Summary
Här beskriver vi metoder med time-lapse, fas-kontrast mikroskopi till bild mus bosatt peritoneal makrofager i ett chemotactic komplement C5a gradient. Protokollen kan utvidgas till andra immunceller.
Abstract
Chemotaxis är receptormedierade vägledning av celler längs en kemisk gradient, medan kemokinesis är stimulering av slumpmässig cellmotilitet av en kemikalie. Chemokinesis och chemotaxis är grundläggande för mobilisering och distribution av immunceller. Till exempel, chemokines (chemotactic cytokines) kan snabbt rekrytera cirkulerande neutrofiler och monocyter till extravaskulära platser för inflammation. Chemoattractant receptorer tillhör den stora familjen av G protein-kopplade receptorer. Hur kemoattractant (dvs ligand) gradienter direkt cellmigration via G protein-kopplade receptor signalering är ännu inte helt klarlagt. Inom immunologi är neutrofiler populära modellceller för att studera kemotaxis in vitro. Här beskriver vi en realtid tvådimensionell (2D) chemotaxis analys skräddarsydd för mus bosatt makrofager, som traditionellt har varit svårare att studera. Makrofager rör sig i långsam takt på ~1 μm/min på en 2D-yta och är mindre väl lämpade för punkt-källa migrationsanalyser (t.ex. migration mot spetsen av en mikropipette fylld med kemoattractant) än neutrofiler eller Dictyostelium discoideum, som flyttar en storleksordning snabbare. Ofta använda Transwell-analyser är användbara för att studera den kemotaktic aktiviteten hos olika ämnen, men ger inte information om cellmorfologi, hastighet eller chemotactic navigering. Här beskriver vi en time-lapse mikroskopi-baserade makrofag chemotaxis analys som möjliggör kvantifiering av cellen hastighet och chemotactic effektivitet och ger en plattform för att avgränsa givare, signal vägar och effektorer av chemotaxis.
Introduction
Immunceller migrerar vanligtvis singly på en 2D-yta på ett amoeboid sätt1,2, vilket innebär upprepade cykler av utskjutande av fronten, integrin-medierad cell vidhäftning, och upprullning av den bakre. Ett nödvändigt steg är cellpolarisering, där celler bildar främre och bakre ändar3. Chemotaxis börjar med detektion av kemoattractants av G protein-kopplade receptorer och ett komplext signalnät medierad av membran-förankrade heterotrimeric G-proteiner och små monomera g-proteiner, samt fosfolipid-bundna guanin nukleotid utbytesfaktorer (GEFs)4,5. Aktivering av Rho GTPases av Cdc42 och Rac subfamilies framkalla utsprång på framsidan6 och medlemmar av Rho underfamilj, särskilt RhoA, aktivera sammandragning av den bakre5,7. I en tredimensionell (3D) miljö, integrins är till stor del överflödiga för leukocyte migration och RhoA blir viktigare för att klämma celler genom smala passager8, medan Cdc42- eller Rac-inducerad Arp2/3 aktivering är fortfarande viktigt för chemotactic styrning9,10.
Immunceller kan möta olika kemoattractants, särskilt i inställningarna för vävnadsskada, patogeninvasion, och inflammation. De endogena kemoattractants uttryckta på fagocyter kompletterar C3a och C5a, genereras snabbt genom aktivering av komplementkaskaden och erkänns som komplement C3a- och C5a-receptorer. På samma sätt rekryterar nekrotiska celler fagocyter via formylpeptidreceptorer, som känner igen mitokondrierna samt bakteriebaserade formylpeptider11. Immunceller uttrycker också G protein-kopplade receptorer för kemokines, en stor familj av chemoattractant peptider som deltar i regleringen av immuncellshandel under både homeostas och inflammation. Chemokines klassificeras i fyra grupper beroende på avståndet mellan de två första cystein (C) rester: C, CC, CXC, och CX3C cytokiner, där X är en aminosyra. Således, in vivo immunceller måste på lämpligt sätt svara på mycket komplexa rumsliga och tidsmässiga signaler, vilket gör studien av chemotaxis en skrämmande uppgift. Nedan ger vi en kort historia av chemotaxis, som började med intravital imaging metoder.
Studien av leukocyte chemotaxis går tillbaka till 188812, när ögonläkare Theodor Karl Gustav Leber tydligt beskrev riktad migration av leukocyter till, och ackumulering på, platser för inflammation i en modell av mycotic (svamp) keratitis. Leber betonade att attraktionen av överskott leukocyter av patogen-härledda ämnen är viktigt för eliminering av skadliga mikroorganismer via fagocytos, som hade beskrivits av Metchnikoff (även känd som Metschnikoff) tidigare under samma årtionde13. In vivo experiment utfördes också på 1920-talet av Clark och Clark14,15, som drog nytta av öppenheten i grodyngel och visade att steril inflammation framkallas av croton olja14 eller andra irriterande15 orsakade leukocyter att följa blodkärlen, följt av diapedesis (transendotelmigration) och snabb migration genom vävnadsutrymmen mot irriterande. In vitro-experiment med hjälp av mikrocinematografimetoden som utvecklats av Jean Comandon16 visade att leukocyter migrerade mot en partikelkemoattractantkälla såsom bakterier17. På den tiden var de molekylära identiteterna hos kemotaktiska faktorer okända. På 1960-talet erkände Stephen Boyden18 att tekniker för att studera den kemotaktiska aktiviteten hos lösliga ämnen saknades. Han utarbetade en kammare, senare känd som Boyden kammaren, med två fack åtskilda av ett filter papper membran. En cellfjädring tillsätts i det övre facket och testämnet tillsätts antingen i båda facken eller endast till det nedre facket. Efter en inkubationstid avlägsnas filtermembranet och cellerna är fixerade och färgade. Genom att jämföra hur många celler som migrerar över filtermembranet mot den nedre brunnen med testämnet i båda facken, i inget av facken eller endast i det nedre facket, kan chemotactic aktivitet bestämmas. Transwell analyser är fortfarande populära idag och har ändrats på olika sätt, inklusive användning av olika polykarbonat membran med definierade porstorlekar ochdensiteter 19,20. En stor nackdel med Transwell analyser är att det är opraktiskt att direkt visualisera celler migrera och migrationsvägen över membranet vanligtvis inte överstiger diametern på en immuncell.
Sally H. Zigmond utvecklade en chemotaxis kammare21 som möjliggjorde visualisering av både gradientbildning och cellmorfologi med fluorescerande färgämnen. Kammaren består av en plexiglas (akryl) bild med två parallella linjära brunnar, var och en med en volym på ~ 100 μL, åtskilda av en 1 mm bred bro 3-10 μm under det övre planet av bilden. Ett täcket som är sådd med celler vänds in och placeras på bilden så att den spänner över de två brunnarna. Efter tillsats av en chemoattractant till en av brunnarna, bildas en brant chemoattractant lutning över överbrygga, typisk inom 30-90 minuter. Människa polymorphonuclear leukocytes (granulocytes) i zigmondkammaren observeras orientera sig in mot chemoattractanten. Variationer av Zigmond kammaren har rapporterats, inklusive Dunn22 och Insall23 kammare, som båda använder ett täcket seedade med celler placerade över två brunnar åtskilda av en 1 mm bred bro. Dunnkammaren består av koncentriska brunnar åtskilda av en cirkulär bro, medan Insallkammaren är närmare besläktad med Zigmond-kammaren, men ger broar med två olika bredder, 0,5 mm och 1 mm. En ny chemotaxis kammare, kallad μ-Slide Chemotaxis och tillverkas av plast formsprutning, beskrevs av Zemgel et al.24. Cellgiftskammaren består av två 40 μL reservoarer åtskilda av en 1 mm bred kanal med en längd av 2 mm och en höjd av 70 μm. Botten av kammaren bildas av en gas genomsläpplig, tunn plastfolie med samma tjocklek och optiska egenskaper hos en nr 1,5 glas täckhinn24. Här beskriver vi en chemotaxis analys med μ-Slide Chemotaxis kammaren för att visualisera migrationen av mus bosatt peritoneal makrofager för upp till 14 h i en chemotactic (komplement C5a) gradient.
Protocol
Protokollen följer riktlinjerna från vår lokala forskningsetiska kommitté samt riktlinjerna för djurvård.
Obs! Bild 1 visar ett arbetsflöde för chemotaxis-analysen.
1. Förfyllning Chemotaxis Diabilder
-
Förfyll de 1 mm breda och 2 mm långa anslutningskanalerna på en eller två chemotaxis diabilder med modifierat RPMI 1640 HEPES-medium, bestående av bikarbonatfri RPMI 1640 medium innehållande 20 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfenonsyra (HEPES), 10 % värmeaktiverat fetala bovinserum (FBS) och antibiotika som penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 μg/ml), beredda genom spädning 100x penicillin/streptomycin, och 1 μg/mL lipopolysackarid (från E. coli),och en Toll-liknande receptor 4 ligand som används för att aktivera cellerna.
- Placera en chemotaxis slide(figur 2A) i en rund (10 cm diameter) cellodlingsskål, båda förvärmda till 37 °C, och ställ skålen på ett uppvärmt aluminiumblock (37 °C). Sätt i kontakterna i portarna 1 och 4 (bild 2B).
OBS: Ett aluminiumblock som underhålls vid 37 °C och placeras inuti den laminära flödeshuven är användbart för att förbereda chemotaxis kammare. Helst bör det uppvärmda blocket ge en platt arbetsyta och brunnar för olika rör, såsom 50 ml rör och 2 ml mikrocentrifugrör. - Använd en 10–200 μl pipettspets med en avfasad spets, sätt in 15 μL modifierat RPMI 1640 HEPES-medium i påfyllningsport 3 (figur 2B). Därefter, med volymen fortfarande inställd på 15 μL och kontrollknappen på pipetten (2–20 μL volym) nedtryckt, sätt in pipettspetsen i port 2 och aspirera 15 μL i måttligt snabb hastighet (bild 2B). Detta kommer att förfylla 1 mm x 2 mm anslutningskanal (observationsområde), samt de två flankerande matningskanalerna (mellan det centrala observationsområdet och portarna 2 respektive 3). Täck påfyllningsportar 2 och 3 med lock.
- Efter förfyllning, placera chemotaxis diabilderna på ett rack som förvaras i en sluten fuktighetskammare i en annars torr och CO2-friinkubator vid 37 °C.
OBS: Det är viktigt att använda rätt pipettspets för att fylla cellgiftsbilden. En avfasad pipett spets kilar i toppen av fyllningsporten, medan vanliga spetsiga pipett tips kan införas djupare i fyllningsporten och kan kraftigt öka motståndskraften mot vätskeflödet.
- Placera en chemotaxis slide(figur 2A) i en rund (10 cm diameter) cellodlingsskål, båda förvärmda till 37 °C, och ställ skålen på ett uppvärmt aluminiumblock (37 °C). Sätt i kontakterna i portarna 1 och 4 (bild 2B).
2. Isolering av mus resident peritoneal makrofager
- Offra en 3–4 månader gammal mus med en hög koncentration av flyktiga bedövningsmedel isofluran (>5% i luft) eller koldioxid25, följt av livmoderhalscancer störning. Förlust av den rätta reflexen hos gnagare korrelerar med medvetslöshet hos människor26. Rengör buken på musen med 80% etanol i vatten och gör sedan ett 1-2 cm mittlinje hudsnitt med kirurgisk sax med trubbiga spetsar. Skala tillbaka huden för att exponera den underliggande bukväggen.
- Sätt in en 24 G plastkateter i bukhålan. Med en 5 ml plastspruta, lavage håligheten med 2 x 4,5 ml iskallt Hanks buffrade saltlösning (HBSS), utan Ca2+ och Mg2+. Lämna cirka 0,5 ml kvarvarande HBSS i sprutan så att vävnad oavsiktligt sugs på kateterns spets kan avlägsnas.
- Överför det lavaged mediet, vanligtvis 8–8,5 ml totalt, till ett 14 ml polypropylen runt bottenrör. Centrifugera röret i 300 x g i 6,5 min vid rumstemperatur.
OBS: Det runda bottenröret gör att supernatanten kan dekanteras helt och minskar cellklumpenning. - Kassera supernatanten och återanvända peritonealcellerna (vanligtvis ~4 x 106 celler per mus) i 200 μL modifierat RPMI 1640 HEPES-medium. Späd ett prov av cellfjädringen 1:20 och använd en räkneanordning, till exempel en Neubauer förbättrad räknekammare, för att räkna cellerna. Späd sedan cellfjädringen till en slutlig koncentration på 10 x 106 celler/ml och underhåll cellerna i en rund botten 2 ml polypropylenmikrocentrifugrör vid 37 °C med hjälp av ett uppvärmt aluminiumblock (se OBS i steg 1.1.1).
3. Sådd peritoneal celler i Chemotaxis Diabilder
- Efter pipettering av cellupphängningen upp och ner 5x med pipettvolymen inställd på 100 μL (eller vid halva suspensionsvolymen) för att minska klumpar, försiktigt deponera 10 μL av cellfjädringen i port 3 i en chemotaxiskammare (figur 2C). Placera pipettspetsen i port 2 och dra långsamt in cellfjädringen i anslutningskanalen (bild 2C). Så snart cellupphängningen har införts, ta bort pluggarna vid portarna 1 och 4, vilket kommer att bidra till att stoppa flödet av cellfjädringen. Placera lock på alla fyra fyllningsportar.
- Upprepa steg 3.1 för alla chemotaxiskammare. Med hjälp av ett litet inverterat mikroskop och en 10x faskontrast objektiv lins, inspektera chemotaxis diabilder för oönskade luftbubblor.
- Placera chemotaxis diabilderna sådda med peritonealceller i en fuktighetskammare vid 37 °C i 2–3 timmar.
4. Fylla reservoarerna och lägga till chemoattractant
- Inspektera observationsområdet (kanal som förbinder de två 40 μL-reservoarerna) med hjälp av ett inverterat mikroskop.
OBS: I detta skede kommer celltätheten att vara högre än efter att ha fyllt reservoarerna, eftersom svagt vidhäftande celler, främst CD19+ celler (B1-celler), kommer att tvättas ut ur observationsområdet under fyllningsförfarandet (figur 2C–E). - Placera kontakterna i påfyllningsportarna 1 och 2 (bild 2D). Se till att påfyllningsport 3 fylls på upptill med medium och fri från luftbubblor. Använd en steril 27 G spruta nål för att lossa oönskade luftbubblor, om det behövs.
- Använd en mekanisk pipett med 10–100 μl volym och aspirera ~60 μL modifierat RPMI 1640 HEPES-medium och placera pipettspetsen i påfyllningsport 3. Använd pipettens volyminställningsring för att långsamt och stadigt injicera medium i behållaren så att mediet når toppen av påfyllningsporten 4 efter 1–2 min (bild 2D).
- Fyll den andra behållaren. Flytta kontakten från ba port 1 och sätt långsamt in den i port 3 (bild 2D). Därefter aspirera ~ 50 μL modifierad RPMI 1640 HEPES medium och placera pipettspetsen i påfyllningsport 4. Använd volyminställningsringen på pipetten 10–100 μl för att långsamt och stadigt injicera medium i den andra behållaren så att mediet når toppen av påfyllningsporten 1 efter 1–2 min (bild 2D).
- Placera 495 μL modifierat RPMI 1640 HEPES-medium i ett (rund botten) 2 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 5 μl patentblå V (stamlösning: 10 mg/ml i fosfatbuffertad saltlösning [PBS]), en blå dyning som används som visuell indikator på koncentrationsgradientbildning. Blanda genom kort virvel. Tillsätt 5,4 μl rekombinant muskomplement C5a (stamlösning: 50 μg/ml i PBS med 0,1 % bovin serumalbumin) och blanda genom kort virvel.
- Sätt på 15 μl blått, komplettera C5a-innehållande medium i påfyllningsporten 1 (figur 3A), efter att ha sett till att den grunda fördjupningen på toppen av porten är medelfri (annars kan droppen spillas).
- Sätt i en 10–200 μl pipettspets i påfyllningsporten 4 och rotera långsamt och stadigt volyminställningsringen på pipetten på 10–100 μl för att dra droppen av blått, komplettera C5a-innehållande medium i den motsatta behållaren (figur 3B). Luften börjar komma in i den korta vertikala kolumnen i fyllningsport 1. Dra in luft tills vätskeluftsgränssnittet är halvvägs i den vertikala kolumnen och sätt sedan långsamt in en kontakt i porten.
- Lyft försiktigt pipetten från port 4, med den andra handen för att säkerställa att bilden förblir fast på plats. Slutligen, anslut långsamt port 4 (bild 3B).
- Inspektera cellgiftsrutschbanan på ett inverterat mikroskop.
OBS: De återstående vidhäftningscellerna i observationsområdet bör huvudsakligen vara makrofager. Detta kan bekräftas med fluorescerande taggade anti-F4/80 antikroppar (F4/80 är en specifik markör för mus makrofager). B-celler kan identifieras med hjälp av fluorescerande taggade anti-CD19 antikroppar och F4/80-/CD19- celler kan detekteras med hjälp av en blå fluorescerande nukleinsyra fläck (figur 4).
5. Bildkopalremigration av time-lapse, faskontrastmikroskopi
- Placera en chemotaxis bild på scenen i ett inverterat mikroskop utrustat med en sceninkubator. Håll temperaturen vid 37 °C.
- Bild 1 mm x 2 mm observationsområdet med hjälp av en 10x fas-kontrast objektiv lins och fokusera på makrofag lamellipodia: tunn, ark-liknande membran utsprång. Ta bilder för 14 h med en hastighet av 1 bildruta var 2 min.
6. Analys av time-lapse bilder
- Analysera time-lapse, fas-kontrast bilder med hjälp av automatiserad bildanalys programvara eller manuell spårning plugin, producerad av Fabrice P. Cordelières, för ImageJ.
OBS: Automatiserade spårningsprogram kan användas för att analysera celler som avbildas av antingen time-lapse, faskontrast eller fluorescensmikroskopi. Till exempel kan den Java-baserade programvaran iTrack4U som produceras av Cordelières et al.27 användas för automatisk cellspårning och analys med hjälp av time-lapse, faskontrast eller fluorescensbilder som indata. Manuell spårning är mer tidskrävande, men de spår som genereras av ImageJ plugin Manuell spårning kan importeras direkt och automatiskt analyseras av ImageJ plugin Chemotaxis och Migration Tool28,29.
Representative Results
Ett schematiskt diagram över den chemotaxis-bild som används för videomikroskopi av musperiferala makrofager som migrerar i en chemotactic gradient visas i figur 2A. Bilden innehåller tre chemotaxis kammare, som var och en har fyra fyllningsportar. Portarna kan stängas individuellt med hjälp av kontakterna som visas ovanför bilden. Alternativt kan ett icke-tätningslock placeras över en urkopplad port för att bibehålla steriliteten. Efter att portarna 1 och 4 har anslutits kan observationsområdet (1 mm brett x 2 mm långt x 70 μm högkanal som förbinder de två behållarna) mellan portarna 2 och 3 förfyllas med medium genom att placera en 15 μL droppe i port 3 och aspirera med en 2–20 μL volympipett vid port 2 (figur 2B). En suspension av musboende peritonealceller (10 x 106 celler/ml) såddes in i observationsområdet genom att placera en 10 μL droppe suspension i port 3 och långsamt aspirera i port 2 (figur 2C). En typisk bild av celler som sås i observationsområdet som tas av faskontrastmikroskopi med hjälp av en 10x objektiv visas i figur 2C. Efter inkubering i 2–3 timmar fylldes chemotaxis-rutschkanan långsamt med medium (figur 2D). Efter att ha anslutit portarna 1 och 2 injicerades mediet långsamt via port 3 tills det kom ut från port 4. Därefter byttes kontakten från port 1 till port 3, och sedan fylldes den andra behållaren genom att långsamt injicera medium via port 4 tills den uppstod vid port 1. I detta skede har celler i observationsområdet återinskats med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 2E). Genom att jämföra bilder strax före(figur 2C)och efter(figur 2E)fyllning av reservoarerna hade upp till två tredjedelar av cellerna tvättats ut ur observationsområdet. Generellt var svagt vidhäftande CD19+ celler (B1 celler) tvättas ut och de återstående cellerna var främst F4/80+ celler (makrofager). Detta visades genom fluorescensmikroskopi efter märkning av varje celltyp med fluorescerande märkta specifika antikroppar (figur 4). I figur 4A,nyligen isolerade mus bosatt bukhinnans celler var märkta med gröna fluorescerande fluoroforekonjugerade anti-F4/80 antikroppar och röda fluorescerande fluorofore-konjugerade anti-CD19 antikroppar och atomkärnor av celler var märkta med en blå fluorescerande nukleinsyra fläck. F4/80 är en specifik markör för mus makrofager30, medan CD19 är en B-cell markör. Figur 4B visar F4/80+ celler avbildade genom snurrande diskkonfocalmikroskopi i observationsområdet i en chemotaxiskammare. Cellerna var märkta efter en övernattning chemotaxis analys registreras av time-lapse, fas-kontrast mikroskopi.
Komplement C5a (chemoattractant) introducerades till en av de två reservoarerna genom att placera en 15 μL droppe medium som innehåller 0,54 μg/ml (rekombinant mus) komplement C5a och 10 μg/ml Patent Blue V i påfyllningsport 1 (figur 3A) efter att ha anslutit portar 2 och 3. Det chemoattractant mediet drogs långsamt in i behållaren genom långsam aspiration med en pipett via port 4. Figur 3B visar diffusionen av det blå färgämnet efter att ha dragit 15 μL-droppen till en reservoar. Patent Blue V användes som en indirekt visuell indikator på chemoattractant diffusion. Komplement C5a molekyler är betydligt större än patent blå V (9,0 kDa jämfört med 0,57 kDa) och diffusa långsammare. Efter diffusion av komplement C5a i behållaren var dess koncentration ~0,2 μg/ml (15 μL/40 μL [reservoarvolym] x 0,54 μg/ml = 0,2 μg/ml), motsvarande ~22,5 nM. En blygsamt brant lutning bildas över observationsområdet efter 3 h och fortsatte att öka, når en maximal på runt 12 h31. Figur 3C visar migreringsspåren för makrofager som migrerar i en komplementtonient lutning av C5a, mellan 6–12 timmar efter att du har lagt till cellgiftstraktanten. Cellhastighet och chemotactic effektivitet, indexerad som y-FMI (y-forward migration index; intervall: -1 till +1) och x-FMI, av enskilda makrofager beräknades från migrationsområden (figur 3D). Figur 3D visar också ett migreringsområde som produceras efter att startpunkten för varje migrationsspår har normaliserats till X = 0 och Y = 0 under rutområdena. Infällda i migreringsdiagrammet visar hur y-FMI beräknades för varje migreringsspår.
Figur 1: Arbetsflödet för chemotaxis-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Hantering av kemotaxisrutschbanor. (A)En 3D-vy av en chemotaxis-bild med fyra pluggar och fyra lock. Bilden innehåller tre chemotaxiskammare, som var och en består av två 40 μl reservoarer som förbinds med en 1 mm x 2 mm kanal, som är 70 μm hög, kallas observationsområdet. (B)Anslutningskanalen sträcker sig i båda ändar till att fylla portarna 2 och 3. Efter att ha satt i pluggar i påfyllningsportarna 1 och 4 förfylldes observationsområdet med medium (rött) genom att applicera en droppe medium till port 3 och aspirera i port 2 med en 10–200 μL pipettspets. Därefter applicerades lock på portarna 2 och 3 innan bilden ruvades vid 37 °C och förberedade cellupphängningen. C)Observationsområdet, där den kemoattractantriktade lutningen bildades, såddes med makrofager genom att tillämpa en 10 μL droppe musfasta peritonealceller i port 3 och långsamt aspirera i port 2. Rutschkanan inkuberades sedan i en fuktighetskammare vid 37 °C för 2–3 h. Den faskontrastbild som visas till höger, som erhållits via en 10x objektiv, visar peritonealceller efter sådd och inkubation vid 37 °C i 2 h. Skala bar = 500 μm.(D)Chemotaxis kammare fylldes med medium genom att ansluta portar 1 och 2 och sedan långsamt injicera medium via port 3 tills den uppstod i port 4. Långsam och stadig fyllning kan uppnås genom att vrida volyminställningsringen på en 20–100 μl volympipett. Efter att ha fyllt den första behållaren kan den andra behållaren fyllas genom att ansluta portarna 2 och 3 och sedan långsamt injicera medium i port 4 tills den dyker upp i port 1. E)Faskontrastbild av samma observationsområde som visas ovan(C)efter att de två behållarna fyllts på. Skalstång = 500 μm. Grafiska element från Elias Horn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Chemotaxis-analys. (A)Chemoattractant introducerades till en av de två reservoarerna i en cellgiftskammare genom att applicera en 15 μL droppe medium som innehåller 0,54 μg/ml komplement C5a och 10 μg/mL Patent Blue V på fyllningshamn 1, följt av långsam aspiration vid port 4. (B)Inledningsvis efter att ha dragits in i behållaren den blå, chemoattractant-innehållande medium hade en ungefär inverterad droppe form, och sedan långsamt spridas i hela behållaren. C)Migrationsspår för makrofager som migrerar i en kemoattractant (komplement C5a) lutning mellan 6–12 timmar efter att ha introducerat kemoattractant till en av reservoarerna. Lutningens riktning anges till höger. Slutet på varje migreringsspår indikeras av en fylld cirkel. DDBlox-områden med hastighet, x-FMI (x-forward migration index) och y-FMI (y-forward migration index), ett index över chemotactic effektivitet som varierar från -1 till +1. Data erhölls genom analys av 25 makrofagmigreringsspår. Makrofager i den nedre halvan av observationsområdet och visar förskjutning av minst en cellbredd över 6 h valdes slumpmässigt för analys. Nedan visas en intrig för migreringsspår efter att startpunkten har normaliserats till X = 0 och Y = 0. Chemotaxisindex (y-FMI) beräknades genom att dividera nettoförskjutningen längs Y-axeln (d) med migreringsvägens ackumulerade längd (l), vilket schematiskt visade. Grafiska element i panelerna A och B från Elias Horn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fluorescerande bilder av levande mus bosatta peritoneal celler som erhållits genom spinning disk confocal mikroskopi. (A)Förlängd fokusbild (ljusaste punktsammanfogningen av alla Z-plan) av nyligen isolerade musperononala celler märkta med gröna fluorescerande anti-F4/80 (makrofagmarkör) antikroppar, röda fluorescerande anti-CD19 (B-cellsmarkör) antikroppar och en blå fluorescerande nukleinsyrafläck. Skala stång = 10 μm. (B) Snapshot (enda Z-plan) av F4/80+ celler (makrofager) i observationsområdet i en chemotaxis kammare tas efter en natt chemotaxis analys. Celler var märkta med gröna fluorescerande anti-F4/80 antikroppar och en blå fluorescerande nukleinsyra fläck. Komplementet C5a och Patent Blue V lutningar tvättades ut av cellen märkning förfarande, vilket förklarar varför den övre behållaren i schematiska diagrammet av kemotaxis kammaren inte är blå. Skalstång = 10 μm. Grafiskt element från Elias Horn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Intravital imaging går tillbaka till 19th century och ger ett sätt att studera beteendet hos levande immunceller i sin naturliga miljö. Men även med dagens avancerade mikroskopi och genetiska tekniker är det svårt att studera cellernas svar på specifika kemoattractants in vivo. För att kringgå detta problem utvecklade Boyden18 Transwell-analyser på 1960-talet, men dessa slutpunktsanalyser gav inte visualisering av hur celler faktiskt migrerade mot kemoattractants, vilket gör det svårt att skilja kemokinesis, stimuleras slumpmässig migration av en kemisk cue32, och chemotaxis, migration mot högre koncentrationer av kemiska stimuli från varandra33. Detta problem löstes genom att utforma olika öppna kammare med en bro, vanligtvis 1 mm bred, belägen mellan två reservoarer och nås med en objektiv21,22,23. Tillämpa en inverterad täckslip, sådd med vidhäftande celler, stänger kamrarna och chemoattractant läggas till en av reservoarerna sprider sig över bron till den motsatta reservoaren, vilket skapar en koncentrationsgradient. Här beskriver vi en chemotaxis-analys med samma princip men med hjälp av en sluten kammare med fyra tankportar. Med hjälp av detta system och time-lapse, fas-kontrast mikroskopi, utvecklade vi en analys för att bild mus bosatt peritoneal makrofager migrera i en chemotactic komplement C5a gradient31,34,35,36. Denna analys, i kombination med knockout mus modeller, visat sig vara avgörande för undersökningen av roller olika Rho GTPases och motoriska proteiner i makrofag morfologi, motilitet, och chemotaxis31,34,35,36,37. Vi har också använt denna metod för att bilden mänskliga perifert blod monocyter migrera på en 2D-yta eller i en 3D kollagen typ I matris38. Dessutom är analysen lämplig för mus benmärg-härledda makrofager eller makrofager som härrör från villkorligt förevigade myeloiska prekursorceller39,40. Vi har tidigare använt polytetrafluoretenpåsar (PTFE) med lueradaptrar för att odla benmärgsceller och få makrofager34. Fördelen med PTFE påsar är att cellerna lätt kan återsuspenderas och klar för användning efter att ha placerat påsen på is i 20-30 min. Observera att vi förfylla chemotaxis slide observation området innan cellerna. Detta tillvägagångssätt har fördelen att oönskade luftbubblor kan spolas ut (med varierande framgång) och det försoakerade observationsområdet möjliggör långsam introduktion av en cellfjädring genom pipettering. Förfyllning ökar dock sannolikheten för att mediet delvis kommer att flöda in i en eller båda av de flankerande reservoarerna, vilket kommer att främja såddning av celler utanför observationsområdet. Alternativt kan cellupphängningen direkt ledas in i ett torrt observationsområde, men oönskade luftbubblor kan inte utvisas senare.
Den peritoneal hålighet av musen innehåller två huvudpopulationer av celler: F4/80+ makrofager och (mindre) CD19+ B-celler, i ett förhållande av ca 1:2 (Figur 4A). Dessa två cellpopulationer står för över 95% av bukhinnan hålighet celler, medan de återstående F4/80-/CD19- celler kan vanligtvis identifieras som CD11c+ celler (dendritiska celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svagt vidhäftande B-celler tvättas ut ur observationsområdet under fyllningen av reservoarerna med mediet (figur 2). Efter att ha lagt till chemoattractant till en av de två reservoarerna, time-lapse, fas-kontrast mikroskopi kan användas för att avbilda de återstående cellerna (makrofager) migrera i en framväxande chemoattractant gradient. Bildandet av komplementet C5a lutning i observationsområdet, via diffusion från en reservoar till den andra, kan simuleras med hjälp av en fluorescerande färgämne med liknande molekylvikt. Ett bra substitut för rekombinant mus komplement C5a (förutspådde molekylvikt, 9,0 kDa) är fluorescerande märkt dextran (10 kDa)31. Med hjälp av konfokalmikroskopi kan fluorescensgradienten i den smala kanalen (observationsområdet) som förbinder de två reservoarerna i cellgiftsbilden mätas med fasta intervall och koncentrationsprofiler vid de olika tidpunkterna kan ritas24,31. Vi lägger rutinmässigt till en nonfluorescent, blå färgämne (Patent Blue V) till chemoattractant medium för att ge en bekväm visuell indikator på diffusion och gradient bildning. Inom 1 h efter införandet av 15 μL blått, chemoattractant-innehållande medium i en reservoar, verkar behållaren jämnt blå och, enligt Ficks diffusionslagar, kommer en lutning att bildas över det smala observationsområdet som förbinder reservoarerna (figur 3B). Flera dagar krävs för att lösen (blått färgämne eller chemoattractant) ska bli jämnt fördelad.
Fluorescensmikroskopi kan ersättas med faskontrastmikroskopi, vilket ger fördelar för automatiserad cellspårning, eftersom fluorescerande märkta celler lätt kan skiljas från bakgrunden. En annan fördel är att specifika populationer av immunceller selektivt kan spåras efter märkning av ytmarkörer med fluorescerande antikroppar. Vi använde detta tillvägagångssätt för att avbilda humant perifert blod CD14+ celler (monocyter) migrera i en chemotaktisk fMLP (N-formylmetionin-leucyl-fenylalanin) gradient38. På samma sätt kan fluorescerande anti-F4/80 antikroppar användas för att avbilda mus makrofager migrera i ett chemotactic komplement C5a gradient. Fototoxicitet är en potentiell nackdel med att använda fluorescensavbildning41. Detta kan minskas med olika medel42, inklusive med fluorofores upphetsad med längre våglängder och lägga antioxidanter till mediet. Alternativt kan märkta celler initialt identifieras genom fluorescensmikroskopi och därefter avbildas av time-lapse, fas-kontrast mikroskopi. I praktiken kan dock celler som rör sig med måttligt låga hastigheter, såsom ~1 μm/min (makrofager) eller ~4 μm/min (monocyter), intermittent avbildas genom fluorescensmikroskopi med intervaller på minuter, vilket tolereras väl38. Vi använde tidigare fluorescensmikroskopi och chemotaxis slide beskrivs här för 3D chemotaxis analyser38,,43. I detta fall var båda reservoarerna förfyllda med medium och 15 μL chemoattractant-innehållande medium drogs in i en av reservoarerna omedelbart före långsamt pipetterande fluorescerande märkta celler upphängda i medium som innehåller kollagen typ I i observationsområdet. Den svåra delen av detta förfarande är hanteringen av kollagen typ I, som är koncentrerad till sur lösning. Kollagenlösningens pH måste neutraliseras genom tillsats av alkalisk lösning innan den iskalla kollagenlösningen blandas med cellfjädringen. Överföring av kollagencellblandningen till en inkubator vid 37 °C kommer att initiera kollagenpolymerisering. Under inkubationen ska bilden långsamt roteras runt sin långa axel så att cellerna förblir jämnt fördelade i riktningarna X-, Y- och Z-axeln medan kollagenet polymeriserar till en gel. En närstående sluten chemotaxis bild lämplig för 3D chemotaxis analyser, med sex pluggar i stället för fyra pluggar, har nyligen beskrivits29. Detta system gör det möjligt att föra in kollagencellblandningen i observationsområdet innan den självständigt fyller var och en av de flankerande reservoarerna, eftersom varje reservoar har två fyllningsportar, snarare än en enda port.
Sammanfattningsvis beskriver vi en realtid chemotaxis analys som gör det möjligt visualisering av celler navigera i en chemotactic gradient under en period av 6 eller fler timmar. Häri fokuserar vi på makrofager, som spelar stora roller i inflammatoriska sjukdomar men har varit underrepresenterade i realtid chemotaxis analyser jämfört med snabbare rörliga celler som neutrofiler och Dictyostelium amöba.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag (HA 3271/3-2) från DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I.
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
