Summary
Aquí, presentamos un método para visualizar la toma de 3 kDa Texas Red-labeled dextran en células vellosas auditivas con canales funcionales de mechanotransducción. Además, dextrans de 3-10 kDa se puede utilizar para estudiar la endococitosis en el cabello y las células de soporte del órgano de Corti.
Abstract
El canal de mecanotransducción de células pilosas (MET) desempeña un papel importante en la audición. Sin embargo, la identidad molecular y la información estructural del Met siguen siendo desconocidas. Los estudios electrofisiológicos de las células pilosas revelaron que el canal MET tiene una gran conductividad y es permeable a moléculas catiónicas fluorescentes relativamente grandes, incluyendo algunos tintes de estilo y antibióticos aminoglucósidos etiquetados en rojo de Texas. En este protocolo, describimos un método para visualizar y evaluar la absorción de dextrans fluorescente en células pilosas del órgano de explantas Corti que se puede utilizar para realizar ensayos para canales MET funcionales. Encontramos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran específicamente etiqueta células capilares auditivos funcionales después de 1–2 h de incubación. En particular, 3 kDa dextran etiqueta las dos filas de estereocilia más cortas y se acumula en el cuerpo celular en un patrón difuso cuando los canales MET funcionales están presentes. Se observó un patrón adicional similar a la vesícula de etiquetado en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de soporte circundantes. Nuestros datos sugieren que 3 kDa Texas-Red dextran se puede utilizar para visualizar y estudiar dos vías para la aceptación del tinte celular; una ruta de entrada específica de células capilares a través de canales MET funcionales y endocitosis, un patrón también disponible para mayor demás.
Introduction
Las células pilosas del oído interno son las células sensoriales que detectan el sonido y encubren los estímulos mecánicos en las señales eléctricas, que en última instancia son interpretadas por nuestro cerebro. Estas células tienen un haz en forma de escalera de tres filas de filamentos a base de actina, conocidos como estereocilia, que sobresalen de su región apical1,2. Los estímulos mecánicos desvían los filamentos estereocilia hacia la fila más larga y activan la apertura de los canales3de mechanotransducción (MET). La apertura de los canales MET conduce a una afluencia de cationes que despolariza la célula y, en consecuencia, señala la liberación de vesículas de sinapsis en la región basal de la célula pilosa.
Las propiedades biofísicas del canal MET esenciales para la audición se han caracterizado ampliamente. Entre otras propiedades, estos canales son selectivos catiónicos y tienen una conductancia relativamente grande (150–300 pS en Ca2+bajo)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandes moléculas fluorescentes como FM1-43 y aminoglucósidos etiquetados con Texas Red son bloqueadores permeantes del canal MET, lo que resulta en su acumulación en el cuerpo de la célula pilosa que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia11,12,13,14. Por el contrario, la identidad molecular y la estructura del canal MET y su vía de permeación han permanecido esquivas. El aumento de la evidencia experimental indica que la proteína canal transmembrana 1 (TMC1) es un componente del canal MET en células pilosas maduras15,16,17,18,19. Las mutaciones en el canal transmembrana 1 (TMC1) alteran las propiedades del canal MET19,20,21,22 y causan sordera. Además, TMC1 localiza el sitio del canal MET18,23 e interactúa con el enlace de punta responsable de transmitir la fuerza mecánica al canal MET24,25. Además, el reciente análisis bioinformático ha identificado las proteínas TMC como evolutivas relacionadas con los canales mecanosensibles TMEM63/OSCA y las proteínas TMEM16, una familia de canales de cloruro activados por calcio y escramblas de lípidos26,27,28. Un modelo estructural de TMC1 basado en la relación entre estas proteínas reveló la presencia de una gran cavidad en la interfaz proteína-lípido27. Esta cavidad alberga las dos mutaciones TMC1 que causan pérdida auditiva autosómica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, y la modificación selectiva de mutantes de cisteína para residuos en la cavidad alteran las propiedades del canal MET28, lo que indica que podría funcionar como la vía de permeación del canal MET. El gran tamaño de esta cavidad pronosticada en proteínas TMC podría explicar la capacidad de las moléculas grandes para impregnar el canal MET. Para probar la predicción de que el canal MET contiene una vía de permeación inusualmente grande y para empujar los límites del tamaño de la cavidad observado en TMC1, desarrollamos un protocolo para realizar experimentos de absorción en el órgano de Corti explantes con una molécula más grande, 3 kDa dextran fluorescente etiquetado con Texas Red.
Dextran es un polisacárido ramificado complejo compuesto por muchas moléculas de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,6. Su alta solubilidad en agua, baja toxicidad celular y bioinertidad lo convierten en una herramienta versátil para estudiar varios procesos celulares. Además, dextran está disponible en una amplia gama de tamaños y etiquetado fluorescentemente con fluoróforos de varios colores. El dextrans etiquetado fluorescentemente se utiliza comúnmente en la investigación de permeabilidad celular y tisular33,34, para estudiar la endoctitosis en múltiples sistemas celulares35,36, y para el rastreo neural37,38. En el campo auditivo, las moléculas de desnción también se han utilizado para evaluar la interrupción de la unión celular-célula y la pérdida de la integridad del epitelio sensorial auditivo después de la exposición al ruido intenso en el órgano chinchilla de Corti39,40.
En este trabajo, aprovechamos las propiedades de algunos de los dextrans fluorescentes más pequeños (3 y 10 kDa) para realizar experimentos de absorción en células pilosas del oído interno murina y explorar el tamaño de la vía de permeación del canal MET de la célula del cabello del oído interno. Además, utilizamos un microscopio confocal de escaneo láser (LSM) 880 equipado con un detector Airyscan para visualizar y localizar el deextrano fluorescente en la estereocilia y el cuerpo celular de las células vellosas auditivas.
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Protocol
El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio, que fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Protocolo Animal #1336 a KJS).
1. Ratones
- Establecer un par de parejas reproductoras de tipo salvaje C57BL/6J para reproduciren en las instalaciones de animales para controlar la fecha de nacimiento de las camadas y realizar un seguimiento de la edad de los cachorros.
2. Disección de Cochleae
- Establezca un espacio limpio cerca de un estereomicroscopio para realizar las disecciones(Figura 1A). Utilice 70% de etanol para limpiar el espacio y los alrededores y colocar una almohadilla de banco limpia. Se necesitaría una bolsa de plástico de desechos patológicos médicos (MPW) para desechar las canales de los animales.
- Prepare varios platos de 35 mm con algunos medios L15 de Leibovitz.
NOTA: El medio celular L-15 de Leibovitz contiene 1–2 mM Ca2+, que se requiere para mantener la integridad de los enlaces de punta, y contiene aminoácidos esenciales, vitaminas y piruvato de sodio para mejorar la salud y la supervivencia celular. El suero fue excluido para evitar la variabilidad experimental debido a su composición mal definida y a la interferencia potencial con el dextran. - Eutanasia ratones postnatal-día-6 (P6) por decapitación.
NOTA: Los ratones de 6 días de edad son algo resistentes a los anestésicos inhalantes. Aunque se pueden utilizar exposiciones prolongadas de CO2 o isoflurano (hasta 50 min) para la eutanasia, se recomienda un método físico secundario para garantizar la muerte. - Utilice tijeras quirúrgicas para extraer la piel del cráneo haciendo un corte superficial desde el extremo anterior al posterior y a través de los canales auditivos externos.
- Doblar la piel hacia la nariz para exponer el cráneo(Figura 2B).
- Haga una incisión desde la parte posterior hasta la parte frontal del cráneo y a través de la línea del ojo(Figura 2B-C).
- Separar el cráneo en dos mitades y eliminar el cerebro con el uso de una pequeña espátula para exponer los huesos temporales(Figura 2C-D).
- Con tijeras pequeñas, cortar alrededor de los huesos temporales, e extirpar el tejido.
- Coloque ambos huesos temporales en un plato de 35 mm y asegúrese de que estén cubiertos con medios L15(Figura 2E).
NOTA: Los siguientes pasos se realizan bajo el estereomicroscopio. Un fondo negro generalmente ayuda a visualizar el tejido durante los pasos de disección fina. - Bajo un estereomicroscopio equipado con un ocular de campo ancho (una potencia de aumento de 10X (WF10X) y una fuente de luz halógena de corriente alterna externa (AC), retire el tejido de las cocleares circundantes, los canales semicirculares y los órganos vestibulares con fórceps quirúrgicos(Figura 2F).
- Para permitir que el dextran y los medios L15 entren en el conducto coclear, realice dos límites de punción en las cóclearas diseccionadas, una en la ventana redonda y otra en la región coclear apical.
- Añadir 300 ml de medios L15 de Leibovitz en cada pozo de una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos.
- Coloque al menos tres cocleares diseccionados en cada pocil.
3. Etiquetado de Dextran
- Reconstituir el dextran en la solución salina equilibrada de Hanks sin Ca2+ y Mg2+ (HBSS-CFM) a una concentración final de 10 mg/ml. Esta solución en stock debe estar alícuota en tubos negros opacos (protegidos de la luz) y almacenarse a -30 oC hasta su uso.
NOTA: El uso de dextran fijable en lisina es fundamental para un resultado exitoso de este protocolo. - Preparar cada desntígeno a una concentración final de 2 mg/ml en 500 ml de los medios L15 de Leibovitz.
- Retire el medio de la cócleara y agregue los medios L15 de Leibovitz que contengan la desviación de interés a una concentración final de 2 mg/ml.
NOTA: Aunque una proporción de los canales MET están abiertos en reposo41,42, la incubación de desmedida se realizó con un suave temblor de los explantes para aumentar la probabilidad de apertura del canal MET. - Incubar a temperatura ambiente durante 2 h con un suave temblor (25 rpm) utilizando un agitador tridimensional con un ángulo inclinado de 25o.
NOTA: La desnreza con etiqueta fluorescente debe estar protegida de la luz siempre que sea posible. Para proteger el deextrarín durante la incubación de 2 h, coloque la placa de vidrio de 9 pocillos dentro de un plato P150 de cultivo celular envuelto en papel de aluminio.
4. Preparación de muestras para imágenes
- Después de la incubación con el deextrarín, lave el tejido durante 2 minutos dos veces con medios y una vez con HBSS.
- Incubar el tejido a temperatura ambiente durante 30 min con un 4% de paraformaldehído en la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks.
ADVERTENCIA: La exposición al formaldehído puede ser irritante para los ojos, la nariz y las vías respiratorias superiores. En ciertos individuos, la exposición repetida de la piel al formaldehído puede causar sensibilización que puede provocar dermatitis alérgica. El formaldehído es un carcinógeno humano conocido y un presunto riesgo reproductivo. - Lave rápida y suavemente el tejido fijo dos veces con HBSS para eliminar el paraformaldehído.
NOTA: La descalcificación de los huesos temporales no es necesaria en esta etapa de desarrollo de la cócleara. - Retire el ligamento espiral y la membrana tectorial con fórceps de punta fina para diseccionar el órgano de Corti(Figura 2G).
- Retire todos los trozos pequeños de tejido y lave el tejido con HBSS.
- Permeabilizar el tejido en 0.5% Triton X-100 en PBS que contiene faloidina etiquetada fluorescentemente (conjugada a verde o roja al probar la absorción de dextran con etiqueta TR- o FITC, respectivamente) a una dilución de 1:200 durante 30 minutos para etiquetar F-actin y visualizar estereocilia a base de actina.
- Lavar el tejido de 2 a 3 veces durante 2 minutos cada vez con el tampón HBSS para eliminar el exceso de tritón y faloidina, y una vez con PBS para eliminar las sales.
- Monte el órgano de los tejidos corti en una diapositiva del microscopio y cúbralo con medios de montaje.
NOTA: Al montar el tejido, asegúrese de que el lado del tejido que contiene la estereocilia de la célula pilosa esté orientado hacia la cubierta. - Retire las posibles burbujas generadas durante la adición del soporte de montaje y evite la generación de nuevas burbujas durante la colocación de la cubierta.
NOTA: Aspirar con una pipeta cualquier burbuja generada durante la adición del soporte de montaje. Para evitar que las burbujas de aire queden atrapadas debajo de la cubierta, coloque un borde de la cubierta cerca de la muestra y baje cuidadosamente y lentamente el cubreobjetos sobre el tejido usando fórceps o una punta de pipeta. - Cubra el tejido en el soporte de montaje con un cubreobjetos de vidrio (Figura 2H).
NOTA: Los objetivos con una apertura numérica superior a 0,4 están diseñados para utilizar #1,5 cubre (0,17 mm de espesor). El uso de la cubierta incorrecta puede tener graves implicaciones para la intensidad y la calidad de las imágenes. - Incubar el tejido montado durante la noche a temperatura ambiente para dejar secar el medio de montaje y almacenar los portaobjetos a 4 oC hasta la toma de imágenes.
5. Adquisición de imágenes y procesamiento de imágenes
NOTA: Las imágenes confocales se tomaron con un microscopio confocal LSM 880 equipado con un detector Airyscan de 32 canales en el modo de superresolución (SR)43 y un objetivo de 63x.
- Añadir una pequeña gota de aceite de inmersión en el objetivo.
- Coloque la diapositiva del microscopio que contiene la muestra de tejido montado en la etapa del microscopio con la cubierta de vidrio frente al aceite de inmersión.
- Concéntrese en la muestra y establezca los parámetros de imagen utilizando el software de adquisición de imágenes.
- Utilice ajustes de adquisición de imágenes idénticos y parámetros óptimos para la resolución x, y y z para cada experimento independiente. Se requiere un sistema de enfoque impulsado por piezoeléctricas para mover el objetivo de forma rápida y precisa al adquirir la pila z de imágenes.
NOTA: Para crear una imagen de toda la región apical de las células pilosas, recopile una pila z de imágenes desde la estereocilia hasta la mitad apical del cuerpo de la célula pilosa utilizando los ajustes óptimos. Es crucial recoger una gran pila z a lo largo de la célula pilosa para asegurar la imagen de las partículas similares a la vesícula. - Utilice el software de adquisición de imágenes para procesar las imágenes confocales sin procesar utilizando el algoritmo de reconstrucción 3D de Airyscan con la configuración predeterminada predeterminada del filtro de desconvolución.
- Abra las imágenes confocales en un software de procesamiento de imágenes para ajustar el brillo y el contraste, añadir la barra de escala y exportar las imágenes para las figuras finales.
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Representative Results
Observamos etiquetado robusto y específico de las células pilosas después de 2h incubación de órgano de explantes de Corti de tipo salvaje postnatal-día-6 (P6) con 3 kDa dextran fluorescentemente etiquetado con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). Se observó etiquetado Deextran tanto en células capilares internas como externas (IHC y OHC) en las regiones basal, media y apical del órgano de Corti(Figura 2B).
La faloiderina etiquetada fluorescentemente se utilizó para contratratar la actina filamentosa (F-actina) y visualizar la estereocilia de células capilares a base de actina. También realizamos experimentos similares en tiempos de incubación más cortos, y aunque observamos acumulación de dextran-TR en el cuerpo de la célula pilosa, las señales fueron más débiles y más variables que las de 2 h de incubación(Figura 2C).
A continuación, indicamos tanto estereocilia como cuerpos celulares de las células pilosas y observamos que sólo aquellas células que incorporaron 3 kDa dextran-TR en su cuerpo celular mostraban etiquetado fluorescente de sus estereocilias(Figura 3A). Esta relación entre la estereocilia y el etiquetado del cuerpo celular estaba ausente en las células pilosas del tejido dañado, que también presentaba etiquetado inespecífico de la deextran en varios tipos de células del epitelio sensorial (cuadrados amarillos en la Figura 2By la Figura 3B). Es importante destacar que observamos una señal de fluorescencia uniforme a lo largo de la estereocilia con enriquecimiento en las puntas de las filas de estereocilia más cortas donde se encuentra el canal MET18,23 (Figura 3C). Además, notamos estructuras similares a vesículas en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de soporte vecinas. El patrón de admisión similar a la vesícula en estas células sugiere que el dextran-TR también puede ser tomado por endococitosis(Figura 3C).
El protocolo descrito aquí también permite el examen de la aceptación de dextrans más grandes y combinaciones de diferentes dextrans. Un mayor dextran de 10 kDa etiquetado con Texas Red (dextran-TR) o fluoresceína (dextran-FITC) también produjo un patrón similar a una vesícula en el cuerpo celular de las células pilosas y células de soporte, además de acumularalrededor de la membrana celular del cabello en un patrón irregular(Figura 4A,B). El 10 kDa dextran-TR también etiquetó superficialmente las tres filas de estereocilia de todas las células pilosas(Figura 4A,inserción), probablemente debido a la superficie cargada negativamente de la membrana plasmática de células pilosas44,45,46. A continuación, examinamos simultáneamente la toma de 3 kDa dextran-TR y 10 kDa dextran-FITC simultáneamente en el órgano de los explantes de Corti. Para el dextran-TR de 3 kDa, observamos un patrón difuso y similar a un vesícula. Sin embargo, el dextran-FITC de 10 kDa sólo mostraba un patrón similar a una vesícula(Figura 4C). Estos datos sugieren que la aceptación de dextran se produce por al menos dos mecanismos distintos que dependen del tamaño del deextran.
A continuación, evaluamos si los canales MET funcionales eran necesarios para la toma de 3 kDa dextran-TR. Para ello, probamos la incorporación de la deextran en las células pilosas del órgano de Corti explantes en presencia de bloqueadores de canal MET (neomicina y amiloride)13,14,47 o el chelador CA2+ BAPTA, que suprime las corrientes MET rompiendo los enlaces de punta y previniendo la gating del canal25,48,49. En estos experimentos, los explantes de tejido fueron previamente incubados durante 30 min con neomicina (500 mM), amiloride (150 mM), o con BAPTA (5mM) antes de la adición de 3 kDa dextran-TR en presencia del bloqueador MET correspondiente. La presencia de BAPTA o los bloqueadores de canal MET impidió el etiquetado de estereocilia(Figura 5A)y la adopción de 3 kDa dextran-TR en las células pilosas(Figura 5B). Sin embargo, el bloqueo del canal MET conservó el patrón similar a la vesícula(Figura 5B),lo que indica que este patrón de admisión es independiente de los canales MET funcionales. Se han observado resultados similares en células pilosas de ratones TMC1/TMC2 de doble nocaut, que carecen de MET27. Intrigadamente, estas estructuras similares a vesículas no eran observables en presencia de amiloride, que se sabe que inhibe el intercambiador Na+-H+ y así inhiben la endotosis50,51. Estos resultados indican que 3kDa dextran-TR entra en las células pilosas a través de dos vías diferentes, una común a dextrans más grande que involucra estructuras similares a vesículas y otra que depende de canales MET funcionales.
Figura 1: Pasos de la disección de un órgano murino de Corti. (A) Limpie el área y los materiales necesarios para la disección. (B) Cráneo del ratón expuesto. Los fórceps sostienen la piel, que se ha doblado hacia la nariz. Las líneas negras indican las dos incisiones necesarias para la eliminación del cerebro. (C) Cráneo incisivo y abierto para permitir la eliminación del cerebro con una espátula (a la derecha). (D) Cráneo y huesos temporales después de la extracción del cerebro. (E) Cráneo con impuestos, incluyendo los huesos temporales (cuadrados negros trenzados) en una placa P35 cubierta con medios. (F) Cóclear esexifada. (G) Dos órganos diseccionados de Corti en el pozo de una placa de depresión de vidrio. (H) Muestra montada en una cubierta de vidrio lista para la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La toma de células capilares 3 kDa dextran-TR. (A) Representación esquemática de Dextran etiquetado rojo de Texas (dextran-TR) que contiene seis moléculas de glucosa correspondientes a un peso molecular de 1,08 kDa. Una reacción de éster de succinimidilo une una molécula de Texas Red (magenta) con un monómero de glucosa. (B) Imagen confocal representativa que muestra un etiquetado específico de células pilosas sensoriales (HC) con 3 kDa dextran-TR en todo el órgano de Corti desde un ratón de 6 días de edad. Se indican las regiones basal (BA), media (MD) y apical (AP) del órgano. Los cuadrados amarillos indican regiones dañadas por el tejido. (C) 3 kDa dextran-TR fluorescencia después de 30, 60, 90, o 120 min incubación con el órgano de corti explantes se muestra en magenta fusionado con F-actina en verde (imágenes superiores) e independientemente en escala de grises (imágenes inferiores). El rango de visualización de la imagen se ajustó linealmente en cada una de las imágenes grises de forma independiente para la visualización de la fluorescencia dextran-TR de 3 kDa. Barra de escala de 20 mm. Esta cifra se ha modificado a partir de27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Etiquetado del cuerpo de la célula capilar y estereocilia con 3 kDa dextran-TR. (A) Imágenes confocales que muestran fluorescencia dextran-TR de 3 kDa (magenta) en el cuerpo celular y estereocilia contrarestado con faloidina para etiquetar F-actina (verde) para visualizar los límites de las células capilares y estereocilia. Se indican las tres filas de células del cabello externas (OHC) y una fila de células del cabello interno (IHC). Barra de escala de 20 mm.(B) Imágenes confocales de un área de tejido dañada que muestra fluorescencia de 3 kDa dextran-TR (magenta) en el cuerpo de la célula y estereocilia. Las flechas amarillas indican el etiquetado de las células auxiliares no sensoriales. Barra de escala de 20 mm.(C) Vista más cercana de la fluorescencia de 3 kDa dextran-TR en el cuerpo celular y estereocilia de las células del cabello externas (OHC, superior) y las células pilosas internas (IHC, parte inferior). Barra de escala de 5 mm. Esta cifra se ha modificado a partir de27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Etiquetado de dextran más grande de 10 kDa y una combinación de 3 y 10 kDa dextran. (A) Imagen confocal de las células pilosas en los niveles de células pilosas (arriba) y estereocilia (abajo) incubadas con 10 kDa dextran-TR. La señal de fluorescencia de dextrano se muestra en magenta fusionado con F-actina en verde e independientemente en escala de grises. Un par de IHC se muestran con mayor aumento en el recuadro para apreciar el etiquetado superficial de la estereocilia observada con el dextran-TR de 10 kDa. Barra de escala de 5 mm.(B) Imagen confocal de las células pilosas incubadas con 10 kDa dextran-FITC representado como en A. (C) Imagen confocal de las células pilosas en los niveles del cuerpo de las células pilosas (superior) y estereocilia (abajo) incubado simultáneamente con 3 kDa dextran-TR y 10 kDa dextran-FITC e imágenes utilizando canales independientes y representados por separado en gris. En el panel derecho, F-actin (azul), 10 kDa dextran-FITC (verde) y 3 kDa dextran-TR (magenta) se muestran junto con faloidina (azul). La barra de escala es de 20 mm, y el patrón de admisión similar a la vesícula se indica con flechas amarillas. Esta cifra se ha modificado a partir de27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Se requieren canales MET funcionales para la admisión de 3 kDa dextran-TR. Imágenes confocales representativas de células pilosas en el nivel de estereocilia (A) o cuerpo celular (B) después de la incubación con 3 kDa dextran-TR en ausencia (control) o presencia de BAPTA o los bloqueadores de canal MET amiloride y neomicina. La fluorescencia de 3 kDa dextran-TR se muestra en magenta. El tejido fue contraalcanzado con faloideicina para etiquetar F-actina para la visualización de la estereocilia de células capilares y los límites (verde). Las flechas blancas apuntan a estructuras similares a vesículas. Se indican las tres filas de células del cabello exteriores (OHC) y una fila de células del cabello interno (IHC), barra de escala de 20 mm. Esta cifra se ha modificado a partir de27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe cómo realizar experimentos de admisión en órgano murino de los explantes de Corti con 3 kDa dextran Texas Red. El objetivo de este método es probar si las moléculas más grandes que otras previamente probadas también fueron capaces de etiquetar específicamente las células vellosas auditivas y permear a través del canal MET. Protocolos experimentales similares se han utilizado previamente para evaluar la permeabilidad de las células pilosas a otros tintes fluorescentes como FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20 y Texas Red-labeled aminoglycosides (1.29–1.43 kDa)13,52. El tiempo necesario para etiquetar las células pilosas usando estas moléculas fluorescentes varía con su tamaño. El etiquetado máximo requiere unos minutos para FM1-4313,53, 30-60 min para Texas red-etiquetado aminoglucósidos13, y 1.5 h para Texas red-etiquetado 3 kDa dextran. Por lo tanto, los largos tiempos de incubación son cruciales para este experimento, ya que sólo vimos un etiquetado mínimo del cuerpo de la célula capilar en tiempos de incubación cortos(Figura 2C). Elegimos estudiar ratones P6 para estos experimentos porque, a esta edad, la mayoría de las células pilosas apicales y basales llevan corrientes de transducción y expresan las proteínas TMC1 y TMC212,18,54,55. Debe ser posible estudiar animales más jóvenes, ya que las corrientes MET están presentes antes de P6, en particular cerca de la base de la cócleara12. Estudiar animales mayores puede ser más difícil porque la disección de la cóclear ósea se vuelve más difícil a medida que esta estructura continúa osificando56.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. El más crucial es la disección y preparación exitosa del órgano del tejido Corti(Figura 1). La delicada estructura del órgano de Corti y el encerrador en la cócleara ósea presenta un reto para el análisis histológico y bioquímico. Varios protocolos detallados para la disección exitosa de este tejido han sido publicados previamente en esta revista56,57,58 y otros59. La interrupción de la unión celular y la pérdida de la integridad del epitelio sensorial auditivo pueden conducir a la aceptación de la dextración de hasta 40 kDa y al etiquetado de las células afectadas39,40. De acuerdo con esto, observamos etiquetado inespecífico de las células pilosas y las células de soporte circundantes cuando el tejido se dañó involuntariamente con los fórceps durante la disección antes de la incubación de la desconexión(Figura 2B y Figura 3B). No hay trucos ni pautas para alcanzar el dominio en la disección de un órgano intacto de Corti que no sea la práctica y la paciencia. Sin embargo, la presencia de 1–2 mM Ca2+ durante los experimentos de disección y admisión de tejido sin importancia es crucial para mantener la integridad del enlace de punta que transmite la fuerza mecánica al canal MET y, por lo tanto, preservar la función del canal MET. Una vez que el tejido se fija con 4% PFA, la presencia de calcio en el tampón o medios se vuelve trivial.
Una de las limitaciones de este estudio reside en la naturaleza heterogénea de las moléculas de dextran. El dextran elaborado por la bacteria Leuconostoc es un polímero de anhidroglucosa compuesto de aproximadamente 95% alfa-(1–6) D-linkages(Figura 2A). Los enlaces restantes representan la ramificación del dextran, que se correlaciona con su longitud, por lo que la disminución de menor peso molecular es más similar a una varilla y tiene una distribución de tamaño más estrecha, mientras que el dextrans más grande son polidispersos60. Por lo tanto, el peso molecular real de las moléculas en cada preparación del dextran de 3 kDa oscila entre 1,5 y 3,0 kDa, incluida la molécula fluorescente61. Además, el dextran etiquetado fluorescentemente difiere en el número de moléculas rojas de Texas unidas al dextran (grado de etiquetado). Es aconsejable utilizar dextran con un grado de etiquetado de al menos 0,4 ya que un menor grado de etiquetado dificultará la capacidad de detectar el deextran etiquetado fluorescentemente por microscopía. El tinte fluorescente acoplado al deextrarín y los residuos de lisina en las versiones fijables, determinará la carga general del deextrarín. Esta es una consideración importante ya que la selectividad catiónica del canal MET preferentemente tomaría la toma de dextran catiónico27. Por último, es necesario un dextran fijable en lisina para alcanzar la resolución mostrada en estos experimentos. Un deextran no fijable continuará difuminándose en el tejido dificultando su localización y visualización precisas.
El microscopio confocal LSM 880 equipado con un detector Airyscan utilizado para la imagen del órgano de las muestras de Corti nos proporcionó el doble de resolución, y una mejor relación señal-ruido (SNR) en comparación con un microscopio confocal convencional62. Por lo tanto, este microscopio nos permitió no sólo observar la robusta acumulación de desmasense en el cuerpo celular, sino también para identificar la acumulación de la dexinmena en las puntas de estereocilia y el patrón similar a la vesícula en el cuerpo celular. Un microscopio confocal convencional permitiría la visualización y cuantificación de la acumulación de deextran fluorescente en el cuerpo celular, pero sería difícil distinguir las tres filas de estereocilia y la localización precisa del dextran en las puntas de las filas de estereocilia más cortas. Una resolución similar a la alcanzada con el confocal Airyscan LSM 880 podría alcanzarse utilizando un microscopio confocal convencional con sobremuestreo y desconvolución, aunque el SNR sería inferior al alcanzado con el detector Airyscan.
Además del uso de 3 kDa dextran-TR para el ensayo para canales MET funcionales, este protocolo podría utilizarse para estudiar los procesos endocíticos en las células pilosas, ya que todos los dextrans probados revelan un patrón intracelular similar a una vesícula que se asemeja a la endotosis. Este proceso no fue el centro de nuestro trabajo, y se requerirían estudios adicionales para caracterizar plenamente este fenómeno.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Vincent Schram del núcleo de microscopía e imágenes NICHD por ayudar en la adquisición de imágenes confocales, y a Tsg-Hui Chang por obtener una ayuda inestimable en la gestión de colonias y el cuidado de ratones. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S.A.B. fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, y por una beca postdoctoral Robert Wenthold del programa de investigación intramuros del NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A.
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
