2 por uma hora.
- Em um ambiente estéril, aspirate solução adesiva celular da placa. Lave cada poço duas vezes com 400 μL de 37 °C de água estéril usando um pipet multicanal. Deixe secar o ar.
- Após 30-40 minutos, cubra o prato e guarde durante a noite a 4 °C.
- Hidratação do cartucho do sensor
- Em um ambiente estéril, abra o pacote de cartuchos de sensor(Mesa de Materiais)e remova o conteúdo. Coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de serviço público.
- Encha cada poço da placa de serviço público com água estéril de 200 μL e abaixe o cartucho do sensor de novo na placa de serviço público. Coloque o cartucho de sensor montado e a placa de serviço público em uma incubadora de 37 °C, não CO2 durante a noite.
- Preparação do calibrante
- Aliquot 25 mL de calibrante(Tabela de Materiais)em um tubo cônico de 50 mL. Coloque o tubo em uma incubadora de 37 °C, não CO2 durante a noite.
2. Protocolo para preparação de mídia, carregamento de ilhotas e carregamento de cartucho de sensor no dia do ensaio
- Preparação da mídia
- A 48,5 mL de mídia base (DMEM mínimo, ver Tabela de Materiais), adicione 500 μL cada um dos 1 mM de sódio piruvado e 2 mm glutamina. Além disso, adicione 496 μL de 200 mg/ml de glicose (concentração final de glicose na mídia é de 5,5 mM).
NOTA:A concentração de glicose de base foi mantida constante para esses experimentos. No entanto, a glicose também pode ser usada para estimular a respiração, além das manipulações farmacológicas descritas golpe10. - Confirme que o pH é 7,4 +/- 0,1, ajustando se necessário.
- A 48,5 mL de mídia base (DMEM mínimo, ver Tabela de Materiais), adicione 500 μL cada um dos 1 mM de sódio piruvado e 2 mm glutamina. Além disso, adicione 496 μL de 200 mg/ml de glicose (concentração final de glicose na mídia é de 5,5 mM).
- Preparação do cartucho do sensor
- Tire o cartucho de sensor da incubadora, retire a tampa do cartucho do sensor e despejar água dos poços. Coloque 200 mL de calibrante pré-aquecido em cada poço e substitua a tampa do cartucho de sensor.
- Coloque o cartucho do sensor de volta na incubadora por cerca de 1 hora (até que seja necessário).
- Preparação de drogas para ensaio de estresse mitocondrial
- Abra o kit de teste de estresse(Tabela de Materiais)e retire o conteúdo. Compo o estoque e as soluções de trabalho para oligomicina, o cianeto carbonil-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) como segue.
- Oligomicina: adicionar 630 μL de mídia montada ao tubo para fazer estoque de 100 μM. Em seguida, diluir a 45 μM com mídia para obter concentração portuária (concentração de poçofinal após injeção será de 4,5 μM)
- FCCP: adicionar 720 μL de mídia montada ao tubo para fazer 100 μM estoque. Diluir a 10 μM com meios de comunicação para obter concentração portuária (concentração de poçofinal será de 1 μM)
NOTA:BSA e / ou FBS não deve ser adicionado à mídia, pois isso pode afetar a ação dos desacopladores mitocondriais14. - Rotenone/AA: adicione 540 μL de mídia montada ao tubo para fazer 50 μM estoque. Diluir a 25 μM com meios de comunicação para obter concentração portuária (concentração de poçofinal será de 2,5 μM)
NOTA:As concentrações acima produziram resultados consistentes em nossas mãos. Fccp adicional não levou a nenhum aumento adicional na respiração. No entanto, as concentrações de drogas podem precisar ser ajustadas dependendo do tamanho das ilhotas, e especialmente com ilhotas de diferentes espécies ou esferóides não ilhotas. Para referência, o diâmetro médio de uma ilhota de primatas não-humanos é de cerca de 150 μm15.
- Abra o kit de teste de estresse(Tabela de Materiais)e retire o conteúdo. Compo o estoque e as soluções de trabalho para oligomicina, o cianeto carbonil-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) como segue.
- Preparação da placa esferóide e transferência de ilhotas
- Mão-pick ilhotas pancreáticas em um 60 mm x 15 mm prato de cultura celular contendo mídia montada para obter cerca de 100% de pureza.
NOTA:As ilhotas devem parecer arredondadas, com uma periferia claramente definida, e parecem mais densas do que contaminantes do tecido exocrino. Evite ilhotas que parecem danificadas ou desgastadas. Neste experimento, o tamanho das ilhotas não foi medido diretamente, embora tenhamos tentado escolher ilhotas de tamanho aproximadamente equivalente para cada poço e amostra. - Carregue cada poço de microplaca esferóide com 175 μL de mídia montada usando uma pipeta multicanal.
- Usando uma pipeta P20 definida para 15 μL, aspirar 15 ilhotas do prato de cultura celular. Ilhotas devem ser visíveis na ponta pipette a olho nu.
- Para transferir ilhotas para microplaca esferóide, ponta de pipeta inferior para o fundo do poço, mal levantar, e lentamente pipeta para fora um volume muito pequeno (~ 5 μL). Confirme que todas as ilhotas deixaram a ponta da pipeta. Cada poço deve receber 15 ilhotas. Ocasionalmente verificar microplaca esferóide o microscópio para verificar se as ilhotas estão na parte inferior de cada poço, em vez de preso aos lados.
NOTA:Evite carregar os poços de canto com ilhotas. O fluxo de oxigênio e pH para fora do plástico pode ocorrer durante o ensaio, e isso é exacerbado nos quatro poços de canto. - Uma vez que todas as ilhotas foram transferidas para a microplaca esferóide, incubam a microplaca em uma incubadora de 37 °C, não CO2, completando os degraus abaixo.
- Mão-pick ilhotas pancreáticas em um 60 mm x 15 mm prato de cultura celular contendo mídia montada para obter cerca de 100% de pureza.
- Carregando o cartucho do sensor e executando o ensaio
- Retire o cartucho do sensor da incubadora. Os portos A-C para cada poço devem ser carregados com drogas ou meios de comunicação. Poços contendo ilhotas e os quatro poços de canto devem ser carregados com drogas. Poços não-canto sem ilhotas devem ser carregados com mídia. Port D pode ser deixado vazio. Carregar a porta A (canto superior esquerdo de cada sensor) com 20 μL de oligomicina ou mídia. Carregar porta B (canto superior direito) com 22 μL de FCCP ou mídia. Carregar porta C (canto inferior esquerdo) com 25 μL de Rotenone/ AA ou mídia.
- Programe um ensaio extracelular do analisador do fluxo para um período de respiração da linha de base de 30 minutos (5 ciclos da mistura de 3 minutos, medida de 3 minutos), período de medição do oligomycin de 42 minutos (7 ciclos da mistura de 3 minutos, medida de 3 minutos), 3 minutos
- Executar o ensaio e siga as instruções na tela para calibrar o sensor e inserir o microplaca.
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Representative Results
Para carregar ilhotas em microplaca, 15 ilhotas devem ser aspiradas em 15 μL de mídia, como mostrado na Figura 1A. As ilhotas estabelecer-se-ão naturalmente para a parte inferior da ponta do pipet dentro de alguns segundos. Em seguida, a ponta do tubo é abaixada para o fundo do poço. A ponta é muito ligeiramente levantada, e um pequeno volume (cerca de 5 μL) é canalizado para fora junto com as ilhotas. Esta técnica resulta em colocação consistente de ilhota na parte inferior do poço microplaqueta(Figura 1B)permitindo medições precisas de consumo de oxigênio.
A figura 2 mostra resultados representativos por indivíduo bem para o consumo de oxigênio em todo o ensaio. Esta experiência particular demonstra o que pode acontecer quando os poços são carregados mal, com muitas ilhotas furadas acima nos lados do poço um pouco do que na parte inferior do poço. Isso pode ser causado por pipetting mídia demais para o poço depois que as ilhotas já foram canalizadas para fora da ponta. O fluxo de meios de comunicação adicionais empurra as ilhotas para fora do fundo do poço. Quando isso acontece, o nível de base do consumo de oxigênio será muito baixo, e este bem vai mostrar pouca ou nenhuma resposta à FCCP. A linha ousada na Figura 2 demonstra esse fenômeno.
A figura 3 mostra uma experiência diferente em que a maioria de poços mostraram a respiração e a resposta significativas da linha de base às drogas. No entanto, dois poços (com linhas ousadas) não mostraram resposta a rotenone/AA. Isso sugere que a droga não foi devidamente liberada no poço. Neste caso, como em casos de não consumo de oxigênio basal, esses poços podem ser excluídos de uma análise mais aprofundada.
A figura 4 mostra os resultados de um ensaio bem sucedido. Aqui mostramos um exemplo de dados sumários de um experimento separado em que os poços foram devidamente carregados com ilhotas e injetados corretamente com drogas. O consumo de oxigênio mitocondrial dependente da ATP foi efetivamente inibido pela oligomicina, a respiração máxima bem acima dos níveis basais foi induzida pela FCCP, e a respiração mitocondrial foi completamente encerrada abaixo dos níveis de oligomicina pela inibição da cadeia de transporte de elétrons com rotenone/AA.
Figura 1: Técnica de tubulação para carregar ilhotas em microplaca. (A) Aproximadamente 15 ilhotas (seta vermelha) canalizadas com 15 μL de mídia. (B) Ilhotas centradas na parte inferior da microplaca esferóide. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Variabilidade bem-a-bem devido à diferença no carregamento de ilhotas. Poços carregados indevidamente (linha azul ousada) mostram pouco ou nenhum consumo de oxigênio basal e resposta mínima aos medicamentos de teste de estresse celular. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Falha da injeção da droga. Dois poços (linhas azuis ousadas) não foram injetados com rotenone/AA e não mostram nenhuma diminuição significativa no consumo de oxigênio. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Dados médios em todos os poços em um experimento após a exclusão de poços mal carregados ou injetados. Consumo médio de oxigênio durante todo o ensaio de teste de estresse celular em um experimento separado, incluindo 16 réplicas técnicas. Barras de erro mostram desvio padrão para n = 16 poços. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O estudo do consumo de oxigênio de ilhotas já foi dificultado pela forma esférica das ilhotas, sua falta de adesão às superfícies culturais e o número de ilhotas exigidas por poço. Neste protocolo, destacamos a eficácia da microplaca esferóide de 96 poços para medir o consumo de oxigênio de ilhotas em um pequeno número de ilhotas e demonstramos uma técnica de manuseio e carregamento de ilhotas que é tecnicamente viável e produz consistente Resultados.
Para que as ilhotas aderem ao fundo da microplaca e não sejam perturbadas durante a mistura de etapas durante todo o ensaio, o microplate de 96 poços é revestido com uma solução adesiva da pilha o dia antes do ensaio. Quando isto for geralmente benéfico, se as ilhotas não são carregadas corretamente são responsáveis furar ao lado do poço um pouco do que a parte inferior, assim afetando ou impedindo a medida exata. Para combater isso, recomendamos poços de revestimento com um volume muito pequeno de solução adesiva apenas 20 μL. Além disso, a técnica de tubulação que demonstramos garante que as ilhotas são carregadas para o fundo do poço e não empurrado para cima os lados pelo fluxo de mídia adicional .
A microplaca esferóide de 96 poços superou limitações anteriores do consumo de oxigênio de ilhota de medição, incluindo o alto número de ilhotas necessárias e o número de condições que podem ser testadas simultaneamente. De fato, um estudo recente10 demonstrou o uso deste sistema com uma única ilhota humana por poço. No entanto, a medição do consumo de oxigênio usando ilhotas únicas resultou em medições basais muito baixas do consumo de oxigênio, que foram significativamente acima do fundo apenas nas maiores ilhotas (diâmetro acima de 290 μm). As ilhotas de NHP tendem a ser menores do que ilhotas humanas, com um diâmetro médio de somente 150 μm15. Em nossas mãos, 15 ilhotas de NHP por poço apresentaram maior linha de base e um perfil mais responsivo durante o teste de estresse celular do que menos ilhotas. Também testamos cinco e dez ilhotas por poço, mas descobrimos que o consumo de oxigênio basal e o sinal de ruído foram significativamente reduzidos.
Além da capacidade de usar um baixo número de ilhotas por poço, a microplaca de 96 poços permite o teste de várias condições diferentes ao mesmo tempo. Isto é benéfico nos casos em que as ilhotas são tratadas com compostos diferentes ou geneticamente manipulados. No entanto, ao comparar grupos de ilhotas primatas humanos ou não humanos provenientes de diferentes fontes (por exemplo, diabéticos versus ilhotas não diabéticas), as amostras são frequentemente recebidas em dias diferentes. Assim, nestes casos, não é possível tirar o máximo proveito deste sistema.
A fim de quantificar vários aspectos do consumo de oxigênio mitocondrial, manipulamos diferentes aspectos da respiração farmacologicamente. As concentrações de drogas utilizadas foram baseadas em um estudo permeado em ilhotas humanas10. A dose de FCCP foi otimizada para induzir a respiração mitocondrial máxima em nossas mãos. Especificamente, a concentração de oligomicina foi de 4,5 μM, a FCCP foi de 1 μM e a rotenone/AA foi de 2,5 μM. No entanto, essas concentrações provavelmente precisam ser calibradas para diferentes aplicações deste protocolo.
Os dados produzidos podem ser analisados diretamente ou normalizados usando uma série de métodos. Neste experimento, foram utilizados números iguais de ilhotas de tamanhos semelhantes para cada amostra, e os dados não foram normalizados pelo número de células ou pelo tamanho das ilhotas, o que pode ser difícil de quantificar diretamente. Um método alternativo de normalização é por proteína celular total, que envolve a lisagem das células após o ensaio é realizado e quantificar os níveis de proteína. Os dados também podem ser normalizados para níveis de respiração basal. Isso pode ser informativo em certos casos, como a quantificação da capacidade de reserva como uma porcentagem dos níveis basais. No entanto, com esses métodos de normalização e outros, as informações podem ser perdidas durante a normalização, conforme descrito anteriormente16.
O sistema descrito aqui fornece uma ferramenta única para entender melhor a fisiologia das ilhotas. De fato, a importância do consumo de oxigênio na saúde das ilhotas é ilustrada pela observação de que as taxas de consumo de oxigênio de ilhotas estão intimamente ligadas à saúde das ilhotas e à probabilidade de transplante de ilhotas bem-sucedida17. Este sistema fornece uma excelente plataforma para quantificação consistente do consumo de oxigênio ilhota que pode, em teoria, também ser aplicada a quaisquer esferóides cultivados de tamanho semelhante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o Vanderbilt High Throughput Screening Core para o uso de suas instalações, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) para isolamentos de ilhotas de primatas não humanos, e Eric Donahue (Vanderbilt University) para assistência com a Figura 1. J.M.E. foi apoiado pela NIGMS dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmios T32GM0007347. M.G. foi apoiado pelo NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e pelo Departamento de Assuntos de Veteranos (BX003744).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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