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Bioengineering

लाइव और फंक्शनल म्यूरीन कॉकलियर हेयर सेल्स में डीएक्सट्रान लेबलिंग और तेज

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60769
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

यहां, हम कार्यात्मक मेचनोट्रांसडुक्शन चैनलों के साथ श्रवण हेयर कोशिकाओं में 3 केडीए टेक्सास रेड-लेबल ्ड्टिन के तेज की कल्पना करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा 3-10 केडीए के डेक्सट्रांस का इस्तेमाल बालों में एंडोसाइटोसिस का अध्ययन करने और कोर्टी के अंग की कोशिकाओं का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

हेयर सेल मेचनोट्रांसडुक्शन (मेट) चैनल सुनने में अहम भूमिका निभाता है। हालांकि, आणविक पहचान और MET की संरचनात्मक जानकारी अज्ञात रहते हैं । बालों की कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों से पता चला है कि मेट चैनल में एक बड़ा आचरण है और अपेक्षाकृत बड़े फ्लोरोसेंट कॉइनिक अणुओं के लिए permeable है, जिसमें कुछ स्टाइलिल रंग और टेक्सास रेड-लेबल अमीनोग्लिकोसाइड एंटीबायोटिक्स शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम कॉर्टी एक्सप्लांट्स के अंग की बालों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस की कल्पना और मूल्यांकन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कार्यात्मक मेट चैनलों के लिए परख करने के लिए किया जा सकता है। हमने पाया कि 3 केडीए टेक्सास रेड-लेबल ्ड्टिन विशेष रूप से 1-2 घंटे ऊष्मायन के बाद कार्यात्मक श्रवण बाल कोशिकाओं को लेबल करता है। विशेष रूप से, 3 केडीए dextran दो छोटे स्टीरियोसिलिया पंक्तियों लेबल और एक फैलाना पैटर्न में सेल शरीर में जमा जब कार्यात्मक MET चैनल मौजूद हैं । बाल कोशिकाओं और आसपास के सहायक कोशिकाओं के सेल शरीर में लेबलिंग का एक अतिरिक्त वेसिकल जैसा पैटर्न देखा गया था। हमारे डेटा का सुझाव है कि 3 केडीए टेक्सास-लाल dextran का उपयोग सेलुलर डाये तेज के लिए दो रास्तों की कल्पना और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है; कार्यात्मक मेट चैनलों और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से एक हेयर सेल-विशिष्ट प्रवेश मार्ग, एक पैटर्न भी बड़े dextran के लिए उपलब्ध है।

Introduction

भीतरी कान की बाल कोशिकाएं संवेदी कोशिकाएं हैं जो ध्वनि का पता लगाती हैं और विद्युत संकेतों में यांत्रिक रूप से उत्तेजनाओं को गुप्त करती हैं, जो अंततः हमारे मस्तिष्क द्वारा व्याख्या की जाती हैं। इन कोशिकाओं में एक ्सिन-आधारित फिलामेंट्स की तीन पंक्तियों का सीढ़ी के आकार का बंडल होता है, जिसे स्टीरियोसिलिया के नाम से जाना जाता है, जो उनके एपिकल क्षेत्र1,2से फैलता है। यांत्रिक उत्तेजनाओं सबसे लंबी पंक्ति की ओर स्टीरियोसिलिया फिलामेंट्स को मोड़ने और मेचनोट्रांसडुक्शन (MET)चैनलों 3के उद्घाटन को ट्रिगर करता है। मौसम चैनलों के उद्घाटन के लिए कोटेशन की आमद होती है जो कोशिका को ध्रुवीकृत करती है और इसके परिणामस्वरूप बाल कोशिका के बेसल क्षेत्र में सिनेप्स वेसिकल्स की रिहाई का संकेत देता है।

सुनवाई के लिए आवश्यक मेट चैनल के जैव भौतिक गुणों को बड़े पैमाने पर चित्रित किया गया है। अन्य गुणों में, ये चैनल कास्टिक चयनात्मक हैं और इसमें अपेक्षाकृत बड़ा आचरण (कम सीए2 +में 150-300 पीएस)4,5,6,7,8,9,10है। उल्लेखनीय है, एफएम 1-43 और टेक्सास रेड-लेबल वाले अमीनोग्लिकोसाइड्स जैसे बड़े फ्लोरोसेंट अणु मेट चैनल के परमतलब ब्लॉकर्स हैं, जिसके परिणामस्वरूप बाल कोशिका शरीर में उनका संचय होता है जिसे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी11,12,13,14का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। इसके विपरीत, आणविक पहचान और मौसम चैनल की संरचना और उसके पारगम्य मार्ग मायावी बने हुए हैं । प्रायोगिक साक्ष्य बढ़ने से पता चलता है कि ट्रांसमेम्ब्रेन जैसे चैनल प्रोटीन 1 (टीएमसी1) परिपक्व बाल कोशिकाओं15,16,17,18, 19में मेट चैनल का एक घटक है। ट्रांसमेम्ब्रेन जैसे चैनल 1 (टीएमसी1) में म्यूटेशन मेट चैनल गुणों को बदल देते हैं19,20,21,22 और बहरापन का कारण बनते हैं। इसके अलावा, टीएमसी1 मेट चैनल18,23 की साइट पर स्थानीयकरण करता है और मेट चैनल24,25को यांत्रिक बल को प्रसारित करने के लिए जिम्मेदार टिप-लिंक के साथ बातचीत करता है। इसके अलावा, हाल ही में बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण ने टीएमसी प्रोटीन को मेचानोसेंसिटिव चैनलों TMEM63/OSCA प्रोटीन और TMEM16 प्रोटीन से संबंधित विकासवादी के रूप में पहचाना है, कैल्शियम सक्रिय क्लोराइड चैनलों और लिपिड हाथापाई26,27,28के एक परिवार । इन प्रोटीनों के बीच संबंधों के आधार पर टीएमसी1 के एक संरचनात्मक मॉडल ने प्रोटीन-लिपिड इंटरफेस27पर एक बड़ी गुहा की उपस्थिति का खुलासा किया। यह गुहा दो टीएमसी1 म्यूटेशन को आश्रय देता है जो ऑटोसोमल प्रमुख सुनवाई हानि (डीएफएनए36)27,29,30,31,32और गुहा में अवशेषों के लिए साइस्टीन म्यूटेंट के चयनात्मक संशोधन का कारण बनता है, जो मेट चैनल गुणोंको 28में बदल देता है, यह दर्शाता है कि यह मेट चैनल के पार्मेशन मार्ग के रूप में कार्य कर सकता है। टीएमसी प्रोटीन में इस भविष्यवाणी गुहा के बड़े आकार के बड़े अणुओं की क्षमता की व्याख्या करने के लिए मिले चैनल तर सकता है । इस भविष्यवाणी का परीक्षण करने के लिए कि मेट चैनल में असामान्य रूप से बड़े पार्मेशन मार्ग शामिल हैं और टीएमसी1 में देखी गई गुहा के आकार की सीमाओं को धक्का देने के लिए, हमने एक बड़े अणु के साथ कॉर्टी एक्सप्लांट्स के अंग में तेज प्रयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, टेक्सास रेड के साथ 3 केडीए dextran फ्लोरोसेंटी लेबल।

Dextran अल्फा-1,6 ग्लाइकोसिडिक लिंकेज से बंधे कई डी-ग्लूकोज अणुओं से बना एक जटिल शाखाओं वाला पॉलीसैकराइड है। पानी में इसकी उच्च घुलनशीलता, कम सेल विषाक्तता, और बायोइनर्टिटी इसे कई सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण बनाती है। इसके अलावा, dextran आकार की एक विस्तृत श्रृंखला में उपलब्ध है और फ्लोरोसेंटी से कई रंगों के फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया जाता है। फ्लोरेसेंटी लेबल वाले डेक्सट्रांस का उपयोग आमतौर पर कोशिका और ऊतक पारगम्यता अनुसंधान33,34में किया जाता है , जो मल्टीपल सेलुलर सिस्टम35,36में एंडोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए और तंत्रिका अनुरेखण37,38के लिए होता है । श्रवण क्षेत्र में, कोर्टी39,40के चिंचिला अंग में तीव्र शोर के संपर्क में आने के बाद सेल-सेल जंक्शन के व्यवधान और श्रवण संवेदी एपिथेलियम अखंडता के नुकसान का आकलन करने के लिए ड्डिशन अणुओं का भी उपयोग किया गया है।

इस काम में, हमने कुछ सबसे छोटे (3 और 10 केडीए) फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस के गुणों का शोषण किया ताकि रिनरी इनर इयर हेयर सेल में तेज प्रयोग किए जा सके और आंतरिक कान बाल कोशिका मेट चैनल के पारमीशन मार्ग के आकार का पता लगाया जा सके। इसके अलावा, हमने स्टीरियोसिलिया में फ्लोरोसेंट ड्वेटन और श्रवण बाल कोशिकाओं के सेल शरीर की कल्पना और स्थानीयकरण करने के लिए एयरिकस्कैन डिटेक्टर से सुसज्जित लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएसएम) 880 का उपयोग किया।

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Protocol

पशु देखभाल और प्रायोगिक प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के बाद किया गया, जो पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया राष्ट्रीय तंत्रिका विज्ञान विकार और स्ट्रोक संस्थान (पशु प्रोटोकॉल केजेएस के #1336) ।

1. चूहे

  1. कूड़े की जन्म तिथि को नियंत्रित करने और पिल्ले की उम्र का ट्रैक रखने के लिए पशु सुविधा में नस्ल के लिए C57BL/6J जंगली प्रकार के प्रजनन जोड़े के एक जोड़े को सेट करें ।

2. कॉकले विच्छेदन

  1. विच्छेदन(चित्रा 1ए)करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के करीब एक साफ स्थान सेट करें। अंतरिक्ष और आसपास को साफ करने और एक साफ बेंच पैड रखने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। पशु शवों को त्यागने के लिए एक मेडिकल पैथोलॉजिकल वेस्ट (एमपीडब्ल्यू) प्लास्टिक बैग की आवश्यकता होगी।
  2. कुछ लीबोविट्ज के L15 मीडिया के साथ कई 35 मिमी व्यंजन तैयार करें।
    नोट: लीबोविट्ज के एल-15 सेल मीडिया में 1-2 एमएम सीए2 +होता है, जिसमें टिप-लिंक की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, और इसमें सेल स्वास्थ्य और अस्तित्व में सुधार करने के लिए आवश्यक अमीनो एसिड, विटामिन और सोडियम पायरुवेट शामिल हैं। सीरम को अपनी खराब परिभाषित संरचना और dextran के साथ संभावित हस्तक्षेप के कारण प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बचने के लिए बाहर रखा गया था ।
  3. मृत्युंतर-दिवस-6 (P6) चूहों को डेपुटेशन द्वारा इच्छामृत्यु दें।
    नोट: 6 दिन पुराने चूहों कुछ हद तक इनहेलेंट एनेस्थेटिक्स के लिए प्रतिरोधी हैं। यद्यपि isoflurane या लंबे समय तक सीओ2 एक्सपोजर (50 min तक) इच्छामृत्यु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मौत सुनिश्चित करने के लिए एक माध्यमिक भौतिक विधि की सिफारिश की जाती है।
  4. पूर्वकाल से पीछे के छोर तक और बाहरी श्रवण नहरों के पार सतही कट बनाकर खोपड़ी की त्वचा को हटाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
  5. कपाल(चित्रा 2बी)को बेनकाब करने के लिए त्वचा को नाक की ओर मोड़ें।
  6. खोपड़ी के सामने और आंख ों की रेखा के पार पीछे से चीरा बनाएं(चित्रा 2बी-सी)।
  7. खोपड़ी को दो हिस्सों में अलग करें और शंख हड्डियों(चित्रा 2सी-डी)को बेनकाब करने के लिए एक छोटे स्पैटुला के उपयोग के साथ मस्तिष्क को हटा दें।
  8. छोटी कैंची के साथ, लौकिक हड्डियों के चारों ओर काट, और ऊतक आबकारी।
  9. एक 35 मिमी पकवान में दोनों लौकिक हड्डियों प्लेस और सुनिश्चित करें कि वे L15 मीडिया(चित्रा 2ई)के साथ कवर कर रहे हैं ।
    नोट: निम्नलिखित कदम स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किए जाते हैं। एक काली पृष्ठभूमि आमतौर पर ठीक विच्छेदन चरणों के दौरान ऊतक की कल्पना करने में मदद करती है।
  10. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक वाइडफील्ड आईपीस (एक 10X आवर्धन शक्ति (WF10X) और एक बाहरी बारी वर्तमान (एसी) हैलोजन प्रकाश स्रोत से लैस है, आसपास के कॉकले ऊतक, अर्धवृत्ताकार नहरों, और सर्जिकल संदंश(चित्रा 2एफ)के साथ वेस्टिब्यूलर अंगों को हटा दें ।
  11. dextran और L15 मीडिया कॉकलियर वाहिनी में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए, विच्छेदित कॉकले पर दो पंचर सीमा प्रदर्शन, गोल खिड़की पर एक और एपीकल कॉकलियर क्षेत्र में अन्य।
  12. एक 9 अच्छी तरह से ग्लास अवसाद प्लेट से प्रत्येक अच्छी तरह से Leibovitz L15 मीडिया के ३०० mL जोड़ें ।
  13. प्रत्येक कुएं पर कम से कम तीन विच्छेदित कॉकले रखें।

3. ड्डिश्न लेबलिंग

  1. 10 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता पर सीए2 + और एमजी2 + (एचबीएस-सीएफएम) के बिना हैंक्स के संतुलित नमक समाधान में dextran का पुनर्गठन करें । इस स्टॉक समाधान को अपारदर्शी काली ट्यूबों (प्रकाश से संरक्षित) में बहाया जाना चाहिए और उपयोग तक -30 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के सफल परिणाम के लिए lysine-fixable dextran का उपयोग महत्वपूर्ण है।
  2. लीबोविट्ज के L15 मीडिया के 500 मिलीलीटर में 2 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता पर प्रत्येक dextran तैयार करें।
  3. cochlea से मीडिया को हटा दें और Leibovitz L15 मीडिया 2 मिलीग्राम/mL की एक अंतिम एकाग्रता पर ब्याज की dextran युक्त जोड़ें ।
    नोट: हालांकि मेट चैनलों का अनुपात बाकी41,42पर खुला है, लेकिन मौसम चैनल की खुली संभावना को बढ़ाने के लिए एक्सप्लांट्स के सौम्य झटकों के साथ dextran ऊष्मायन किया गया था।
  4. 25 डिग्री के झुका कोण के साथ 3-आयामी शेकर का उपयोग करके कोमल मिलाते हुए (25 आरपीएम) के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: फ्लोरोसेंटी लेबल dextran प्रकाश से जब संभव हो संरक्षित किया जाना चाहिए । 2 एच ऊष्मायन के दौरान dextran की रक्षा के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे एक सेल संस्कृति P150 पकवान के अंदर 9 अच्छी तरह से कांच की थाली जगह है ।

4. इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

  1. dextran के साथ ऊष्मायन के बाद, 2 मिन के लिए ऊतक दो बार मीडिया के साथ और एक बार HBSS के साथ धोलें।
  2. हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: फॉर्मलडिहाइड के संपर्क में आने से आंखों, नाक और ऊपरी श्वसन तंत्र को परेशान किया जा सकता है। कुछ व्यक्तियों में, फॉर्मलडिहाइड के लिए बार-बार त्वचा जोखिम से संवेदीकरण हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप एलर्जी त्वचा रोग हो सकता है। फॉर्मलडिहाइड एक ज्ञात मानव कैंसरकारक और एक संदिग्ध प्रजनन खतरा है।
  3. पैराफॉर्मलडिहाइड को हटाने के लिए एचबीएसएस के साथ दो बार फिक्स्ड टिश्यू को जल्दी और धीरे से धोएं।
    नोट: कॉकलिया के इस विकास के चरण में लौकिक हड्डियों के decalcification की जरूरत नहीं है ।
  4. सर्पिल स्नायु और टेक्टोरियाल झिल्ली को ठीक टिप के साथ हटा दें, जो कॉर्टी के अंग को विच्छेदन करने के लिए मजबूर करता है(चित्रा 2जी)।
  5. ऊतक के सभी छोटे टुकड़ों को हटा दें और ऊतक को एचबीएसएस से धोएं।
  6. फ्लोरोसेंटी-लेबल वाले फालोलाइडिन (टीआर-या फिटसी-लेबल ्ड्टिन के तेज का परीक्षण करते समय हरे या लाल रंग के लिए संयुग्मित) में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 में ऊतक को एफ-ऐक्टिन लेबल करने और कल्पना करने के लिए 30 टिन के लिए 1:200 कमजोर पड़ने पर ऐक्टिन आधारित स्टीरियोसिलिया।
  7. टिश्यू को 2-3 बार धोएं 2 मिन हर बार एचबीएसएस बफर के साथ ट्राइटन और फालोडिन की अधिकता को दूर करने के लिए और एक बार लवण को हटाने के लिए पीबीएस के साथ।
  8. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोर्टी ऊतकों के अंग माउंट और बढ़ते मीडिया के साथ कवर।
    नोट: ऊतक बढ़ते समय, सुनिश्चित करें कि बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया युक्त ऊतक के पक्ष कवरस्लिप का सामना करना पड़ रहा है।
  9. बढ़ते मीडिया के अलावा के दौरान उत्पन्न किसी भी संभावित बुलबुले को हटा दें और कवरस्लिप के प्लेसमेंट के दौरान नए बुलबुले की पीढ़ी को रोकें।
    नोट: बढ़ते मीडिया के अलावा के दौरान उत्पन्न किसी भी बुलबुले के साथ एस्पिरेट। कवरस्लिप के नीचे फंसने से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए, कवरस्लिप के एक किनारे को नमूने के करीब रखें और सावधानी से और धीरे-धीरे संदंश या पिपेट टिप का उपयोग करके ऊतक पर कवरस्लिप को कम करें।
  10. एक ग्लास कवरस्लिप(चित्रा 2एच)के साथ बढ़ते मीडिया में ऊतक को कवर करें ।
    नोट: 0.4 से ऊपर के न्यूमेरिकल एपर्चर वाले उद्देश्यों को #1.5 कवरस्लिप (0.17 मिमी मोटाई) का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। गलत कवरस्लिप का उपयोग करने से छवियों की तीव्रता और गुणवत्ता के लिए गंभीर निहितार्थ हो सकते हैं।
  11. बढ़ते मीडिया को सूखा जाने और स्लाइड्स को इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर घुड़सवार ऊतक को इनक्यूबेट करें।

5. छवि अधिग्रहण और छवि प्रसंस्करण

नोट: कॉन्फोकल छवियों को सुपर-रेजोल्यूशन (एसआर) मोड43 और 63x उद्देश्य में 32 चैनल एयरिकस्कैन डिटेक्टर से लैस एलएसएम 880 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था।

  1. उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक छोटी सी बूंद जोड़ें।
  2. विसर्जन तेल का सामना कर रहे ग्लास कवरस्लिप के साथ माइक्रोस्कोप चरण में घुड़सवार ऊतक नमूना युक्त माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें।
  3. नमूने पर ध्यान केंद्रित करें और इमेज अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग पैरामीटर सेट करें।
  4. प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए एक्स, वाई और जेड रिज़ॉल्यूशन के लिए समान छवि अधिग्रहण सेटिंग्स और इष्टतम मापदंडों का उपयोग करें। छवियों के जेड-स्टैक प्राप्त करते समय उद्देश्य को जल्दी और ठीक से स्थानांतरित करने के लिए एक पीजो-चालित फोकस सिस्टम की आवश्यकता होती है।
    नोट: बालों की कोशिकाओं के पूरे एपिकल क्षेत्र को छवि बनाने के लिए, इष्टतम सेटिंग्स का उपयोग करके स्टीरियोसिलिया से बालों की कोशिका शरीर के एपिकल हाफ तक छवियों का एक जेड-ढेर इकट्ठा करें। वेसिकल जैसे कणों की इमेजिंग को आश्वस्त करने के लिए हेयर सेल के साथ एक बड़े जेड-स्टैक को इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है।
  5. स्वचालित डिफ़ॉल्ट डेकोनोलुयूशन फिल्टर सेटिंग्स के साथ एयरिकस्कैन 3डी पुनर्निर्माण एल्गोरिदम का उपयोग करके कच्चे कॉन्फोकल छवियों को संसाधित करने के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  6. चमक और इसके विपरीत समायोजित करने के लिए एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में कॉन्फोकल छवियों को खोलें, स्केल बार जोड़ें, और अंतिम आंकड़ों के लिए छवियों का निर्यात करें।

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Representative Results

हमने 3 केडीए dextran फ्लोरोसेंटके साथ 3 केडीए dextran फ्लोरोसेंटली टेक्सास रेड (dextran-TR)(चित्रा 2ए-बी)के साथ लेबल किए गए जंगली प्रकार के प्रसवोत्तर-दिवस-6 (P6) चूहों से कॉर्टी एक्सप्लांट्स के अंग के 2h ऊष्मायन के बाद बालों की कोशिकाओं की मजबूत और विशिष्ट लेबलिंग देखी। कोर्टी के अंग के बेसल, मध्य और एपिकल क्षेत्रों(चित्रा 2बी)में आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाओं (आईएचसी और ओएचसी) दोनों में Dextran लेबलिंग देखी गई।

फ्लोरोसेंटी लेबल वाले फालोलाइड का उपयोग फिलालॉयडिन का उपयोग फिलामेंटरस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) को प्रतिदाग बनाने और ऐक्टिन-आधारित हेयर सेल स्टीरियोसिलिया की कल्पना करने के लिए किया गया था। हमने छोटे ऊष्मायन समय में भी इसी तरह के प्रयोग किए, और यद्यपि हमने बाल कोशिका शरीर में dextran-TR संचय देखा, संकेत 2 एच ऊष्मायन(चित्रा 2सी)की तुलना में कमजोर और अधिक परिवर्तनशील थे।

हम अगले दोनों स्टीरियोसिलिया और बाल कोशिकाओं के सेल निकायों की छवि और देखा कि केवल उन कोशिकाओं है कि उनके सेल शरीर में 3 केडीए dextran-TR शामिल उनके स्टीरियोसिलिया(चित्रा 3ए)के फ्लोरोसेंट लेबलिंग दिखाया । स्टीरियोसिलिया और सेल बॉडी लेबलिंग के बीच यह संबंध क्षतिग्रस्त ऊतकों से बालों की कोशिकाओं में अनुपस्थित था, जिसने संवेदी एपिथेलियम (चित्रा 2बीमें पीले वर्ग, और चित्रा 3बी)के कई सेल प्रकारों में dextran की अविशिष्ट लेबलिंग भी प्रस्तुत की। महत्वपूर्ण बात, हमने स्टीरियोसिलिया के साथ एक समान फ्लोरेसेंस संकेत देखा, जिसमें छोटी स्टीरियोसिलिया पंक्तियों के सुझावों पर संवर्धन किया गया था जहां मेट चैनल18,23 (चित्रा 3सी)स्थित है। इसके अलावा, हमने बालों की कोशिकाओं और पड़ोसी सहायक कोशिकाओं के सेल शरीर में वेसिकल जैसी संरचनाओं को देखा। इन कोशिकाओं में तेज के वेसिकल जैसे पैटर्न से पता चलता है कि dextran-TR भी एंडोसाइटोसिस(चित्रा 3सी)द्वारा लिया जा सकता है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी बड़े डेक्सट्रांस और विभिन्न डेक्सट्रांस के संयोजन के तेज की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। टेक्सास रेड (dextran-TR) या फ्लोरेसिन (dextran-FITC) के साथ लेबल 10 केडीए के बड़े dextran भी बाल कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं के सेल शरीर में एक vesicle की तरह पैटर्न का उत्पादन किया, एक बद पैटर्न में बाल कोशिका झिल्ली के आसपास जमते के अलावा(चित्रा 4ए, बी)। 10 केडीए dextran-TR ने भी सभी बालों की कोशिकाओं(चित्र4ए,इनसेट) की तीन स्टीरियोसिलिया पंक्तियों को सतही रूप से लेबल किया, शायद बाल कोशिका प्लाज्मा झिल्ली44,45,46की नकारात्मक आवेशित सतह के कारण। हमने अगले कोर्टी एक्सप्लांट्स के अंग में 3 केडीए डीएक्सटन-टीआर और 10 केडीए डीएक्सटन-फिट्सी सी के तेज की जांच की। 3 केडीए dextran-TR के लिए, हमने एक डिफ्यूज और वेसिकल जैसे पैटर्न दोनों को देखा। हालांकि, 10 केडीए dextran-FITC केवल एक vesicle की तरह पैटर्न(चित्रा 4सी)प्रदर्शित किया । इन आंकड़ों से पता चलता है कि dextran तेज कम से कम दो अलग तंत्र है कि dextran के आकार पर निर्भर कर रहे है द्वारा होता है ।

हमने आगे यह आकलन किया कि क्या 3 केडीए dextran-TR के तेज के लिए कार्यात्मक मेट चैनलों की आवश्यकता थी । ऐसा करने के लिए, हमने मेट चैनल ब्लॉकर्स (नियोमाइसिन और एमिलोराइड)13,14,47 या सीए2 + चेलेटर बपीटीए की उपस्थिति में कोर्टी एक्सप्लांट्स के अंग से बाल कोशिकाओं में dextran निगमन का परीक्षण किया, जो टिप-लिंक को तोड़कर और चैनल25,48,49के गेटिंग को रोककर मेट धाराओं को समाप्त करता है। इन प्रयोगों में, ऊतक एक्सप्लांट को पहले नियोमाइसिन (500 एमएम), एमिलोराइड (150 एमएम) के साथ 30 मिन के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था, या इसी मेट ब्लॉकर की उपस्थिति में 3 केडीए dextran-TR के अलावा से पहले बपतिस्मा (5m) के साथ। बपतिटा या मेट चैनल ब्लॉकर्स की उपस्थिति ने स्टीरियोसिलिया लेबलिंग(चित्रा 5ए)और हेयर सेल में 3 केडीए डीएक्सटीएन-टीआर के तेज(चित्र 5बी)को रोका। हालांकि, मेट चैनल की नाकाबंदी ने वेसिकल जैसे पैटर्न(चित्रा 5बी)को संरक्षित किया, जो यह दर्शाता है कि तेज का यह पैटर्न कार्यात्मक मेट चैनलों से स्वतंत्र है। इसी तरह के परिणाम TMC1/TMC2 डबल नॉक आउट चूहों, जो27से मिले कमी से बाल कोशिकाओं में देखा गया है । दिलचस्प बात यह है कि ये वेसिकल जैसी संरचनाएं एमिलोराइड की उपस्थिति में नमूदार नहीं थीं, जो एनए+-एच+ एक्सचेंजर को बाधित करने के लिए जानी जाती हैं और इस तरह एंडोसाइटोसिस50,51को रोकती हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि 3kDa dextran-TR दो अलग-अलग रास्तों के माध्यम से बाल कोशिकाओं में प्रवेश करता है, एक आम से बड़े डेक्सट्रांस के लिए वेसिकल जैसी संरचनाएं और दूसरा जो कार्यात्मक मेट चैनलों पर निर्भर करता है।

Figure 1
चित्रा 1: कोर्टी के एक मूत्र अंग के विच्छेदन के कदम। (A)विच्छेदन के लिए आवश्यक स्वच्छ क्षेत्र और सामग्री। (ख)उजागर माउस कपाल। संदंश त्वचा को पकड़ रहे हैं, जो नाक की ओर मुड़ा हुआ है। काली रेखाएं मस्तिष्क को हटाने के लिए आवश्यक दो चीरों का संकेत देती हैं। (ग)एक स्पैटुला (दाईं ओर) के साथ मस्तिष्क को हटाने की अनुमति देने के लिए कपाल का चीरा और खोला गया। (D)मस्तिष्क हटाने के बाद कपाल और लौकिक हड्डियां। (ई)मीडिया से ढकी एक P35 प्लेट में लौकिक हड्डियों (धराशायी काले वर्गों) सहित उत्पादित खोपड़ी। (एफ)एक्साइजड कॉकले। (जी)एक ग्लास अवसाद प्लेट के कुएं पर कोर्टी के दो विच्छेदित अंग । (एच)इमेजिंग के लिए तैयार ग्लास कवरस्लिप पर घुड़सवार नमूना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बाल कोशिकाओं को तेज 3 केडीए dextran-TR । (A)टेक्सास रेड-लेबल ्ड्ट्रिन (dextran-TR) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसमें ग्लूकोज के छह अणु 1.08 केडीए के आणविक वजन के अनुरूप होते हैं। एक संक्षिप्त ियद एस्टर प्रतिक्रिया एक ग्लूकोज मोनोमर के लिए एक टेक्सास लाल अणु (मजेंटा) लिंक । (ख)प्रतिनिधि confocal छवि एक 6 दिन पुराने माउस से Corti के पूरे अंग भर में 3 केडीए dextran-TR के साथ संवेदी बाल कोशिकाओं (एचसी) की विशिष्ट लेबलिंग दिखा । बेसल (बीए), मिडिल (एमडी), और ऑर्गन के एपिकल (एपी) क्षेत्रों को इंगित किया जाता है। पीले वर्ग ऊतक क्षतिग्रस्त क्षेत्रों का संकेत देते हैं। (C)30, 60, 90 के बाद 3 केडीए dextran-TR फ्लोरेसेंस, या कोर्टी एक्सप्लांट्स के अंग के साथ 120 मिन इन्विटेशन को मजेंटा में हरे (शीर्ष छवियों) में एफ-ऐक्टिन के साथ विलय किया गया है और स्वतंत्र रूप से ग्रेस्केल (नीचे छवियों) में दिखाया गया है। इमेज डिस्प्ले रेंज को 3 केडीए डीएक्सट्रान-टीआर फ्लोरेसेंस के दृश्य के लिए स्वतंत्र रूप से ग्रे छवियों में से प्रत्येक में समायोजित किया गया था। स्केल बार = 20 मिमी। इस आंकड़े को27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हेयर सेल बॉडी और स्टीरियोसिलिया लेबलिंग 3 केडीए dextran-TR के साथ। (A)सेल बॉडी में 3 केडीए डीएक्सटन-टीआर फ्लोरेसेंस (मजेंटा) प्रदर्शित करने वाली कॉन्फोकल छवियां और हेयर सेल सीमाओं और स्टीरियोसिलिया की कल्पना करने के लिए एफ-ऐक्टिन (ग्रीन) लेबल करने के लिए फलोइडिन के साथ प्रतिदागित स्टीरियोसिलिया। बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC) की तीन पंक्तियों और आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) की एक पंक्ति इंगित की जाती है। स्केल बार = 20 मिमी(बी)कोशिका शरीर और स्टीरियोसिलिया में 3 केडीए डीएक्सटन-टीआर फ्लोरेसेंस (मजेंटा) प्रदर्शित करने वाले क्षतिग्रस्त ऊतक क्षेत्र की कॉन्फोकल छवियां। पीले तीर गैर संवेदी सहायक कोशिकाओं की लेबलिंग का संकेत देते हैं। स्केल बार = 20 मिमी (सी)सेल शरीर में 3 केडीए dextran-TR फ्लोरेसेंस और बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC, शीर्ष) और आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी, नीचे) के स्टीरियोसिलिया के करीब देखें। स्केल बार = 5 मिमी। इस आंकड़े को27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: बड़े 10 केडीए dextran की लेबलिंग और 3 और 10 केडीए dextran का संयोजन । (A)हेयर सेल बॉडी (टॉप) और स्टीरियोसिलिया (बॉटम) स्तरों पर बालों की कोशिकाओं की कॉन्फोकल छवि 10 केडीए dextran-TR के साथ इनक्यूबेटेड है । dextran फ्लोरेसेंस सिग्नल को ग्रेस्केल में हरे और स्वतंत्र रूप से एफ-ऐक्टिन के साथ विलय किए गए मजेंटा में दिखाया गया है। आईएचसी के एक जोड़े को इनसेट में उच्च आवर्धन पर दिखाया गया है ताकि 10 केडीए dextran-TR के साथ मनाए गए स्टीरियोसिलिया के सतही लेबलिंग की सराहना की जा सके। स्केल बार = 5 मिमी.(बी)10 केडीए dextran-FITC के साथ इनक्यूबेटेड बालों की कोशिकाओं की Confocal छवि ए(सी)बाल सेल शरीर (शीर्ष) और स्टीरियोसिलिया (नीचे) स्तर पर बाल कोशिकाओं की Confocal छवि के रूप में प्रतिनिधित्व 3 केडीए dextran-TR और 10 kda dextran-FITC और स्वतंत्र चैनलों का उपयोग कर छवि और अलग से चित्रित सही पैनल में एफ-ऐक्टिन (ब्लू), 10 केडीए डीएक्सटीन-फिटेक (ग्रीन), और 3 केडीए डीडीए-टीआर (मजेंटा) को फालोडिन (ब्लू) के साथ एक साथ दिखाया गया है। स्केल बार = 20 मिमी, और तेज के वेसिकल जैसे पैटर्न पीले तीर के साथ इंगित किया जाता है। इस आंकड़े को27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 3 केडीए dextran-TR तेज के लिए कार्यात्मक मेट चैनलों की आवश्यकता होती है। बपीटीए या मेट चैनल ब्लॉकर्स एलोराइड और नियोमाइसिन की अनुपस्थिति (नियंत्रण) या उपस्थिति में 3 केडीए डीएक्सटन-टीआर के साथ ऊष्मायन के बाद स्टीरियोसिलिया(ए)या सेल बॉडी(बी)स्तर पर बालों की कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। मजेंटा में 3 केडीए डीएक्सट्रान-टीआर फ्लोरेसेंस दिखाया गया है। ऊतक को बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया और सीमाओं (हरे) के दृश्य के लिए एफ-ऐक्टिन लेबल करने के लिए फालोडिन िन के साथ प्रतिदागित किया गया था। सफेद तीर वेसिकल जैसी संरचनाओं की ओर इशारा करते हैं। बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC) की तीन पंक्तियों और आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) की एक पंक्ति इंगित की जाती है, स्केल बार = 20 मिमी। इस आंकड़े को27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में 3 केडीए dextran टेक्सास रेड के साथ कोर्टी एक्सप्लांट्स के मूत्र अंग में तेज प्रयोग करने का वर्णन किया गया है। इस विधि का लक्ष्य यह परीक्षण करना है कि क्या पहले परीक्षण किए गए अन्य लोगों की तुलना में बड़े अणु विशेष रूप से श्रवण बाल कोशिकाओं को लेबल करने और मेट चैनल के माध्यम से रिस करने में सक्षम थे। इसी तरह के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग पहले अन्य फ्लोरोसेंट रंगों जैसे एफएम1-43 (0.56 केडीए)12,19,20 और टेक्सास रेड-लेबल अमीनोग्लिकोसाइड्स (1.29-1.43 केडीए)13,52में बालों की कोशिकाओं की परगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। इन फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग कर के बाल कोशिकाओं लेबलिंग के लिए आवश्यक समय उनके आकार के साथ बदलता रहता है । अधिकतम लेबलिंग FM1-43 13, ५३, टेक्सास रेड लेबल aminoglycosides13के लिए FM1-4313,५३,30-60 मिनट के लिए कुछ मिनट की आवश्यकता है, और टेक्सास रेड लेबल 3 केडीए dextran के लिए १.५ घंटे । इस प्रकार, लंबे ऊष्मायन समय इस प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि हमने कम ऊष्मायन समय(चित्रा 2सी)पर बाल कोशिका शरीर की केवल न्यूनतम लेबलिंग देखी थी। हमने इन प्रयोगों के लिए P6 चूहों का अध्ययन करने का फैसला किया क्योंकि, इस उम्र में, अधिकांश एपिकल और बेसल बाल कोशिकाएं ट्रांसड्यूक्शन धाराएं ले जाती हैं और टीएमसी1 और टीएमसी2 प्रोटीन12,18,54,55दोनों व्यक्त करती हैं। छोटे जानवरों का अध्ययन करना संभव होना चाहिए क्योंकि मेट धाराएं पी 6 से पहले मौजूद हैं, विशेष रूप से कॉकलिया12के आधार के पास। पुराने जानवरों का अध्ययन अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि बोनी कॉकललिया का विच्छेदन अधिक कठिन हो जाता है क्योंकि यह संरचना56को सफ़ेद करती रहती है .

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे महत्वपूर्ण एक सफल विच्छेदन और कोर्टी ऊतक(चित्रा 1)के अंग की तैयारी जा रहा है । बोनी कॉकललिया में कोर्टी और एनकेशमेंट के अंग की नाजुक संरचना हिस्टोलॉजिकल और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है। इस ऊतक के सफल विच्छेदन के लिए कई विस्तृत प्रोटोकॉल पहले इस पत्रिका56,57,58 और अन्य59में प्रकाशित किए गए हैं . सेल-सेल जंक्शन के व्यवधान और श्रवण संवेदी एपिथेलियम अखंडता के नुकसान से 40 केडीए तक के डीडीई के डीएक्सट्रान का तेज हो सकता है और प्रभावित कोशिकाओं की लेबलिंग39,40हो सकती है। इसके साथ समझौते में, हमने बालों की कोशिकाओं और आसपास की सहायक कोशिकाओं की अविशिष्ट लेबलिंग देखी जब ऊतक अनजाने में डिटॉन्व इन्क्यूबेशन(चित्रा 2बी और चित्रा 3बी)से पहले विच्छेदन के दौरान संदंश के साथ क्षतिग्रस्त हो गया था। अभ्यास और धैर्य के अलावा कॉर्टी के अक्षुण्ण अंग को विच्छेदन करने में प्रवीणता तक पहुंचने के लिए कोई चाल या दिशानिर्देश नहीं हैं। हालांकि, ऊतक विच्छेदन और तेज प्रयोगों के दौरान 1-2 mM Ca2 + की उपस्थिति टिप-लिंक की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है जो यांत्रिक बल को मेट चैनल तक पहुंचाती है और इस तरह मेट चैनल फ़ंक्शन को संरक्षित करती है। एक बार ऊतक 4% पीएफए के साथ तय हो जाता है, बफर या मीडिया में कैल्शियम की उपस्थिति तुच्छ हो जाती है।

इस अध्ययन की सीमाओं में से एक dextran अणुओं की विषम प्रकृति में रहता है। ल्यूकोनोस्टोक बैक्टीरिया द्वारा सविस्तार किया गया dextran लगभग 95% अल्फा-(1-6) डी-लिंकेज(चित्रा 2ए)से बना निर्जलग्लूकोज का बहुलक है। शेष लिंकेज dextran की शाखाओं के लिए खाते हैं, जो इसकी लंबाई से संबंधित है, इसलिए कम आणविक वजन का dextran अधिक रॉड की तरह है और एक संकरा आकार वितरण है जबकि बड़ा डेक्सट्रांस पॉलीडिस्ग्रेग60हैं। इसलिए, 3 केडीए डीएक्सटीएन की प्रत्येक तैयारी में अणुओं का वास्तविक आणविक वजन 1.5 से 3.0 केडीए तक होता है, जिसमें फ्लोरोसेंट अणु61 शामिलहैं। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंटी लेबल dextran dextran (लेबलिंग की डिग्री) से जुड़े टेक्सास लाल अणुओं की संख्या में अलग है । कम से कम 0.4 की लेबलिंग की डिग्री के साथ dextran का उपयोग करने की सलाह दी जाती है क्योंकि लेबलिंग की कम डिग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंटी लेबल वाले ड्वैट्रिन का पता लगाने की क्षमता में बाधा उत्पन्न करेगी। फ्लोरोसेंट डाये के साथ-साथ डएक्सटीन और फिक्सेबल संस्करणों में लाइसेन अवशेषों को जोड़ा गया है, जो dextran के समग्र शुल्क का निर्धारण करेगा। यह एक महत्वपूर्ण विचार है क्योंकि मौसम चैनल की कांटिक चयनात्मकता अधिमानतः27को तेज करेगी । अंत में, इन प्रयोगों में प्रदर्शित संकल्प तक पहुंचने के लिए एक लाइन-फिक्सेबल dextran आवश्यक है। एक गैर-फिक्सेबल dextran अपने सटीक स्थानीयकरण और दृश्य में बाधा ऊतक में फैलाना जारी रखेगा।

एक एयरिकस्कैन डिटेक्टर से लैस एलएसएम 880 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो कॉर्टी नमूनों के अंग को छवि देने के लिए उपयोग किया जाता है, ने हमें दो बार संकल्प प्रदान किया, और एक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप62की तुलना में बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) प्रदान किया। इसलिए, इस माइक्रोस्कोप ने हमें न केवल सेल शरीर पर मजबूत dextran संचय का निरीक्षण करने की अनुमति दी बल्कि स्टीरियोसिलिया टिप्स और सेल शरीर में वेसिकल जैसे पैटर्न पर dextran के संचय को इंगित करने की भी अनुमति दी। एक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कोशिका शरीर पर फ्लोरोसेंट ड्वेटन के संचय के दृश्य और मात्राकरण की अनुमति देगा, लेकिन स्टीरियोसिलिया की तीन पंक्तियों और छोटे स्टीरियोसिलिया पंक्तियों के सुझावों पर dextran के सटीक स्थानीयकरण को अलग करना मुश्किल होगा। एलएसएम 880 एयरिकस्कैन कॉन्फोकल के साथ हासिल किए गए एक समान संकल्प को ओवरसैंपलिंग और डेकोनोवोलुशन के साथ एक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पहुंचा जा सकता है, हालांकि एसएनआर एयरिकस्कैन डिटेक्टर के साथ पहुंचने वाले से कम होगा।

कार्यात्मक मेट चैनलों के लिए परख के लिए 3 केडीए dextran-TR के उपयोग के अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग बालों की कोशिकाओं में एंडोसाइटिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि सभी डेक्सट्रांस परीक्षण से एंडोसाइटोसिस जैसी एक इंट्रासेलुलर वेसिकल जैसी पैटर्न का पता चलता है। यह प्रक्रिया हमारे काम का ध्यान केंद्रित नहीं थी, और इस घटना को पूरी तरह से चित्रित करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण में सहायता करने के लिए NICHD माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग कोर से विंसेंट श्राम को धन्यवाद देते हैं, और कॉलोनी प्रबंधन और चूहों की देखभाल के साथ अमूल्य मदद के लिए टीएसजी-हुई चांग। इस शोध को NINDS, NIH, बेथेस्डा, एमडी के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा केजे एस एबी को एनआईडीडीएस, एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम और इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम से रॉबर्ट वेनहोल्ड पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । एनआईडीसीडी की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

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Ballesteros, A., Swartz, K. J.… More

Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).

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