Summary
Bu protokol, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sırasında embriyonik zebra balığında makrofaj davranışını ve ölümü görselleştirmek için bir tekniği açıklamaktadır. Bakterilerin hazırlanması, embriyoların enfeksiyonu ve intravital mikroskopi için adımlar dahildir. Bu teknik, enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücresel davranış ve ölüm gözlem uygulanabilir.
Abstract
Zebrabalığı, şeffaf doğası ve erken gelişim sırasında sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemine güvenilmesi nedeniyle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışını incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)enfeksiyon modeli mikobakteriyel enfeksiyona karşı konak bağışıklık yanıtı çalışmada iyi kurulmuştur. Farklı makrofaj hücre ölüm türlerinin mikobakteriyel enfeksiyonun çeşitli sonuçlarına yol açacağı ileri sürülmüştür. Burada M. marinum enfeksiyonu sonrası zebra balığı embriyolarında makrofaj hücre ölümünü gözlemlemek için intravital mikroskopi kullanılarak yapılan bir protokolü açıklıyoruz. Özellikle makrofajlar ve nötrofiller etiket zebra balığı transgenik çizgiler orta beyin veya gövde de floresan M. marinum etiketli intramüsküler mikroenjeksiyon yoluyla enfekte. Enfekte zebra balığı embriyoları daha sonra düşük eriyen agarose üzerine monte edilir ve X-Y-Z-T boyutlarında konfokal mikroskopi ile gözlenir. Uzun süreli canlı görüntüleme fotobeyazrlama ve fototoksisite önlemek için düşük lazer gücü kullanarak gerektirir çünkü, güçlü bir transgenik ifade şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol, immün hücre göçü, konak patojen etkileşimi ve hücre ölümü de dahil olmak üzere in vivo dinamik süreçlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır.
Introduction
Mikobakteriyel enfeksiyon konak bağışıklık hücresi ölümüne neden olduğu gösterilmiştir1. Örneğin, zayıflatılmış bir suş makrofajlarda apoptosis tetikler ve enfeksiyon içerir. Ancak, öldürücü bir suş litik hücre ölümü tetikleyecek, bakteriyel yayılmasına neden1,2. Bu farklı hücre ölümü türlerinin konak anti-mikobakteriyel yanıt üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, in vivo mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün ayrıntılı bir gözlemine ihtiyaç vardır.
Hücre ölümünü ölçmek için geleneksel yöntemler ölü hücre lekeleri kullanmak için, Annnexin V gibi, TUNEL, veya acridine turuncu / propidium iyodür boyama3,4,5. Ancak, bu yöntemler in vivo hücre ölümü dinamik sürecine ışık tutmak mümkün değildir. Hücre ölümünün in vitro gözlemi zaten canlı görüntüleme6ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, sonuçların fizyolojik koşulları doğru bir şekilde taklit edip etmediği belirsizliğini koruyor.
Zebra balığı konak anti-micobacterium yanıtları incelemek için mükemmel bir model olmuştur. Bu insanların benzer bir son derece korunmuş bağışıklık sistemi vardır, kolayca manipüle genom, ve erken embriyolar şeffaf, hangi canlı görüntüleme sağlar7,8,9. M. marinum enfeksiyonu ndan sonra, yetişkin zebra balıkları tipik olgun granülom yapıları oluşturur, ve embriyonik zebrabalık yapıları gibi erken granülom formu9,10. Doğuştan gelen bağışıklık hücre-bakteri etkileşiminin dinamik süreci daha önce zebra balığı M. marinum enfeksiyonu modeli11,12araştırılmıştır. Ancak, yüksek mekansal-zamansal çözünürlük gereksinimi nedeniyle, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin ölümü çevreleyen ayrıntılar büyük ölçüde tanımsız kalır.
Burada in vivo mikobakteriyel enfeksiyonun tetiklediği makrofaj litik hücre ölümü sürecini nasıl görselleştirebileceğimizi anlatıyoruz. Bu protokol aynı zamanda geliştirme ve inflamasyon sırasında in vivo hücresel davranışı görselleştirmek için de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balıkları, hayvan refahının etik olarak gözden geçirilmesi için laboratuvar hayvanı yönergelerine uygun olarak standart koşullar altında yetiştirilmiştir (GB/T 35823-2018). Bu çalışmadaki tüm zebra balığı deneyleri onaylandı (2019-A016-01) ve Fudan Üniversitesi Şangay Halk Sağlığı Klinik Merkezi'nde gerçekleştirildi.
1. M. marinum Tek Hücreli Inokül Hazırlama (Şekil 1)
- -80 °C'den gelen eritme Cerulean-floresan M. marinum gliserol stokve % 10 (v /v) OADC, %0.25 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile 7H10 agar plakayı inoküle edin. Plakayı yaklaşık 10 gün boyunca 32 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Pozitif floresans ifade eden bir koloni seçin ve % 10 OADC, %0.5 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile 7H9 orta 3 mL aşılamak.
- Kültür logaritmik faza ulaşana kadar (OD600 = 0.6-1.0) dakikada 32 °C ve dakikada 100 devir (rpm) aşıkuluçka.
- Subkültür (1:100) 30 mL taze 7H9 orta% 10 OADC, 0.5% gliserol, 0.05% Tween-80 ve 50 μg/mL kadar OD600 ~ 1.0 ulaşır.
NOT: En yüksek kültür kalitesi için bu noktada bir alt kültür adımı önerilir. Deneyimlerimize göre, klonu doğrudan büyük bir ortam hacmine eklemek bakteriyel kümelerin oluşmasına yol açacaktır.
- Aşağıda açıklandığı gibi M. marinum hücrelerini toplayın.
- Bir pelet olarak M. marinum toplamak için 10 dakika için 3.000 x g santrifüj. Supernatant'ın 300 μL'si hariç hepsini atın ve peleti yeniden susumak için kullanın.
- Pelet daha fazla askıya almak için% 10 gliserol ile 7H9 orta 3 mL ekleyin, sonra 100 W bir su banyosunda süspansiyon sonicate 15 s ON, 15 toplam 2 dakika OFF.
NOT: Sonication amacı inokül için tek bir hücre homojen elde etmektir, hangi mikroenjeksiyon iğnetıkanıklığı önleyecektir.
- Bakteriyel süspansiyonu 10 mL şırıngaya aktarın, ardından bakteri kümelerini temizlemek için 5 m'lik bir filtreden geçirin.
- Süspansiyonun optik yoğunluğunu (OD) bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve %10 gliserol içeren 7H9 ortamla OD600 = 1.0'a seyreltin. Süspansiyonu 10°L'lik dereceye bölün ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'lik dondurucuda saklayın.
- OADC'nin %10'u (v/v) içeren 7H10 agar plakasında, gliserol %0.5'i ve higromisinin 50 g/mL'si içeren bakteri stokunun seri seyreltme ve kaplama ile inokülün (cfu/mL) bakteri konsantrasyonunun doğrula.
2. Zebrabalığı Embriyo Hazırlama
- Yumurtlamadan bir gün önce üreme odasında zebra balığı üreme çiftleri kurduk.
NOT: Her üreme odasına sadece bir çift ekleyin. - 1 saat sonrası döllenme (hpf) içinde ertesi sabah embriyoları toplamak. Embriyoları damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın ve 100 embriyoyu 30 mL E3 orta içeren 100 mm Petri kabına aktarın. 28.5 °C'de kuluçka ya.
- 12 saat sonra, bir mikroskop altında gözlemlemek ve döllenmemiş veya hasarlı yumurta atın.
- 24 hpf'de, pigment gelişimini önlemek için ortamı N-phenylthiourea (PTU, 0.2 nM son konsantrasyonu) ile taze E3 ortamına çevirin. Embriyolar mikroenjeksiyon alanına kadar 28.5 °C'de embriyoları kuluçkaya yatırın.
3. Bakteriyel Mikroenjeksiyon ile Enfeksiyon
- Daha önce referans13açıklandığı gibi borosilikat cam mikrocapiller enjeksiyon iğneleri hazırlayın.
- Zebra balığı embriyoları enfeksiyon için montaj
- Mikrodalga 100 mL% 1 (w / v) ve 100 mL 0.5% (w / v) düşük erime agarose bir otoklavlı E3 ortamda agarose tamamen eriyene kadar. 1 mL aliquot tüplere bölün ve ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın.
- Kullanmadan önce agarose'u 95 °C'lik bir ısıtma bloğunda tamamen eriyene kadar ısıtın. Agarose'u 45 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirerek sıvı halde muhafaza edin (Şekil 2).
- Gövde bölgesinde kas içi enfeksiyon için montaj
- 0,5 mL%1 (w/v) agarose'u cam bir kaydıra eşit olarak dökerek alt agarose tabakasını oluşturun. Katılaşmak için 3 dakika boyunca bir buz kutusu veya soğuk yüzeye yerleştirin.
- Zebra balığı embriyolarını (48-72 hpf) yumurta suyunda tricaine (200 μg/mL) ve PTU'yu montajdan önce 5 dakika süreyle anestezi edin. Alt agarose tabakasına 60 zebra balığı embriyosu yerleştirin ve bunları dikkatlice iki sıra halinde yerleştirin(Şekil 2B).
- Üst tabaka oluşturmak için 0.3 mL% 0.5 (w / v) agarose eklemeden önce doku kağıt ile alt agarose tabakası üzerinde kalan su çıkarın. Embriyoların agarose'a tamamen gömülü olduğundan emin olun. Agarose katılaşmak ve dehidratasyon önlemek için tekrar buz kutusuna cam slayt dönün.
- Ekstra E3 yumurta suyu ile yüzeyi kaplayarak agarose üst tabakası nemli tutun.
- Orta beyin enfeksiyonu için montaj
- Tek bir konkavite cam mikroskopi slaytının oluğunu %1 (w/v) agarose ile kaplayın ve sonra 4-6 triain-anestezili embriyoları agarose'a aktarın.
- Her embriyonun başını 10 G iğneyle dikkatlice yukarı doğru yerleştirin(Şekil 2C).
- Tüm embriyoların pozisyonları sabit olduktan sonra, agarose katılaşmak için bir buz kutusu veya soğuk yüzey için cam slayt aktarın.
NOT: Embriyolar ile yumurta suyu transferi hacmini en aza indirerek düşük erime agarose seyreltme kaçının.
- Enfeksiyon için bakteri hazırlığı
- 1 μL steril filtrelenmiş fenol kırmızısını (10x) 10 μL'lik bakteriyel stoka ekleyin (adım 1'de üretilir) ve kısa bir süre girdap yaparak karıştırın.
NOT: Son konsantrasyon steril PBS kullanılarak ayarlanabilir. - 10 s ON 100 W kullanarak hazırlık Sonicate,14oluşmuş olabilir herhangi bir kümeleri kırmak için 1 dk için 10 s OFF .
- 1 μL steril filtrelenmiş fenol kırmızısını (10x) 10 μL'lik bakteriyel stoka ekleyin (adım 1'de üretilir) ve kısa bir süre girdap yaparak karıştırın.
- Mikroenjeksiyon ile enfeksiyon
- Mikroenjektör ve mikromanipülörü daha önce13olarak bildirilen mikroenjeksiyon için uygun konuma ve ayarına ayarlayın.
- Hazırlanan iğneye mikro yükleyici kullanarak bakteri preparatının 3 μL'sini aktarın (bkz. adım 3.1). Pipet yavaş ve dikkatli hava kabarcıkları oluşturan önlemek için.
- Gövde bölgesi enfeksiyonu için gövde bölgesine 100 cfu enjekte edin (Şekil 3A). Notochord içine bakteri enjekte kaçının.
NOT: Enjeksiyon için cfu formülü cfu = bakteriyel stok konsantrasyonu x seyreltme faktörü x enjeksiyon damlacık hacmi ile tahmin edilmektedir. Gerçek cfu oadc% 10 (v / v) içeren bir 7H10 agar plaka üzerinde bakteriyel inokül bir damla kaplama ile doğrulanır, gliserol% 0.5, ve higromisin 50 g/mL. - Orta beyin enfeksiyonu için, orta beyin bölgesine yaklaşık 500 cfu enjekte edin (Şekil 3B).
- Mikroenjeksiyondan sonra zebra balığı embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice yıkayın.
NOT: Embriyoları cam alt çanağa monte edin ve çok erken gelen bağışıklık hücresi yanıtının gözlemini kapsayacak şekilde mümkün olan en kısa sürede.
4. Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi
- Canlı görüntüleme için balık montajı
- 10 triaine anestezili embriyoyu cam dip35 mm'lik bir kabın ortasına aktarın. Ekstra E3 ortamı atın.
- Çanak% 1 düşük erime noktası agarose ile çanak kapak ve dikkatle 10 G iğne kullanarak zebrabalığı embriyoları yönlendirmek. Agarose katılaşmak için 10 s buz üzerinde cam alt çanak kuluçka.
NOT: Orta beyin enjeksiyonu için embriyolar baş yukarı doğru yönlendirilmiş agarose monte edilmelidir(Şekil 4A). Gövde bölgesi intramüsküler enfeksiyon için embriyolar agarose'a yanal monte edilmelidir (Şekil 4B). - Bir kez tamamen katılaşmış, yumurta suyu bir tabaka (artı 1 x tricaine ve PTU) ile agarose kapağı.
- Üç renkli yüksek çözünürlüklü zamanlı zamanlı konfokal mikroskopi
NOT: Aşağıdaki adımlar 63.0x 1.40 yağ UV objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskopi ile çalıştırılır.- Çevre odasının sıcaklığını 28,5 °C olarak ayarlayın. Nem sağlamak ve yumurta suyunun buharlaşmasını önlemek için odanın içine ıslak mendil kağıdı yerleştirin(Ek Şekil 1).
- 35 mm'lik cam alt kabı zebra balığıyla çevre odasına yerleştirin.
- Konfokal yazılımı açın ve sahneyi açın. 63.0 x 1.40 yağ UV hedefine geçin ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) filtreile parlak alan kanalını kullanarak zebra balığını bulun.
- Açık 405 Diyot, Argon (%20 güç), ve DPSS 561 nm lazer. Uygun lazer güç ve spektrum ayarlarını ayarlayın.
NOT: Cerulean (uyarma = 405 nm; emisyon = ~456-499 nm), eGFP (uyarma = 488 nm; emisyon = ~500-550 nm), DsRed2 (excitation = 561 nm; emisyon = ~575-645 nm)(Ek Şekil 2B)için spektrum ayarları aşağıdaverilmiştir. - "XYZ" "Sıralı Tetkik" satın alma modunu seçin ve görüntü biçimini "512 x 512 piksel" olarak ayarlayın (Ek Şekil 2A).
- "Canlı Veri Modu" na geçin. İlk zebra balığının konumunu hedefleyin ve "Begin" ve "End" Z pozisyonunu işaretleyin. Kalan embriyoların her biri için bu işlemi tekrarlayın. Programın sonuna "Duraklatma" eklenebilir (Ek Şekil 2C).
- Programın döngüsünü ve döngüsünü tanımlayın.
- Dosyayı kaydedin.
5. Apoptosis ve Canlı Görüntüleme Induce Tek Hücreli UV Işınlama
- 4.1. adımda açıklandığı gibi balık dağı.
- 3 gün sonrası döllenme (dpf) makrofaj spesifik transgenik Tg(mfap4-eGFP) embriyo15 orta beyin bölgesinin görüntülenmesi
- Tek bir floresan etiketli makrofajın ilgi bölgesini seçin ve 50 s için 400 Hz hızda ve %6 UV lazer gücüyle tarar.
NOT: Tarama hızı ve zamanı tek tek mikroskoba göre optimize edilmelidir. Tarama süresi daha sonra hedef hücre apoptosis neden olacak geniş DNA hasarına neden olacak optimize edilmelidir, ancak tüm hücre photobleach değil. - Daha fazla hedef hücreışına ışınlamak için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
- Bölüm 4'te açıklandığı gibi orta beyin bölgesinin zaman atlamalı görüntülemesini yapın.
6. Görüntü İşleme
- Edinilen görüntüler için "Maksimum Projeksiyon" gerçekleştirin.
- "Maksimum Projeksiyon" görünümü altında hedef hücrelerin XY konumunu ve zamanını bulun ve işaretleyin.
- Hedef hücrelerin Z konumunu bulmak ve işaretlemek için standart görünüme geri dön.
- Hedef hücrelerin tek katmanlı görüntüsünü kırpma.
- Bindirme kanalını ve parlak alanı video olarak AVI formatında dışa aktarın.
- ImageJ'deki bindirme kanalının ve parlak alanın ilgi alanını kırPın.
- Son adımda iki videoyu dikey olarak birleştirin ve ImageJ'de bir AVI formatında video olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mycobacterium enfeksiyonu enfeksiyon yollarına göre farklı konak yanıtları tetikleyebilir. Bu protokolde zebra balığı embriyoları orta beyne veya gövdeye floresan etiketli bakterilerin intramüsküler mikroenjeksiyonuileenfekte olmuş ve konfokal canlı görüntüleme ile gözlenmiştir. Bu iki yol üzerinden enfeksiyon yerel doğuştan gelen bağışıklık hücresi işe ve sonraki hücre ölümüne neden enfeksiyon kısıtlar.
Doğuştan gelen bağışıklık hücresi ölümünün ayrıntılarını görselleştirmek zordur. Litik hücre ölümü çok kısa bir süre içinde meydana gelir ve gözlemlemek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi gerektirir. Ayrıca, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin yüksek hareketlilik onları gözlem alanı dışına göç sağlar. Bu protokolde, birden fazla embriyoya paralel olarak gözlemleyerek bu sorunu çözüyoruz. Bir dizi zebra balığı embriyosu enfeksiyon için tek bir cam mikroskop kaydıraja monte edilebilir ve canlı görüntüleme için aynı 35 mm cam alt tabağa 10 embriyo monte edilebilir(Şekil 4). Konfokal mikroskopinin canlı veri modelinden yararlanılarak aynı anda birden fazla embriyo görülebilir. Bu canlı görüntüleme verimliliğini artırır ve büyük ölçüde tüm litik hücre ölüm sürecini yakalama olasılığını artırır.
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi mikobakteriyel enfeksiyona karşı ilk savunma hattıdır ve iki temel bileşen makrofaj ve nötrofildir. Burada daha önce bildirilen Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) ve Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) in vivo16, 17,18makrofajları ve nötrofilleri ayırt etmek için kullanıyoruz. Bir makrofaj ağır bakteri ile tıkanmış yuvarlak oldu ve azaltılmış hareketlilik görüntülenen, nihai sitoplazmik şişme ile, hücre zarının yırtılması, ve sitoplazmik içeriğin hızlı yayılması. Bu olaylar daha önce bildirildiği gibi litik hücre ölümünün tipik morfolojik değişimleridir (Şekil 5A)16. UV ışınlama zebrabalığı apoptosis geçmesi için hücreleri tetiklemek için kullanılmıştır20,21. Bu kavram la tutarlı olarak, UV ışınlanmış makrofajlar hücre büzülmesi, nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması gibi tipik apoptotik hücre fenotipleri gösterdi (Şekil 5B)22,23. Cerulean-floresan M. marinumkullanımı ile birlikte19, makrofaj arasındaki etkileşimin üç renkli canlı görüntüleme, nötrofil, ve M. marinum in vivo elde edildi. Ayrıca makrofajların aktif olarak fagosittoz ve M. marinum yayabileceğini gözlemledik (Ek Şekil 3A). Ancak nötrofillerin fagositik yeteneği sınırlıdır ve belirgin bakteriyel tıkanmadan hızlı bir şekilde litik hücre ölümü geçirmiştir (Ek Şekil 3B). Nötrofiller, Cerulean-floresan ifade etmez sadece birkaç ölü M. marinum fagositoz tarafından tetiklenebilir, ya da sadece sınırlı ölü hücre enkaz fagositoz tarafından.
Şekil 1: Tek hücreli bakteri hazırlığının şematik diyagramı. Açıklanan işlemin ardından tek hücreli Cerulean-floresan M. marinum stokları üretildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroenjeksiyon için monte zebra balığı embriyo diyagramı. (A) Montaj işleminin şematik diyagramı. (B) Zebra balığı embriyoları gövde bölgesinin enfeksiyonu için yanal olarak monte edildi. (C) Zebra balığı embriyoları kafalarını yukarı doğru orta beyin enfeksiyonu için yönlendirilen monte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikroenjeksiyon için konumlandırma. (A) Kırmızı ok gövde bölgesienfeksiyon için enjeksiyon bölgesigösterir. (B) Kırmızı ok, orta beyin enfeksiyonu için enjeksiyon bölgesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Canlı görüntüleme için zebra balığı embriyolarının montajı. (A) Orta beyin enfeksiyonu için, zebra balığı embriyoları başları aşağıya doğru yönlendirilmiş olarak monte edildi. (B) Gövde bölgesi enfeksiyonu için zebra balığı embriyoları, cam alt kabın dibine yakın enjeksiyon bölgesi ile yanal olarak monte edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: M. marinum enfeksiyonunda tipik morfolojik değişiklikler makrofaj litik hücre ölümüne ve UV kaynaklı makrofaj apoptosise neden oldu. (A) Bir makrofaj (Mac) bir kez ağır M. marinumile tıkanmış bir litik hücre ölümü geçiren zaman atlamalı görüntüleme . 3 dpf Tg orta beyin (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebra balığı embriyomikroenjeksiyon yoluyla Cerulean-floresan M. marinum (~ 500 cfu) tarafından enfekte. Hem bindirme kanalı (üst panel) hem de DIC kanalı (alt panel) için görüntüler sağlanır. T 00:00 5 saat 20 dk sonrası enfeksiyondur. Beyaz kesik çizgiler = hücre zarının anahattı; siyah kesik çizgiler = şişme sitoplazma; siyah oklar = yırtılmış hücre zarı; kırmızı kesik çizgiler = hızla sitoplazmik içeriği kaybetti. (B) UV ışınlanmış makrofajın zaman atlamalı görüntülemesi. 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) orta beyin bölgesinde bir GFP + hücre UV tarafından ışınlanır ve zaman atlamalı görüntüleme takip. Beyaz kesik çizgiler = hücre zarının anahattı; siyah oklar = nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması. Ölçek çubuğu = 15 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Canlı görüntüleme için çevre odası kuruldu. (A) Sıcaklığı 28,5 °C'de tutacak dijital kumandayı ayarlayın. (B) Nem sağlamak ve yumurta suyunun buharlaşmasını önlemek için odanın içine ıslak mendiller ayarlayın. (C) Odanın kapağını kapatın ve canlı görüntülemeye başlamadan önce sıcaklık stabilizasyonu için en az 30 dakika bekleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Canlı görüntüleme için konfokal panel ayarı. (A) Satın alma paneli ayarının gösterimi. (B) Lazer gücü ve spektrum ayarlarının temsili. (C) Canlı veri modunda birden çok işin ve döngü ayarının gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Makrofajlar enfeksiyon asar ve nötrofiller M. marinum enfeksiyonu sonrası litik hücre ölümü ile geçerler. (A) Makrofaj 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebra balığı embriyosu Cerulean-floresan M. marinum (~ 100 cfu) tarafından enfekte gövdesinde M. marinum yayan. (B) Nötrofil (Neu) 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebrabalığı embriyosu cerulean-floresan M. marinum (~ 100 cfu) mikroenjeksiyon yoluyla enfekte gövde bölgesinde bariz M. marinum yüklü olmadan litik hücre ölümü geçiren. Yeşil renk LRLG atanır ve kırmızı renk litik hücre ölüm sürecinin daha iyi görselleştirilmesi için eGFP atanır. Siyan'daki oklar hedef hücreleri gösterir. Kırmızı daki oklar, bir sonraki karede sitoplazma içeriğini serbest bırakmak üzere olan hücreleri işaret eder. Yeşiloklar, sitoplazma içeriğini yeni kaybetmiş ölü hücreleri işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: M. marinum ile ağır yüklü bir makrofaj Şekil 5Aile ilgili litik hücre ölümü uğrar. Hızlandırılmış görüntüleme (63x hedef) 9 dakika ve saniyede 3 kare (fps) bir 3 dpf Tg orta beyin bölgesi (fps) için 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebra balığı embriyoCerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Video 2: Bir makrofaj, Şekil 5Bile ilgili UV ışınlama dan sonra apoptoz dan geçer. 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) zebra balığı embriyosu orta beyin bölgesinin 6 fps'sinde 74 dk'lık hızlandırılmış görüntüleme (63x hedefi). Embriyoların orta beyin bölgesinde bir GFP + hücre UV tarafından ışınlanır ve zaman atlamalı görüntüleme takip. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Video 3: Bir makrofaj M. marinumyayılır, Ek Şekil 3A ile ilgili. Hızlandırılmış görüntüleme (63x objektif) 2 dpf Tg gövde bölgesinin 3 fps de 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebra balığı embriyoCerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Video 4: Bir nötrofil belirgin M. marinum engorgement olmadan litik hücre ölümü uğrar, Ek Şekil 3B ile ilgili. Hızlandırılmış görüntüleme (63x hedef) 7 dk 30 s gövde bölgesinin gövde bölgesinin 3 fps 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebra balığı embriyocerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj ölüm görselleştirme açıklar. Hücre zarının bütünlüğü gibi faktörlere bağlı olarak, enfeksiyon apoptosis ve litik hücre ölümü24,25ayrılabilir. Litik hücre ölümü apoptoz daha organizma için daha stresli, güçlü bir inflamatuar yanıt tetikler çünkü 24,25. Yüksek mekansal-temporal çözünürlük, uygun konfokal mikroskopi ayarları ve güçlü transgenik ifade gereksinimi nedeniyle in vivo litik hücre ölümünün gözlemlenmesi zordur.
Uygun mikroenjeksiyon birkaç kritik adım gerektirir. Bakteri stok iyice enjeksiyondan önce tüm kümeleri kaldırmak için sonicated olmalıdır. Biz düşük erime agarose iki kat arasında bir cam slayt üzerine yerleştirerek mikroenjeksiyon için zebra balığı montaj geliştirdi. Agarose ikinci tabaka uygulandıktan sonra, slayt katılaşmahızlandırmak ve agarose dehidratasyon önlemek için bir buz kutusu veya soğuk yüzeye aktarılır. Embriyolar farklı slaytlar üzerine monte edilmesi gerekiyorsa, ekstra yumurta suyu ekleyerek agarose üst tabakası nemli tutmak için emin olun.
Canlı görüntüleme için hücre ölümünün ayrıntılarını gözlemlemek için yüksek çözünürlüklü objektif bir lens gereklidir. Bu gereksinime her zaman kısa çalışma mesafesi eşlik eder ve bu nedenle enfeksiyon bölgesinin kapak slaytına yakın konumlandırılması gerekir. Uzun bir çalışma mesafesi su lensi derin doku görüntüleme için idealdir ve uygun embriyo montaj için daha fazla oda sağlayacaktır. Yüksek yoğunluklu bir lazer kullanarak genişletilmiş canlı görüntüleme doku hasarına veya embriyonun ölümüne neden olacaktır. Bu nedenle, fotobeyazrlama ve toksisite önlemek için mümkün olduğunca düşük lazer yoğunluğunu tutmak için çok önemlidir. Güçlü bir transgenik ifade düşük yoğunluklu bir lazer kullanarak gözlem kolaylaştırabilir. GFP ekspresyonu Tg(coro1a:eGFP) tg(mpeg1a:eGFP)daha güçlü olduğundan, bu çalışmada Tg(mpeg1:eGFP;lyz:DsRed2) yerine Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) kullandık. Konfokal makineye yakın mikroenjeksiyon için mobil iş istasyonu kurmak, hızlı yanıtları gözlemlemek için en iyisidir. Katılaşma süresini hızlandırmak için buz üzerinde düşük erime agarose soğutma da enjeksiyon ve canlı görüntüleme arasındaki süreyi azaltmaya yardımcı olabilir.
Bu protokolde makrofaj davranışını gözlemlemeye odaklanıyoruz. Ancak, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofil davranışı nın ayrıntılı çalışma da bilgilendirici olabilir. Örneğin, nötrofil ekstrasellüler tuzaklarının (NETs) hücre dışı mikobacterium'un öldürülmesinde nasıl rol aldığı büyük ölçüde tanımsız kalır. Bu protokolde tanımlanan görüntüleme tekniğinin histon protein etiketleme transgenik ile birleştirilmesi, in vivo'nun GÖRSELLEŞTİrİlMESİnE büyük ölçüde yardımcı olacaktır.
Şu anda, zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışını incelemek için çok sağlam bir sistem olarak kabul edilmektedir. Fagositoz ve hücre ölümünün istatistiksel verileri bu protokol kullanılarak elde edilebilir. Bugün mevcut olan güçlü gen düzenleme araçları ile birlikte, bu protokol vivo konak-patojen etkileşimi üzerinde çeşitli faktörlerin etkisini daha iyi anlamak için etkili bir platform sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz zebra balığı suşları paylaşımı için Dr Zilong Wen teşekkür, Dr Stefan Oehlers ve Dr David Tobin M. marinum ilgili kaynakları paylaşmak için, Yuepeng He şekil hazırlanmasında yardım için. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81801977) (B.Y.), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu Üstün Gençlik Eğitim Programı (2018YQ54) (B.Y.), Şangay Yelken Programı (18YF1420400) (B.Y.) ve Şangay Verem Anahtar Laboratuvarı Açık Fonu (2018KF02) (B.Y.Y.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T.
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z.
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
