Summary
Bröstkörteln är en dubbelskiktad struktur, bestående av yttre myoepiteloch inre luminala epitelceller. Presenteras är ett protokoll för att förbereda organoider med hjälp av differentiell trypsinization. Denna effektiva metod gör det möjligt för forskare att separat manipulera dessa två celltyper för att undersöka frågor om deras roller i bröstkörtel form och funktion.
Abstract
Organoider erbjuder självorganiserande, tredimensionella vävnadsstrukturer som sammanfattar fysiologiska processer i bekvämligheten av en maträtt. Murine bröstkörteln består av två distinkta epitelcellfack, som betjänar olika funktioner: den yttre, contractile myoepithelial facket och den inre, sekretoriska luminal fack. Här beskriver vi en metod genom vilken de celler som består av dessa avdelningar isoleras och sedan kombineras för att undersöka deras individuella härstamning bidrag till bröstkörtel morfogenes och differentiering. Metoden är enkel och effektiv och kräver inte sofistikeradseparationsteknik som fluorescensaktiverad cellsortering. Istället skördar vi och enzymatically smälta vävnaden, utsäde epitelet på vidhäftande vävnad kulturrätter, och sedan använda differentiell trypsinization att skilja myoepithelial från luminala celler med ~ 90% renhet. Cellerna pläteras sedan i en extracellulär matris där de organiserar sig i tvåskiktade, tredimensionella (3D) organoider som kan differentieras för att producera mjölk efter 10 dagar i kultur. För att testa effekterna av genetiska mutationer kan celler skördas från vilda typer eller genetiskt modifierade musmodeller, eller de kan manipuleras genetiskt före 3D-kultur. Denna teknik kan användas för att generera mosaik organoider som möjliggör undersökning av genfunktion specifikt i luminal eller myoepiteldel.
Introduction
Bröstkörteln (MG) är en trädliknande, rörformig epitelstruktur inbäddad i en adipocyte rik stroma. Det tvåskiktade segepitel består av ett yttre, basalt lager av kontraktien, myoepithelial celler (MyoECs) och ett inre lager av luminala, sekretoriska epitelceller (LECs), omger en central lumen1. Under amning när de yttre MyoECs kontrakt att pressa mjölk från den inre alveolar LECs, mg genomgår många förändringar som är under kontroll av tillväxtfaktorer (t.ex. EGF och FGF) och hormoner (t.ex. progesteron, insulin och prolaktin). Dessa förändringar orsakar differentiering av specialiserade strukturer, alveoli, som syntetiserar och utsöndrar mjölk under amning1. Den bröst epitel kan experimentellt manipuleras med hjälp av tekniker där antingen epitelvävnad fragment, celler, eller ens en enda basala cell transplanteras till värd bröst fett kuddar, precleared av endogena bröst parenkym, och får växa ut för att rekonstruera en hel, funktionell epitelträd2,3,4,5. Transplantation är en kraftfull teknik, men det är tidskrävande och omöjligt om en mutation resulterar i tidig embryonal dödlighet (före E14) som förhindrar räddning av transplanterbar bröstanlage. Dessutom vill utredarna ofta undersöka rollerna för de två olika avdelningarna, som härrör från härstamningsbegränsade stamceller. Medan Cre-lox-tekniken möjliggör differentiell genetisk manipulering av MyoECs och LECs, är detta också ett tidskrävande och dyrt företag. Således, sedan 1950-talet, utredare har använt in vitro däggdjur organoider som ett relativt enkelt och effektivt sätt att ta itu med frågor om bröstvävnad struktur och funktion6,7.
I tidiga protokoll som beskriver isolering och kultur av primära däggdjur epitelceller, fann utredarna att en källare membran matris (BME), bestående av en plasma propp och kyckling embryo extrakt, krävdes för MG fragment som odlas på en maträtt6. Under de följande decennierna, extracellulära matriser (ECMs, kollagen, och jellylike protein matris utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom celler) utvecklades för att underlätta 3D-kultur och bättre efterlikna in vivo miljö7,8,9,10. Kulerande celler i 3D-matriser avslöjas av flera kriterier (morfologi, genuttryck, och hormon lyhördhet) att en sådan mikromiljö bättre modeller in vivo fysiologiska processer9,10,11,12. Forskning med hjälp av primära murineceller identifierade viktiga tillväxtfaktorer och morggör som är nödvändiga för utökat underhåll och differentiering av organoider13. Dessa studier har satt grunden för det protokoll som presenteras här, och för kulturen av mänskliga bröstceller som 3D-organoider, som nu är ett modernt kliniskt verktyg, vilket möjliggör läkemedelsupptäckt och drogtester på patientprover14. Sammantaget belyser organoid odling självorganisering kapacitet primära celler och deras bidrag till morfogenes och differentiering.
Presenteras här är ett protokoll till kultur murine epithelia som kan differentieras till mjölkproducerande acini. En differentialtrypsinization-teknik används för att isolera de MyoECs och LECs som utgör de två distinkta MG-cellfacken. Dessa separerade cellfraktioner kan sedan manipuleras genetiskt till överexpress eller knockdown genfunktion. Eftersom härstamning-inneboende, egenorganisation är en medfödd egenskap av bröst epitelceller15,16,17, recombining dessa cell fraktioner tillåter forskare att generera tvåskiktade, mosaik organoider. Vi börjar med att enzymatically smälta fettvävnaden, och sedan inkubera bröstfragmentpå en vävnad kultur skålen för 24 h (Figur 1). Vävnadsfragmenten sätter sig på polystyrenrätter som tvåskiktade fragment med sin in vivo-organisation: yttre myoepiteliska skikt kring inre luminala lager. Denna cellulära organisation möjliggör isolering av de yttre MyoECs av trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min följt av en andra omgång trypsin-EDTA (0,05%) behandling som lossnar de återstående inre lysdioderna(figur 2). Således är dessa celltyper med olika trypsinkänslighet isolerade och kan därefter blandas och pläteras i ECM (figur 3). Cellerna genomgår självorganisering för att bilda tvåskiktade sfärer, bestående av ett yttre lager av MyoECs kring inre LYSOK. Lumen bildning uppstår som cellerna växer i ett medium som innehåller en cocktail av tillväxtfaktorer (se recept för Growth Medium)13. Efter 5 dagar kan organoider differentieras till mjölkproducerande acini genom att byta till Alveologenesis Medium (se recept och figur 3F) och inkuberas i ytterligare 5 dagar. Alternativt kommer organoider att fortsätta att expandera och förgrena sig i Growth Medium i minst 10 dagar. Organoider kan analyseras med hjälp av immunofluorescens (figur 3D-F) eller frigörs från ECM med hjälp av en återhämtningslösning (se innehållsförteckning)och analyseras via andra metoder (t.ex. immunoblot, RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Bröstkörtel rötning
- Förbered dig på att skörda mgs från mogna kvinnliga möss 10-14 veckors ålder.
- Utför skörden på en öppen bänk under aseptiska förhållanden.
- Sterilisera alla kirurgiska förnödenheter, kork styrelser, och stift genom autoklaving och blötläggning i 70% alkohol i 20 min före operation.
- Anestesiera djur med natriumpentobarbital (2X bedövningsdos på 0,06 mg/g kroppsvikt) som levereras via intraperitoneal injektion med en 0,5 ml insulinspruta.
- Övervaka nivån på anestesi genom att nypa djurets tår för att kontrollera om det finns ett reflexsvar och påbörja protokollet först efter att djuret är helt sövdt.
- Placera djuret på rygg, stift dess bihang till corkboard, och torka ner buken och bröstet med etanol.
- För att skörda #2, 3, 4 och 5 MGs från en mus (dvs. 8 MGs, Figur 1A), identifiera mittlinjen mellan de två bakbenen och göra ett litet snitt (1 cm) på buken huden med vass sax, sedan förlänga snittet upp till halsen18.
- Följ genom att göra små snitt i sidled mot ben och armar för att möjliggöra frisättning av huden med hjälp av en bomullspinne. Dra bort huden och sträck den tätt innan du sätter ner den på ena sidan(bild 1B, steg 1)18. Ta bort MGs genom att skära under dem, och ta bort lymfkörtlarna från #4 körtlar(figur 1B, steg 2, 3)18. Upprepa proceduren på andra sidan kroppen.
- Samla mg vävnad i 50 ml av 4 °C Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Blandning F12 (F12) kompletteras med 5% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1X Antibiotika-Antimycotic (Anti-Anti)18.
- Hacka körtlarna i en 35 mm skål eller på en keramisk platta med ett rakblad eller vävnadschopper. Rotera plattan var femte manuellkotletter eller varje runda på vävnadshelikoptern tills vävnadsbitarna kan passa genom en 1 ml mikropipett spets med lätthet (~ 0,1 mm / fragment, figur 1C).
- Smält MGs i Digestion Medium (se tabell 1)för 14 h i en 6 väl låg vidhäftning skålen vid 37 °C, 5% CO2.
2. Dag 2: Isolering av bröstepitelvävnadfragment
- Efter 14 h matsmältning, blanda försiktigt genom att pipetting den smälta vävnaden 10X med hjälp av en 1 ml mikropipett för att bryta ner eventuella återstående stroma eller fettvävnad, se till att varken bubblor eller överskott mekanisk kraft genereras.
OBS: Om det finns ofullständig matsmältning efter 14 timmar, kan detta bero på ansamling av klippt DNA. Tillsätt i detta fall 1 μL av 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) per 2 ml digestionmedium. Inkubera i ytterligare 30 min vid 37 °C, 5% CO2. - Samla vävnad i ett 15 mL-rör och skölj den väl använda för matsmältning med 2-3 ml vävnadkultur grad 1X Dulbecco's Phosphate Buffrad saline (DPBS) fri från Ca2 + och Mg2 +. Centrifugera vid 600 x g i 10 min.
- Evakuera supernatanten som innehåller lipidskiktet och mediet, och sedan återhänga pelleten i 5 ml DPBS och växla till ett nytt 15 mL-rör. Centrifugera vid 600 x g i 10 min.
- Under centrifugeringen placera rsattsilen på 70 μm i ett 50 ml rör och förgifta silen med 10 ml 37 °C DMEM/F12.
- Återsuspendera vävnadsfragment från protokollsteg 2.4 med 5 ml DPBS och skicka suspensionen genom en prewet 70 μm nyloncellsil för att avlägsna stromalceller och enskilda celler (figur 1D).
- Samla vävnadsfragmenten på cellsilen. Skölj 4X med 10 ml 37 °C DMEM/F12 (bild 1D).
VARNING: Ofullständig sköljning kommer att resultera i kulturer förorenade med icke-epitelceller. - Släpp vävnadsfragmenten genom att hålla silfliken med handskar fingrar, invertera silen över en 60 mm vävnadsodlingsrätt och passera 1 mL alikvoter av underhållsmedium (se tabell 1) genom botten av silen 4X (figur 1E).
- Kontrollera silen för vävnadsfragmentrester, som kommer att vara synlig med blotta ögat, och skölj silen 1X mer med 1 ml underhållsmedium om några fragment fortfarande håller sig till silen. De sköljda vävnadsfragmenten bör nu vara fria från stromalceller.
- Undersök snabbt 60 mm-skålen som innehåller MG-fragmenten från protokollsteg 2.9 under ett inverterat mikroskop (4X- eller 10X-mål, figur 1F). En typisk förberedelse av åtta MGs ger ~ 500 fragment. Leta efter enstaka celler eller fettdroppar och om det finns förorenande celler.
OBS: Om det finns förorenande celler, upprepa filtreringssteget genom att samla mellanmediet och fragmenten från 60 mm-skålen med en 5 ml pipett och filtrera fragmentet igen genom en ny 70 μm sil, upprepande protokollsteg 2.6, 2.8-2.10. - Inkubera 24 h vid 37 °C, 5% CO2,vilket gör att vävnadsfragmentet kan fastna och generera tvåskiktade fragment (figur 2A).
OBS: Om fragmenten inte har reglerats med 24 timmar, fortsätt att inkubera tills de följs. Om fragmenten inte fastnar väl kommer separationen av cellutrymmena inte att fungera. Om forskare är oroade över vidhäftning kan vävnadsodlingsplattorna behandlas för att främja fragmenttillsats (t.ex. poly-L-lysin).
3. Dag 3: Differentiell trypsinization av myoepitel- och luminalepitelceller
- För att separera MyoECs från LYSOK, tömma mediet från skålen, skölj 1x med 1 ml DPBS och tillsätt 1 ml färsk trypsin-EDTA (0,05%), och noggrant övervaka matsmältningen under ett inverterat mikroskop (10X eller 20X mål, figur 2B,C,F). Avskiljandet av det yttre MyoEC-skiktet kräver 3-6 min, beroende på trypsin-EDTA (0,05%) Styrka.
Obs: Se bild 2 för representativa bilder som visar denna process. Under brightfield belysning, myoECs visas rundade och har ett ljusare utseende i jämförelse med LYSKLAR, som förblir följs i mitten och verkar mörkare. - Samla MyoEC-fraktionen i ett 15 ml rör som innehåller 2 ml 10% FBS/DPBS. Utan att störa lysdioderna, skölj försiktigt 60 mm skålen med 2 ml DPBS och kassera sedan DPBS(figur 2H-I).
OBS: Den vanliga återhämtningen för MyoECs ligger inom ett intervall på (3,5 x 106-1,5 x 106)beroende på storleken på mgs. - Om du vill ta bort LEC-fraktionen lägger du till 1 ml trypsin-EDTA (0,05%) till skålen igen och inkubera 7-15 min, övervakning noggrant för att förhindra övermatsmältning. Släcka trypsin-EDTA (0,05%) på skålen med 2 ml 10% FBS/DPBS. Samla LEC-fraktionen i ett nytt 15 ml-rör.
OBS: Den vanliga återhämtningen för lysdioder ligger inom ett intervall (2 x 106-4,2 x 106)beroende på storleken på mgs. Rutinmässigt är renheten hos båda fraktionerna som analyseras av immunohistochemistry ~ 90%19 (figur 2E). - Centrifugera varje fraktion i 5 min vid 300 x g för att ta bort trypsin-EDTA (0,05%). Återupphäng pelleten i 250 μL underhållsmedium och räkna varje cellpopulation med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Placera cellerna på is medan du räknar.
OBS: Om genetisk manipulering av cellfraktionerna önskas, kan primära celler odlas på låga vidhäftningsrätter och infekterade med lentivirus20.
4. Dag 3: Kombinera och bädda in cellfraktioner i en extracellulär matris
OBS: När Fraktionerna MyoEC och LEC har samlats in och räknats kan de kombineras. Det typiska MyoEC/LEC-förhållandet är 1:3 (figur 3A)19. Olika studier kan utföras. För att utföra mosaikstudier kan fraktioner till exempel genereras från möss av vild typ (WT) och mut (Mut) och kombineras (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, eller fraktioner kan kombineras med olika förhållanden i MyoECs/LECs19.
- Baserat på cellantal, beräkna antalet brunnar (8 brunnkammare, se Tabell över material)som måste förberedas för 12.000 celler / ja (t.ex. 3.000 MyoECs:9.000 LYS).
- Upprätta basskiktet för 3D-odling genom att lägga till 90 μL på 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, utan fenolröd - se materialtabellen) till varje brunn. Se till att det inte finns några bubblor och brunnarna är belagda jämnt. För att stelna basskiktet, inkubera diabilderna vid 37 °C, 5% CO2 i 30 min.
OBS: ECM måste förbli iskall tills detta steg, annars kommer det att polymerisera i förtid och leda till ojämn basbeläggning och polymerisering. Med hjälp av en bas ECM förbättrar organoid tillväxt i ett enda plan, som hjälper bild fånga. Detta erhåller också snabbare organoid tillväxt och använder mindre ECM22. - Under polymerisering, förbereda cellmixarna. Pellet the MyoEC och LEC fraktioner på 300 x g för 5 min och återupphäng varje cell fraktion i 10% ECM/90% Tillväxt Medium så varje brunn har 100 μL (se tabell 1 för hur man gör Tillväxt Medium).
OBS: För enkel förberedelse, replikera brunnar med samma cell blandningar. Dessa kan kombineras och beredas i ett rör (t.ex. kan fyra brunnar i samma cellblandning beredas i 400 μL av 10% ECM/90% Growth Medium). - Tillsätt 100 μL av varje cellblandning i 10% ECM/90% Growth Medium till varje brunn och låt organoider nöja sig med 20 min vid 37 °C, 5% CO2.
- När cellerna har lagt sig, tillsätt försiktigt 100 μL tillväxtmedium genom att försiktigt pipetting ner kammaren väggen i varje brunn. Inkubera rutschbanorna vid 37 °C, 5 % CO2 (se figur 3A för den totala sammansättningen av varje brunn).
OBS: Rho Kinashämmare, R-spondin och Nrg1 är faktorer som har identifierats som viktiga för den långsiktiga kulturen av organoider som odlas från både primära murine bröstceller och mänskliga bröstcancerceller13,14. Dessutom utökar stamcellsfaktorerna B27 och N2 den tid som organoider kan odlas. - Bildceller var 24:e gång för att spåra deras tillväxt och förnya försiktigt tillväxtmediet var 2-3:e dag med 100 μL/brunn (bild 3B-E).
OBS: Var mycket försiktig när du förnyar mediet. Luta kammarens rutschkanor för att samla in mediet i ett hörn av brunnarna. Ta bort ≤100 μL av mediet och fyll på försiktigt för att lämna ECM-skiktet ostört. - Om forskare är intresserade av att undersöka amning/alveologenes, byt till Alveologenesis Medium (se tabell 1)dag 5 och fortsätta att förnya mediet var 2-3 dagar fram till dag 10(figur 3F)eller bortom genom att passera med hjälp av återställningslösning (se tabellen material)13.
OBS: Vid denna punkt kan organoider isoleras från ECM genom att ruva vid 4 °C i 400 μL av 4 °C återhämtningslösning (se tabell över material för protokoll och reagensinfo).
5. Dag 5 eller 10: Fastställande och immunfärgning organoider
- Ta försiktigt bort mediet genom att försiktigt pipetting av media (en glödlampa pipett fungerar bäst). Skölj varje brunn med 200 μL 1x Dulbeccos fosfatbuffrad saline (DPBS, se recept).
- Fäst organoiderna med kallt (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA, se recept) i 10 min vid rumstemperatur.
VARNING: PFA är farligt. Använd personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon). Detta steg bör utföras inuti en rök huva.
OBS: ECM löses upp av PFA-behandlingen. Ofullständig ECM borttagning kan leda till bakgrundsfärgning när organoider analyseras av immunofluorescens. - Ta bort 4% PFA och tillsätt 200 μL på 0,2% (w/v) glycin/DPBS (se tabell 1)i varje brunn. Inkubera rutschbanorna i rumstemperatur i 30 min eller 4 °C över natten på en gungyta inställd på en långsam inställning.
OBS: Organoiderna kan förvaras i 1-3 dagar i DPBS vid 4 °C före nästa steg. - Permeabilize organoids med DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, se tabell 1) i 10 min vid rumstemperatur.
- Blockera organoiderna med 5% åsna serum (DS) (eller annat serum som matchar arten av den sekundära antikroppen) i DPBS för 1 h på en gungyta.
OBS: Detta steg kan utföras över natten vid 4 °C på en gungyta. - Förbered primära antikroppar i 1% DS/DPBS. Använd 125-200 μL för varje brunn. Utför immunfärgning genom att inkubera organoiderna i primär antikropp över natten vid 4 °C på en gungyta.
6. Dag 11: Fullständig immunfluorescens
- Tvätta varje brunn 2X med 200 μL PBST i 5 min. Tillsätt sekundär antikropp i 1% DS/DPBS med 125-200 μL för varje brunn. Inkubera i rumstemperatur på en gungyta i 45 min.
- Tvätta varje brunn 2X med 200 μL PBST per brunn.
- Stain nuclei med Hoechst DNA färgämne i DPBS (1:2.000 i DPBS) i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort all vätska kvar på brunnen genom att försiktigt suga med ett vakuum.
- Ta försiktigt bort kamrarna och packningen, placera en droppe (~30 μL) av monteringsmedia (se materialtabell)på varje brunn och täckglidning, var noga med att ta bort bubblor. Låt bilden torka i mörkt utrymme i 1-2 dagar. Täta med klart nagellack. Bild av organoiderna på ett konfokalt mikroskop (bild 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här beskriver en metod för att undersöka specifika härstamning bidrag från bröst epitelceller genom att använda sig av mosaik organoider. För att erhålla primära murineceller för organoider måste bröstkörteln epitel först isoleras från den omgivande adipocyterika stroma (figur 1). Denna process beskrivs kortfattat här och beskrivs också i en tidigare publicerad studie18. För att få tillräckligt med celler rekommenderas att #2, 3, 4 och 5 MG tas bort(figur 1A). Ett viktigt steg för att isolera en ren population av epitelceller är avlägsnande av lymfkörtlarna från #4 MGs, som är rika på immunceller som kommer att förorena preparatet(figur 1A,B). MGs maldes för att generera fragment ~0,1 mm i storlek (figur 1B). Vävnadsfragmenten smältes sedan enzymatically, en process som inträffar i närvaro av kollagen, att frigöra epithelia från stroma, och i avsaknad av trypsin, för att förhindra matsmältningen av proteiner som kacadheriner som upprätthåller cell-cellkontakter. Den smälta vävnaden centrifugerades sedan för att avlägsna lipider och filtreras genom en cellsil och tvättades (figur 1C). Epitelfragment, som är beroende av silen, frigjordes genom att vända filtret och tvätta membranet, som överförde epitelfragmenten till en polystyrenrätt (figur 1D). Dessa fragment verkade som små, grenade strukturer (figur 1E).
De renade epitelfragmenten ruvades i 24 timmar. De bosatte sig på skålen och höll sig, bildar platta, pannkaka-liknande strukturer med ett yttre lager av MyoECs omger inre LYSDIODER(figur 2A-B). Figur 2C visar kanten av en sådan pannkaka-liknande struktur från en vild typ djur. Trypsin behandling lossas differentiallöst MyoECs, som lossnade först och verkade som ljusa, rundade celler som omringade kärnan av återstående kubiska LYSDIODer(figur 2C,F). Avlossningen av MyoECs övervakades noggrant med hjälp av brightfield mikroskopi och inträffade inom 3-6 min. När mec-grupperna samlades in lossnade lysdioder därefter genom en andra, längre trypsinbehandling på 7-15 min. Den tid som krävs för cellavlossning beror på trypsinkoncentrationen och färskheten. Den totala renheten för de två cellfacken var ~90%, vilket framgår av att man räknade celler som var KRT14-positiva och E-Cadherin (CDH1)-negativ i MyoEC-fraktionen och celler som var KRT14-negativa och E-Cadherin-positiva i LEC-fraktionen (figur 2D-E)19. Vi upptäckte att några av de MyoECs togs bort från toppen av pannkaksliknande struktur samt från ytterkanterna. Detta observerades med hjälp av vävnadsfragment som samlats in från möss märkta med en inducerbar, fluorescerande basalmarkör (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) och injiceras med 75 mg/kg tamoxifen 5 dagar före skörden. I figur 2F,G är det lätt att ta bort de myoecs från runt kanterna på pannkaksstrukturen. Detta inträffade inom de första 2 min trypsin behandling (figur 2F). Dessutom observerades YFP-KRT14-positiva celler ovanpå strukturen, där de rundade upp efter trypsinbehandling och avlägsnades genom skölj-/insamlingssteget (figur 2G). Den omärkta kärnan i LYSDIOD(figur 2H),som innehöll få eller inga YFP-KRT14-positiva celler(figur 2I) lossnade därefter i den andra omgången av trypsinbehandling.
Den MyoEC och LEC fraktioner samlades in, kombineras, och inbäddade i 10% ECM pläteras på en 50% ECM bas. Detta möjliggjorde bättre optisk upplösning av de organoider som växte främst längs basskiktet (figur 3A). Efter 24 h, cellerna monteras i aggregerade strukturer som till stor del saknade en lumen (figur 3B). Efter 48 h bildas begynnande organoider som de centrala lumen urholkade och verkade som ett lättare inre utrymme (figur 3C). Efter 10 dagar var organoiderna stora, grenade strukturer med välutvecklade lumen. Mosaik organoider som genereras från MyoECs skördas från vild typ möss och LYSLEN skördas från ACTb-EGFP möss fastställdes på plats, immunostained med en antikropp mot basal markör alfa-smooth muskel aktin (SMA), och färgade med Hoechst DNA fläcken för att visa kärnor. I figurerna visar de övre vyerna olika uppsättningar bilder som samlats in som en Z-stack och rekonstrueras till en 3D-vy (figur 3D). Den övre vyn avslöjar organoidernas förgrenade morfologi (figur 3E). Avsnittsvyn visar den tvåskiktade epitelialstrukturen och öppna lumen av dessa organoider (figur 3E''). Dessa organoider kan också differentieras på dag 5 med Alveologenesis Medium och inkuberas i ytterligare 5 dagar(figur 3F). Organoiderna blev större, hade fler grenar och innehöll mjölk. Differentierade organoider genererades enligt beskrivningen ovan och immunostained med en antikropp riktad mot mjölkmarkören, vasslesyraprotein (WAP, figur 3F). WAP är ett lösligt protein utsöndras till mjölk. Mycket av denna vätska förlorades när cellerna var fasta och immunostained in situ. Därför, i de övre och avsnitt vyer, WAP färgning syns intracellulärt i utsöndrande celler och extracellulärt i mjölk som var instängd på cellytan under fixering (figur 3F), även om i avsnitt visa en liten organoid verkar innehålla flytande mjölk(figur 3F'' förpackade överlägg).
Figur 1: Däggdjurfragmentisolering. (A)Märkt schematisk av en mus 5 MGs med omärkta, kontralaterala parade MGs. (B) Bilder av mus MGs med #4 MG boxed och förstoras för att visa hur man identifierar lymfkörteln för borttagning. (C)Bild av hackade MGs i en 6 väl låg vidhäftningsplatta med en linjal som visar storleken på vävnadsbitarna (~0,1 mm vardera). (D-E) Schematiska illustrerar protokoll steg 2,7-2,9. (D)MG-fragment filtrerades genom en 70 μm sil och sköljdes 4X. (E)Silen var sedan inverterad över en 60 mm polystyren vävnad kultur skålen och fragment släpptes ut i skålen. (F)Bild som visar de filtrerade vävnadsfragment som samlats in på en 60 mm-skål som är fri från stroma. Pilarna pekar på de minsta fragment som samlas in på 70 μm silen. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Differentiell trypsinization. (A) Brightfield bild som visar en vävnad fragment fästs på en polystyren maträtt, bildar en pannkaka-liknande struktur. (B-C) Det första differentialtrypsinization-steget lossnade myoecs som är tydligt synliga som ljusa, rundade celler efter 3 min. (D)Immunfluorescerande bilder av MyoECs (botten) och LYSDIODer (överst) med cytokeratin 14 (KRT14) cellmarkör för MyoECs, och E-Cadherin (CDH1) cellmarkör för LECs. (E)Uttrycket för KRT14 och CDH1 användes för att kvantifiera avkastningen och renheten hos de differentiellt trypsiniserade cellfraktionerna. (F-I). Representativa faskontrast- och fluorescensbilder av vävnadsfragment från Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. Möss injicerades med 75 mg/kg tamoxifen 5 dagar före skörden. (F)Lossning av MyoECs (pilar) under den första trypsin-EDTA (0,05%) 2 min efter inkubation. (G)Ett stänk av KRT14-YFP-MyoECs (pilar) ovanpå en pannkaka av omärkta LYSDIODER. (H)Brightfield bild av LYSKLAR efter inledande trypsinization och MyoEC avskildhet. (I) Efter myoEC-avskildhet syns krt14-YFP-MyoECs inte längre som visas av frånvaron av YFP-uttryck. Vågar = 30 μm (A, brightfield) 100 μm (F, brightfield), 50 μm (G, fluorescens), 100 μm (H,I). Paneler A-E av denna siffra ändras från Macias et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tredimensionell organoidkultur. (A)Schematisk representation av enskilda celler inbäddade i 10% ECM/90% Growth Medium och odlas på en 50% ECM/50% DMEM basskikt (protokoll steg 4,5). (B-C) Illustrationer och faskontrastbilder som visar den snabba självorganiserande kapaciteten hos däggdjursorganoider som genereras från olika trypsiniserade och kombinerade myoecs och lysdioder vid 24 h (B) och 48 h (C). Bilder som samlats in med hjälp av ett digitalt widefield mikroskop(D)Schematisk representation som illustrerar de övre (vänstra) eller avsnitt (höger) åsikter som används i E-F för att visa immunofärgade organoider. (E)Schematisk representation av en enda brunn i en 8 brunnkammare bild som innehåller däggdjur organoider odlas i 5-10 dagar i Growth Medium. (E'-E") Ovanifrån(E)och sektionsvy (E") av immunofärgade organoider på dag 10 av tillväxt. MyoECs är märkta med smidig aktin muskel (SMA) i pseudocolor magenta. LeCs är från ACTb-EGFP möss och visas i pseudocolor grön. Nuclei var fläckad med Hoechst färgämne. (F)Schematisk representation av en enda brunn i en 8 brunn kammare bild som innehåller däggdjur organoider odlas i 5 dagar i Tillväxt Medium och 5 dagar i Alveologenesis Medium. (F'-F"). Top view (F )och avsnittsvy (F") av immunofärgade organoider på dag 10 av tillväxt. De myoecs är omärkta. LeC:erna från ACTb-EGFP-möss visas i pseudocolor green. Mjölkproteinet, vasslesyraproteinet (WAP), visas i pseudofärggult i lysdioderna och beläggning insidan av organoidernas lumen. Nuclei var fläckad med Hoechst färgämne. Bilder som samlats in med hjälp av en snurrande disk confocal mikroskop och rekonstrueras i 3D med Imaris(E,, E)eller nedre delen ~ 30 segment(F', F"). Skalstänger = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 10 ml | Matsmältning Medium | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 9,45 ml | DMEM/F12 | |
| 100 μL | Antibiotika-antimykotiska (100X) | |
| 0,04 g | Klass 3 Kollagen | |
| 0,04 g | Undergrupp 2 Dispase | |
| 50 μL | Gentamicin | Slutlig koncentration: 500 μg |
| 2,5 ml | Fetala nötkreatur Serum | Slutlig koncentration: 5% (v/v) |
| Passera genom 0,22 μm filter | ||
| 50 ml | Underhållsmedium | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 49,47 ml | DMEM/F12 | |
| 0,5 ml | Antibiotika-antimykotiska (100X) | |
| 2,5 ml | Fetala nötkreatur Serum | Slutlig koncentration: 5% (v/v) |
| 25 μL | Insulin | Slutlig koncentration: 250 μg |
| 5 μL | Egf | Slutlig koncentration: 500 ng |
| 10 ml | Tillväxt Medium | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, ingen fenolröd | |
| 100 μL | N-2 Tillägg (100x) | |
| 200 μL | B27 tillägg utan vitamin A (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 (på 801) | Lager: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin | Lager: 10 μg/ml |
| 1 μL | Rho-hämmare Y-27632 | Lager: 10 μM |
| 1 μL | Egf | Lager: 0,1 μg/μL |
| 10 ml | Alveologenesis Medium | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, ingen fenolröd | |
| 100 μL | N-2 Tillägg (100x) | |
| 200 μL | B27 tillägg utan vitamin A (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 (på 801) | Lager: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin | Lager: 10 μg/ml |
| 1 μL | Rho-hämmare Y-27632 | Lager: 10 μM |
| 5 μL | Får Hypofysen Prolactin | Slutlig koncentration: 1 μg/ml |
| 1 μL | Dexametason | Slutlig koncentration: 5 μg/ml |
| 5 μL | Insulin | Slutlig koncentration: 5 μg/ml |
| 1 L | 10x DPBS | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | KCl (kcl) | |
| 14,4 g | NaH2PO4 (på 800) | |
| 2,4 g | KH2PO4 (PÅ) | |
| 1 L | di H2O (di H2O) | |
| Fyll till 800 ml innan du lägger till torra reagenser och lös upp. Fyll volymen till 1 L. Justera pH till 7,4. Autoklav att sterilisera. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 100 ml | 10x PBS | |
| 900 ml | di H2O (di H2O) | |
| 1 L | PBST (pBST) | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 100 ml | 10x PBS | |
| 2,5 ml | Triton X-100 | |
| 250 ml | 4% Paraformaldehyd | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 10 g | Paraformaldehyd | |
| 200 ml | di H20 | vatten måste vara vid 60 °C |
| 25 ml | 10x DPBS | |
| 50 μL | 10 N Natriumhydroxid | |
| Passera genom ett 0,45 μm filter för att sterilisera och försäkra pH är 7,4 | ||
| 10 ml | 1 % Åsna Serum | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 100 μL | Sterilfiltrerat donkeyserum | |
| 9,9 ml | 1X DPBS | |
| 10 ml | 0.2% Glycine | |
| Belopp | Reagens | Anteckningar |
| 0,02 g | Glycin | |
| 10 ml | 1X DPBS | |
Tabell 1: Lösningsrecept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras en metod med uppgifter om hur forskare kan generera 3D-organoidkulturer med hjälp av primära MG-celler. Skillnaden mellan detta och andra protokoll är att vi detalj en metod för att separera de två, distinkta MG cell fack: den yttre basala MyoECs och inre LYSKLAR. Vår metod använder en tvåstegs trypsin-EDTA (0,05%) behandling som vi kallar differentialtrypsinization19. Detta förfarande gör det möjligt för forskare att isolera MyoECs och LYSOK utan att använda sofistikeradflöde cytometri och därmed kan användas för att studera MGs skördas från en mängd olika däggdjurarter som kanske inte har väl karakteriserade biomarkörer som krävs för FACS. Förmågan att segregera de två cellsubpopulationerna gör det möjligt för forskare att genetiskt modifiera de isolerade cellerna självständigt eller kombinera celler från djur som hyser genetiska mutationer eller etiketter, och därmed generera mosaik organoider i 3D-kultur. En begränsning av det nuvarande protokollet är att stromalfacket inte ingår i odlingsförhållandena. Nya metoder utvecklas dock till coculture stromal komponenter med organiska komponenter som genereras från antingen primära celler eller cellinjer för att bättre rekapitulera in vivo ECM23,24,25,26, och dessa metoder kan anpassas till detta protokoll. Dessutom är det viktigt att notera att även om detta protokoll uppnår en stor anrikning av MyoEC och LEC fraktioner (~ 90% rening), fraktionerna representerar inte ren cell linjer.
Framgången för detta protokoll bygger på ett antal viktiga steg. Först är det viktigt att försiktigt men noggrant smälta MG vävnaden. Övermatsmältning av vävnaden kommer att leda till celldöd och lägre återvinning av epitelceller. Ofullständig matsmältning kommer att resultera i stromal och fettcellkontaminering, vilket kommer att störa senare analyser (t.ex. immunfluorescens, proteinanalys och mRNA-mätningar). För det andra är det viktigt att noggrant skölja MG-vävnaden för att ta bort förorenande celler i protokollsteg 2.8. I protokoll steg 2.9 släpps MG-vävnadsfragmenten ut i en 60 mm-skål. Forskare bör övervaka de frisläppta fragmenten omedelbart, innan de följer skålen. Om fettdroppar eller enstaka celler observeras måste protokollsteg2.6 och 2.8-2.11 upprepas. För att göra detta samlas mellan- och vävnadsfragmenten in från skålen, placeras i en ny 70 μm sil, tvättas 4X med 37 °C DMEM/F12 och sedan släppas ut i en ny 60 mm maträtt. För det tredje är det viktigt att titta på den första trypsin-EDTA (0,05%) inkubation en nära eftersom MyoECs kan lossna inom de första 3 min, men de kan också följa upp till 6 min. Det har förekommit fall när trypsin-EDTA (0,05%) var suboptimal, och inkubation fortsatte i 10 minuter med framgångsrik rening av MyoECs. >10 min trypsinization resulterade dock i samtidig samling av MyoECs och LECs. Det är också viktigt att skålen förblir ostört under den första inkubationen. Annars kan kontaminering av MyoEC-fraktionen med LYSDIODER förekomma. Det omvända är också sant; om MyoECs inte är helt fristående från skålen, kommer de att förorena LEC fraktionen. Om forskare använder reportermöss som uteslutande märker MyoECs eller LECs, är det lättare att visualisera separationen under ett fluorescensmikroskop (figur 2F-I). Slutligen, om forskare planerar att fastställa organoider för immunofluorescensanalyser, är pH(7.4) och temperaturen (4 °C) för 4 % PFA viktigt för framgångsrik dissociation av ECM. Om organoiderna samlas in för andra analyser (t.ex. protein- och mRNA-mätningar) är det viktigt att återhämtningslösningen är vid 4 °C. Om ECM inte upplöses kan inkubationen med återhämtningslösningen förlängas med 10 min (dvs. 30 min totala inkubation). Längre inkubationsperioder kommer dock att leda till förlust av 3D-struktur och celldöd. Återställningsprotokollet (som anges i materialtabellen)anger användningen av vidgade spetsar. Detta är viktigt för att upprätthålla 3D-strukturen av organoider samt integriteten hos cellerna.
Utöver dessa fyra viktiga steg finns det två faktorer som påverkar protokollets framgång. För det första kan organiska tillväxt begränsas av genetiska mutationer som minskar cellproliferationen och minskar därför organiska tillväxten i ECM. Om endast ett fåtal organoider erhålls, resulterar det efterföljande fixeringssteget ofta i deras förlust. För att åtgärda detta bör antalet celler som är inbäddade i ECM ökas samtidigt som förhållandet mellan MyoECs:LECs (protokollsteg 4.1-4.2) bibehålls. För det andra, när cellerna överförs till en ECM är det viktigt att titta på deras tillväxt dagligen och vara vaksam om media förnyelse (var 2-3 dagar). Detta protokoll anger fenol röda fria reagenser för bättre visualisering, men samma framgång och tillväxt uppnås med fenoröda positiva reagenser. De dagar då medelförnyelse sker före fixering (protokollsteg 4.6) bör utföras med stor försiktighet för att minska cellförlusten. Det 10% ECM översta lagret är känsligt; Därför tvättar eller medelförnyelse bör utföras genom pipetting vätska ner kammarenväggar för att minimera mekaniska störningar.
Differentiering av organoider i mjölkproducerande acini kräver behandling med differentiering kosttillskott: hydrokortison eller dexametason, insulin, och prolaktin. I det här protokollet rekommenderas dexametason. Dessutom, medan prolaktin är kommersiellt tillgänglig, prolaktin som används i detta protokoll erhölls från National Hormone and Peptide Program. Återigen är det mycket viktigt att lämna organoider ostört när du ändrar Alveologenesis Medium. Differentiering kräver minst 5 dagar. Detta kan förlängas ytterligare 3-5 dagar, men baslagret av ECM försämras efter 10-12 dagar. Differentierade organoider är fyllda med mjölk och deras lumen verkar mörkare.
Detta är en effektiv teknik som kan användas för att ta itu med fackspecifika, härstamning bidrag till bröst epitelial morfogenes och differentiering. Med denna teknik kan forskare generera mosaik organoider bestående av differentialgenetiskt manipulerade MyoECs och LYSDIODer21, eller MyoECs och LYSDIODer som erhållits från möss hysa olika genetiska mutationer. Detta gör det möjligt för forskare att bättre förstå bidragen från härstamning-specifika cell avdelningar till organ morfogenes och förvärv av specialiserade funktioner såsom mjölkproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ben Abrams för tekniskt bistånd och kärnstöd från University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Vi tackar Susan Strome och Bill Saxton för användningen av deras Solamere Spinning Disk Confocal Mikroskop. Detta arbete stöddes delvis av bidrag till UCSC från Howard Hughes Medical Institute genom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), från NIH (NIH GM058903) för initiativet att maximera studentutveckling (H.M.) och från National Science Foundation för forskarstipendium (O.C. DGE 1339067) och genom bidrag (A18-0370) från UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L.
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
