Summary
Här presenterar vi en metod för att visualisera upptaget av 3 kDa Texas Rödmärkt dextran i auditiva hårceller med funktionella mechanotransduction kanaler. Dessutom kan dextrans av 3-10 kDa användas för att studera endocytos i hår och stödjande celler i organet i Corti.
Abstract
Hårcellmechanotransduktion (MET) kanal spelar en viktig roll i hörseln. Den molekylära identiteten och den strukturella informationen i marknadsekonomisk status är dock fortfarande okänd. Elektrofysiologiska studier av hårceller visade att MET kanalen har en stor ledning och är genomsläpplig för relativt stora fluorescerande katjoniska molekyler, inklusive vissa styrylfärgämnen och Texas Röd-märkta aminoglykosid antibiotika. I detta protokoll beskriver vi en metod för att visualisera och utvärdera upptaget av fluorescerande dextrans i hårceller i organet i Kortti-utväxter som kan användas för att analysera funktionella MET-kanaler. Vi fann att 3 kDa Texas Rödmärkta dextran specifikt etiketter funktionella auditiva hårceller efter 1-2 h inkubation. I synnerhet etiketter 3 kDa dextran de två kortare stereociliaraderna och ackumuleras i cellkroppen i ett diffust mönster när funktionella MET-kanaler finns. Ytterligare vesicle-liknande mönster av märkning observerades i cellkroppen av hårceller och omgivande stödjande celler. Våra data tyder på att 3 kDa Texas-Red dextran kan användas för att visualisera och studera två vägar för cellulära färgning upptag; en hårcellspecifik ingångsväg genom funktionella MET-kanaler och endocytos, ett mönster som också finns tillgängligt för större dextran.
Introduction
Innerörats hårceller är de sensoriska celler som detekterar ljud och döljer mekaniskt stimuli i elektriska signaler, som i slutändan tolkas av vår hjärna. Dessa celler har en trappa-formad bunt av tre rader av aktin-baserade glödtrådar, känd som stereocilia, som sticker ut från deras apical region1,2. Den mekaniska stimuli avleda stereocilia filament mot den längsta raden och utlösa öppnandet av mechanotransduction (MET) kanaler3. Öppnandet av MET kanaler leder till en tillströmning av katjoner som depolariserar cellen och följaktligen signalerar utsläpp av synaps blåsor i den basala regionen i hårcellen.
De biofysiska egenskaperna hos MET-kanalen som är nödvändig för hörseln har i stor utsträckning karakteriserats. Dessa kanaler är bland annat katjoniskt selektiva och har en relativt stor kontring (150–300 pS i låg Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Anmärkningsvärt, stora fluorescerande molekyler som FM1-43 och Texas Rödmärkta aminoglykosider är permeant blockerare av MET kanalen, vilket resulterar i deras ackumulering i hårcellen kroppen som kan visualiseras med fluorescensmikroskopi11,12,13,14. Omvänt har den molekylära identiteten och strukturen hos MET-kanalen och dess genommektväg förblivit svårfångad. Ökande experimentella bevis tyder på att transmembrane-liknande kanal protein 1 (TMC1) är en komponent i MET kanalen i mogna hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-liknande kanal 1 (TMC1) ändra MET kanal egenskaper19,20,21,22 och orsaka dövhet. Dessutom lokaliserar TMC1 till platsen för MET-kanalen18,23 och interagerar med den spets-länk som ansvarar för att överföra den mekaniska kraften till MET-kanalen24,25. Dessutom har den senaste bioinformatikanalysen identifierat TMC-proteinerna som evolutionära relaterade till de mechanokänsliga kanalerna TMEM63/OSCA-proteiner och TMEM16-proteinerna, en familj av kalciumaktiverade kloridkanaler och lipidförvrängningar26,27,28. En strukturell modell av TMC1 baserat på förhållandet mellan dessa proteiner visade förekomsten av en stor hålighet vid protein-lipid gränssnitt27. Detta hålighet hyser de två TMC1 mutationer som orsakar autosomal atypiska dominerande hörselnedsättning (DFNA36)27,29,30,31,32, och selektiv modifiering av cystein mutanter för rester i hålrummet ändra MET kanal egenskaper28, vilket tyder på att det kan fungera som permeation väg MET kanalen. Den stora storleken på denna förutspådde hålighet i TMC proteiner kan förklara förmågan hos stora molekyler att genomsyra MET kanalen. För att testa förutsägelsen att MET-kanalen innehåller en ovanligt stor permeationsväg och för att tänja på gränserna för storleken på håligheten som observerats i TMC1, utvecklade vi ett protokoll för att utföra upptag experiment i organet i Korti explants med en större molekyl, 3 kDa dextran fluorescerande märkt med Texas Red.
Dextran är en komplex grenade polysackarider bestående av många D-glukosmolekyler bundna av alfa-1,6 glykosidiska kopplingar. Dess höga löslighet i vatten, låg celltoxicitet och bioinertitet gör det till ett mångsidigt verktyg för att studera flera cellulära processer. Dessutom finns dextran i ett brett spektrum av storlekar och fluorescerande märkta med fluorofforer av flera färger. Fluorescerande märkta dextrans används ofta i cell och vävnad permeabilitet forskning33,34, att studera endocytos i flera cellulära system35,36, och för neural spårning37,38. Inom hörselfältet har dextranmolekyler också använts för att bedöma störningarna i cellcellkorsningen och förlusten av hörselsensorisksensorisk tjusateletintegritet efter exponering för intensivt buller i chinchillaorganet i Corti39,40.
I detta arbete utnyttjade vi egenskaperna hos några av de minsta (3 och 10 kDa) fluorescerande dextrans att utföra upptag experiment i murine innerörat hårceller och utforska storleken på permeation vägen för innerörat hårcell MET kanal. Dessutom använde vi en laser-scanning confocal mikroskop (LSM) 880 utrustad med en Airyscan detektor för att visualisera och lokalisera fluorescerande dextran på stereocilien och cellkroppen av auditiva hårceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurskötseloch experimentella förfaranden utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur, som godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 till KJS).
1. Möss
- Ställ in ett par avelpar av C57BL/6J vildtyp för att häcka i djuranläggningen för att kontrollera datum för födelse av kullarna och hålla reda på åldern på valparna.
2. Cochleae Dissekering
- Ställ in ett rent utrymme nära ett stereomikroskop för att utföra dissektionerna(bild 1A). Använd 70% etanol för att rengöra utrymmet och omgivningen och placera en ren bänkpad. En medicinsk patologiskt avfall (MPW) plastpåse skulle krävas för att kassera djurkadaver.
- Förbered flera 35 mm rätter med några Leibovitz's L15 media.
Obs: Leibovitz L-15 cell media innehåller 1-2 mM Ca2 +, som krävs för att upprätthålla integriteten hos tips-länkar, och innehåller essentiella aminosyror, vitaminer och natrium pyruvat för att förbättra cellhälsa och överlevnad. Serum uteslöts för att undvika experimentell variation på grund av dess dåligt definierade sammansättning och potentiella störningar med dextran. - Avliva postnatal-dag-6 (P6) möss genom halshuggning.
OBS: 6 dagar gamla möss är något resistenta mot inandningsbedövning. Även om isofluran eller långvarig CO2-exponering (upp till 50 min) kan användas för dödshjälp, rekommenderas en sekundär fysisk metod för att säkerställa dödsfall. - Använd kirurgisk sax för att ta bort huden på skallen genom att göra ett ytligt snitt från främre till den bakre änden och över de externa hörselkanalerna.
- Vik huden mot näsan för att exponera kraniet(figur 2B).
- Gör ett snitt från baksidan till framsidan av skallen och över ögonlinjen(figur 2B-C).
- Separera skallen i två halvor och ta bort hjärnan med hjälp av en liten spatel för att exponera de timliga benen(figur 2C-D).
- Med liten sax, skär runt de timliga benen och punktskatt vävnaden.
- Placera båda timliga ben i en 35 mm maträtt och se till att de är täckta med L15 media(figur 2E).
OBS: Följande steg utförs under stereomikroskop. En svart bakgrund hjälper vanligtvis till att visualisera vävnaden under de fina dissekeringsstegen. - Under ett stereomikroskop utrustat med ett widefield-okular (en 10X förstoringseffekt (WF10X) och en extern växelström (AC) halogen ljuskälla), ta bort den omgivande cochleavävnaden, halvcirkelformade kanaler och vestibulära organ med kirurgiska pincetter(figur 2F).
- För att dextran och L15 media ska kunna komma in i cochlearkanalen utför du två punkteringsgränser på dissekerat cochleae, en på det runda fönstret och andra i den apical cochlear regionen.
- Tillsätt 300 ml Leibovitz L15 media i varje brunn från en 9-brunn glas depression tallrik.
- Placera minst tre dissekerade cochleae på varje brunn.
3. Dextran Märkning
- Rekonstruera dextran i Hanks balanserade saltlösning utan Ca2+ och Mg2+ (HBSS-CFM) vid en slutlig koncentration på 10 mg/ml. Denna lagerlösning skall alikvoteras i ogenomskinliga svarta rör (skyddade från ljus) och förvaras vid -30 °C fram till användning.
OBS: Användningen av lysin-fixbara dextran är avgörande för ett framgångsrikt resultat av detta protokoll. - Förbered varje dextran vid en slutlig koncentration på 2 mg/ml i 500 ml Leibovitz L15-media.
- Ta bort media från cochlea och lägg till Leibovitz L15-media som innehåller dextran av intresse vid en slutlig koncentration på 2 mg/mL.
OBS: Även om en del av MET-kanalerna är öppna i vila41,42,utfördes dextran inkubationsen med en mild skakning av utväxter för att öka den öppna sannolikheten för MET-kanalen. - Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar med skonsam skakning (25 varv/min) med hjälp av en 3-dimensionell shaker med en lutande vinkel på 25°.
OBS: Fluorescerande märkt dextran måste skyddas mot ljus när det är möjligt. För att skydda dextran under 2 h inkubation, placera 9-brunn glasplattan inuti en cellkultur P150 skålen insvept i aluminiumfolie.
4. Provberedning för bildbehandling
- Efter inkubation med dextran, tvätta vävnaden i 2 min två gånger med media och en gång med HBSS.
- Inkubera vävnaden vid rumstemperatur i 30 min med 4% paraformaldehyd i Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
VARNING: Exponering för formaldehyd kan vara irriterande för ögon, näsa och övre luftvägarna. Hos vissa individer, upprepad hudexponering för formaldehyd kan orsaka sensibilisering som kan resultera i allergisk dermatit. Formaldehyd är en känd cancerframkallande hos människor och en misstänkt reproduktiv fara. - Tvätta snabbt och försiktigt den fasta vävnaden två gånger med HBSS för att ta bort paraformaldehyden.
OBS: Avkalkning av de timliga benen behövs inte i detta utvecklingsstadium av cochlea. - Ta bort spiralligamentet och tectorialmembranet med fina spetspinar för att dissekera cortis organ (figur 2G).
- Ta bort alla små bitar av vävnad och tvätta vävnaden med HBSS.
- Permeabilisera vävnaden i 0,5% Triton X-100 i PBS som innehåller fluorescerande märkta phalloidin (konjugerat till grönt eller rött vid testning av upptaget av TR- eller FITC-märkt dextran, respektive) vid en 1:200 utspädning för 30 min för att märka F-aktin och visualisera actin-baserade stereocilia.
- Tvätta vävnaden 2–3 gånger i 2 min varje gång med HBSS-buffert för att ta bort överskottet av triton och phalloidin, och en gång med PBS för att ta bort salter.
- Montera organet i Korti vävnader på ett mikroskop bild och täck den med monteringsmedia.
OBS: När du monterar vävnaden, se till att sidan av vävnaden som innehåller hårcellen stereocilia är vänd mot täckslip. - Ta bort eventuella bubblor som genereras under tillsatsen av monteringsmediet och förhindra generering av nya bubblor under placeringen av täckslipen.
OBS: Aspirera med en pipett någon bubbla som genereras under tillsats av monteringsmedia. För att förhindra att luftbubblor fastnar under täckslipen, placera en kant på täckslipen nära provet och försiktigt och sakta sänka täckslipen över vävnaden med hjälp av pincett eller en pipettspets. - Täck vävnaden i monteringsmedia med ett glastäcke(figur 2H).
OBS: Målen med en numerisk bländare över 0,4 är utformade för att använda #1,5 följesering (0,17 mm tjocklek). Med fel täckslip kan ha allvarliga konsekvenser för intensiteten och kvaliteten på bilderna. - Inkubera den monterade vävnaden över natten i rumstemperatur för att låta monteringsmediet torka och förvara rutschkanorna vid 4 °C tills bildbehandling.
5. Bildförvärv och bildbehandling
OBS: Konfokalbilderna togs med ett LSM 880 konfokalmikroskop utrustat med en airyscan-detektor på 32 kanaler i superupplösningsläge43 och ett 63x-mål.
- Tillsätt en liten droppe nedsänkningsolja på målet.
- Placera mikroskopbilden som innehåller det monterade vävnadsprovet i mikroskopstadiet med glastäcket mot nedsänkningsoljan.
- Fokusera på provet och ställ in bildåtergivningsparametrarna med hjälp av bildanskaffningsprogrammet.
- Använd identiska inställningar för bildanskaffning och optimala parametrar för x-, y- och z-upplösning för varje oberoende experiment. Ett piezodrivet fokussystem krävs för att snabbt och exakt flytta målet när man förvärvar z-stacken av bilder.
OBS: För att avbilda hela den apical regionen av hårcellerna, samla en z-stack med bilder från stereocilia till den apical halvan av hårcellen kroppen med hjälp av optimala inställningar. Det är viktigt att samla en stor z-stack längs hårcellen för att säkerställa avbildning av vesicle-liknande partiklar. - Använd bildanskaffningsprogrammet för att bearbeta de råa confocal bilderna med hjälp av airyscan 3D-rekonstruktionsalgoritmen med de automatiska standarddeconvolution-filterinställningarna.
- Öppna konfokalbilderna i ett bildbehandlingsprogram för att justera ljusstyrkan och kontrasten, lägg till skalstrecket och exportera bilderna för de slutliga figurerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi observerade robust och specifik märkning av hårceller efter 2h inkubation av organ av Korti utväxter från vild-typ postnatal-day-6 (P6) möss med 3 kDa dextran lysrör märkt med Texas Red (dextran-TR)(Figur 2A-B). Dextran märkning observerades i både inre och yttre hårceller (IHC och OHC) på basala, mellersta och apical regioner av organet i Corti(figur 2B).
Fluorescerande märkt phalloidin användes för att motverka glödtrådsaktin (F-actin) och visualisera aktin-baserade hårcell stereocilia. Vi utförde också liknande experiment vid kortare inkubationstider, och även om vi observerade dextran-TR-ackumulering i hårcellkroppen var signalerna svagare och mer varierande än de vid 2 h inkubation(figur 2C).
Vi avbildade sedan både stereocilia och cellkroppar av hårcellerna och konstaterade att endast de celler som ingår 3 kDa dextran-TR i deras cellkropp visade fluorescerande märkning av deras stereocilia(figur 3A). Detta förhållande mellan stereocili aoch cellkroppen märkning var frånvarande i hårceller från skadad vävnad, som också presenteras ospecifik märkning av dextran i flera celltyper av sensoriskepitel (gula rutor i figur 2B, och figur 3B). Viktigt, vi observerade en enhetlig fluorescens signal längs stereocilia med anrikning på tips av kortare stereocilia rader där MET kanalen ligger18,23 (Figur 3C). Dessutom märkte vi vesicle-liknande strukturer i cellkroppen av hårcellerna och de närliggande stödjande cellerna. Vesicle-liknande mönster av upptag i dessa celler tyder på att dextran-TR kan också tas upp av endocytos(figur 3C).
Det protokoll som beskrivs här möjliggör också undersökning av upptaget av större dextrans och kombinationer av olika dextrans. Större dextran av 10 kDa märkt med Texas Red (dextran-TR) eller fluorescein (dextran-FITC) producerade också en vesicle-liknande mönster i cellkroppen av hårceller och stödjande celler, förutom att ackumulera runt hårcellmembranet i ett ojämnt mönster(figur 4A,B). Den 10 kDa dextran-TR också ytligt märkt de tre stereocilia rader av alla hårceller(Figur 4A, inset), förmodligen på grund av den negativt laddade ytan av hårcellplasmamembranet44,45,46. Vi undersökte därefter upptaget av 3 kDa dextran-TR och 10 kDa dextran-FITC samtidigt i organet i Korti explants. För 3 kDa dextran-TR observerade vi både en diffus och ett vesicle-liknande mönster. Men 10 kDa dextran-FITC visade bara ett vesicle-liknande mönster(figur 4C). Dessa data tyder på att dextran-upptaget sker av minst två olika mekanismer som är beroende av dextrans storlek.
Vi bedömde sedan om funktionella MET-kanaler krävdes för upptag av 3 kDa dextran-TR. För att göra detta testade vi dextran införlivande i hårceller från organet i Corti explants i närvaro av MET kanal blockerare (neomycin och amiloride)13,14,47 eller Ca 2+ kelator BAPTA, som avskaffar MET strömmar genom att bryta tips-länkar och förhindra gating av kanalen25,48,49. I dessa experiment inkuberades vävnadsutväxterna tidigare i 30 min med neomycin (500 mM), amiloride (150 mM) eller med BAPTA (5mM) före tillsats av 3 kDa dextran-TR i närvaro av motsvarande MET-blockerare. Förekomsten av BAPTA eller MET kanalblockerare förhindrade stereociliamärkningen(figur 5A)och upptaget av 3 kDa dextran-TR i hårceller(figur 5B). Blockaden av MET-kanalen bevarade dock vesicle-liknande mönster (figur 5B), vilket indikerar att detta upptagmönster är oberoende av funktionella MET-kanaler. Liknande resultat har observerats i hårceller från TMC1/TMC2 dubbla knock-out möss, som saknar MET27. Spännande, dessa vesicle-liknande strukturer var inte observerbara i närvaro av amiloride, som är känt för att hämma Na+-H+ utbytare och därmed hämma endocytos50,51. Dessa resultat tyder på att 3kDa dextran-TR kommer in i hårcellerna genom två olika vägar, en som är gemensam för större dextrans med vesicle-liknande strukturer och en annan som är beroende av funktionella MET-kanaler.
Figur 1: Steg i dissekering av ett murine organ av Corti. A)Rent område och material som krävs för dissekeringen. (B)Exponerat muskranium. Pincett håller huden, som har vikts mot näsan. Svarta linjer indikerar de två snitt som krävs för avlägsnande av hjärnan. (C)Incised och öppnade kranium för att möjliggöra avlägsnande av hjärnan med en spatel (till höger). (D)Kranie och timliga ben efter hjärnborttagning. E)Struken skalle, inklusive de timliga benen (streckade svarta rutor) i en P35-platta täckt med media. F) Struken cochleae. (G)Två dissekerade organ av Corti på brunnen av en glasdepression tallrik. (H)Monterat prov på ett glastäcke klart för bildbehandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Hårceller upptag 3 kDa dextran-TR. (A)Schematisk representation av Texas Rödmärkt dextran (dextran-TR) som innehåller sex molekyler av glukos som motsvarar en molekylvikt på 1,08 kDa. En uccinimidylesterreaktion länkar en Texas Röd molekyl (magenta) till en glukosmonomer. (B)Representativ konfokal bild som visar specifik märkning av sensoriska hårceller (HC) med 3 kDa dextran-TR över hela organet i Corti från en 6 dag gammal mus. Organets basala (BA), mellersta (MD) och API(AP) är angivna. Gula rutor indikerar vävnadsskadade regioner. (C)3 kDa dextran-TR fluorescens efter 30, 60, 90 eller 120 min inkubation med organet av Korti explants visas i magenta samman med F-aktin i grönt (toppbilder) och oberoende i gråskala (botten bilder). Bildvisningsområdet justerades linjärt i var och en av de grå bilderna oberoende av varandra för visualisering av 3 kDa dextran-TR-fluorescensen. Skalstång = 20 mm. Denna siffra har ändrats från27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Hårcellskropp och stereocilimärkning med 3 kDa dextran-TR. (A)Konfokalbilder som visar 3 kDa dextran-TR fluorescens (magenta) på cellkroppen och stereocilia kontrafärgas med phalloidin att märka F-actin (grön) för att visualisera hårcell gränser och stereocilia. De tre raderna av yttre hårceller (OHC) och en rad inre hårceller (IHC) anges. Skala bar = 20 mm. (B) Konfokal bilder av en skadad vävnadområde som visar 3 kDa dextran-TR fluorescens (magenta) på cellkroppen och stereocilia. Gula pilar indikerar märkning av icke-sensoriska stödceller. Skala bar = 20 mm. (C) Närmare bild av 3 kDa dextran-TR fluorescens vid cellkroppen och stereocilia av yttre hårceller (OHC, överst) och inre hårceller (IHC, botten). Skalstång = 5 mm. Denna siffra har ändrats från27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Märkning av större 10 kDa dextran och en kombination av 3 och 10 kDa dextran. (A)Confocal bild av hårceller i hårcellen kroppen (överst) och stereocilia (botten) nivåer ruvade med 10 kDa dextran-TR. Dextran fluorescenssignalen visas i magenta samman med F-aktin i grönt och oberoende i gråskala. Ett par IHC visas vid högre förstoring i inset för att uppskatta den ytliga märkning av stereocilia observerats med 10 kDa dextran-TR. Skala bar = 5 mm. (B) Konfokal bild av hårceller inkuberas med 10 kDa dextran-FITC representeras som i A. (C) Confocal bild av hårceller i hårcellkroppen (överst) och stereocilia (botten) nivåer inkuberas samtidigt med 3 kDa dextran-TR och 10 kDa dextran-FITC och avbildas med hjälp av oberoende kanaler och avbildas separat i grått. I den högra panelen visas F-aktin (blå), 10 kDa dextran-FITC (grön) och 3 kDa dextran-TR (magenta) tillsammans med phalloidin (blå). Skalstång = 20 mm, och vesicle-liknande upptagmönster indikeras med gula pilar. Denna siffra har ändrats från27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Funktionella MET-kanaler krävs för 3 kDa dextran-TR-upptag. Representativa konfokala bilder av hårceller vid stereocilia (A) eller cellkropp(B)nivå efter inkubation med 3 kDa dextran-TR i avsaknad (kontroll) eller närvaro av BAPTA eller MET kanal blockerare amiloride och neomycin. 3 kDa dextran-TR fluorescens visas i magenta. Vävnad var motfläckad med phalloidin att märka F-aktin för visualisering av hårcellen stereocilia och gränser (grön). Vita pilar pekar på vesicle-liknande strukturer. De tre raderna av yttre hårceller (OHC) och en rad inre hårceller (IHC) anges, Skala bar = 20 mm. Denna siffra har ändrats från27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man utför upptag experiment i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denna metod är att testa om molekyler större än andra tidigare testats också kunde specifikt märka hörselhårceller och genomsyra genom MET-kanalen. Liknande experimentella protokoll har tidigare använts för att utvärdera permeabiliteten hos hårceller till andra fluorescerande färgämnen som FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 och Texas Rödmärkta aminoglykosider (1,29–1,43 kDa)13,52. Den tid som behövs för märkning av hårceller med hjälp av dessa lysrörmolekyler varierar med deras storlek. Den maximala märkningkräver några minuter för FM1-4313,53, 30-60 min för Texas Röd-märkta aminoglycosides13, och 1,5 h för Texas Röd-märkt 3 kDa dextran. Således långa inkubationstider är avgörande för detta experiment som vi såg bara minimal märkning av hårcellkroppen vid korta inkubationstider(figur 2C). Vi valde att studera P6 möss för dessa experiment eftersom, vid denna ålder, de flesta apical och basala hårceller bära transduktionsströmmar och uttrycka både TMC1 och TMC2 proteiner12,18,54,55. Det bör vara möjligt att studera yngre djur som met-strömmar finns tidigare än P6, särskilt nära basen av cochlea12. Studera äldre djur kan vara mer utmanande eftersom dissekering av beniga cochlea blir svårare eftersom denna struktur fortsätter att förossa56.
Det finns flera kritiska steg i det här protokollet. Den mest avgörande är den framgångsrika dissekering och beredning av organet i Corti vävnad (Figur 1). Den känsliga strukturen av orgti och inneslut i boney cochlea utgör en utmaning för histologisk och biokemisk analys. Flera detaljerade protokoll för den framgångsrika dissekering av denna vävnad har tidigare publicerats i denna tidskrift56,57,58 och andra59. Störningar i cellens korsning och förlust av hörselsensoriska epitel integritet kan leda till upptag av dextran på upp till 40 kDa och märkning av de drabbade cellerna39,40. I samförstånd med detta observerade vi ospecifik märkning av hårceller och de omgivande stödjande cellerna när vävnaden oavsiktligt skadades med pincetten under dissekering före dextran inkubation(figur 2B och figur 3B). Det finns inga knep eller riktlinjer för att nå kunskaper vid dissekera ett intakt organ av Corti än praxis och tålamod. Förekomsten av 1–2 mM Ca2+ under vävnadsdissektionoch upptagsexperiment är dock avgörande för att upprätthålla integriteten hos den spetslänk som överför den mekaniska kraften till MET-kanalen och därmed bevarar MET-kanalfunktionen. När vävnaden är fast med 4% PFA, blir förekomsten av kalcium i bufferten eller media trivialt.
En av begränsningarna i denna studie finns i den heterogena karaktären hos dextranmolekylerna. Den dextran som utarbetats av Leuconostoc bakterier är en polymer av vattenglukos som består av cirka 95% alfa-(1-6) D-kopplingar(figur 2A). De återstående kopplingarna står för förgrening av dextran, som korrelerar med dess längd, så dextran av lägre molekylvikt är mer stavliknande och har en smalare storleksfördelning medan större dextrans är polydisperse60. Därför varierar molekylens faktiska molekylvikt i varje beredning av 3 kDa dextran från 1,5 till 3,0 kDa, inklusive fluorescerande molekyl61. Dessutom skiljer sig fluorescerande märkt dextran i antalet Texas Röda molekyler knutna till dextran (grad av märkning). Det är lämpligt att använda dextran med en grad av märkning av minst 0,4 eftersom en lägre grad av märkning kommer att hindra förmågan att upptäcka fluorescerande märkta dextran av mikroskopi. Det fluorescerande färgämnet kopplat till dextran och lysinrester i de fastställbara versionerna, kommer att bestämma dextrans totala laddning. Detta är en viktig faktor eftersom met-kanalens katjoniska selektivitet helst skulle ta upp cationic dextran27. Slutligen är en lysin-fixbar dextran nödvändig för att nå den upplösning som visas i dessa experiment. En icke-fixbar dextran kommer att fortsätta att sprida sig in i vävnaden hindrar dess korrekta lokalisering och visualisering.
LSM 880 confocal mikroskop utrustad med en Airyscan detektor som används för att avbilda organet av Korti prover försåg oss med två gånger upplösningen, och bättre signal-brus förhållande (SNR) jämfört med en konventionell konfokal mikroskop62. Därför tillät detta mikroskop oss inte bara att observera den robusta dextran ackumulering på cellkroppen utan också att precisera ansamling av dextran på stereocilispetsarna och vesicle-liknande mönstret i cellkroppen. Ett konventionellt konfokalmikroskop skulle möjliggöra visualisering och kvantifiering av ackumulering av fluorescerande dextran vid cellkroppen, men det skulle svårt att skilja de tre raderna av stereocili a och den exakta lokaliseringen av dextran vid tips av kortare stereociliarader. En liknande upplösning som den som uppnås med LSM 880 Airyscan confocal kunde nås med hjälp av en konventionell confocal mikroskop med översampling och deconvolution, även om SNR skulle vara lägre än den som nås med Airyscan detektor.
Förutom användning av 3 kDa dextran-TR för att analysera funktionella MET-kanaler, kan detta protokoll användas ytterligare för att studera endocytiska processer i hårceller eftersom alla dextrans testade avslöjar en intracellulära vesicle-liknande mönster som liknar endocytos. Denna process var inte i fokus för vårt arbete, och ytterligare studier skulle krävas för att fullt ut karakterisera detta fenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Vincent Schram från NICHD mikroskopi och bildbehandling kärna för att bistå i confocal bild förvärv, och Tsg-Hui Chang för ovärderlig hjälp med koloni förvaltning och möss vård. Denna forskning stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, till K.J.S. A.B. stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, och av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship från intramural forskningsprogram av NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A.
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
