Aquí, describimos un protocolo para visualizar y analizar las arterias del arco faríngeo 3, 4 y 6 de embriones de ratón utilizando inmunofluorescencia de montaje completo, limpieza de tejidos, microscopía confocal y reconstrucción 3D.
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Artículo de método
Visualización y análisis de arterias de arco faríngeo utilizando inmunohistoquímica de montaje completo y reconstrucción 3D
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Resumen
Resumen
La formación o remodelación inadecuadas de las arterias del arco faríngeo (PAA) 3, 4 y 6 contribuyen a algunas de las formas más graves de cardiopatía congénita. Para estudiar la formación de PAA, desarrollamos un protocolo utilizando inmunofluorescencia integral junto con la limpieza de tejido de alcohol bencílico/benzilo bencílico (BABB), y microscopía confocal. Esto permite la visualización del endotelio del arco faríngeo a una resolución celular fina, así como la conectividad 3D de la vasculatura. Utilizando software, hemos establecido un protocolo para cuantificar el número de células endoteliales (ECs) en PAA, así como el número de ECs dentro del plexo vascular que rodea a los PAA dentro de los arcos faríngeos 3, 4 y 6. Cuando se aplica a todo el embrión, esta metodología proporciona una visualización integral y un análisis cuantitativo de la vasculatura embrionaria.
Introducción
Durante la embriogénesis del ratón, las arterias del arco faríngeo (PAA) surgen como pares simétricos, bilaterales de arterias que conectan el corazón con las aortas dorsales1. A medida que el embrión se desarrolla, el primer y segundo par de PAA retroceden, mientras que losPAA 3,4y 6 se someten a una serie de eventos de remodelación asimétrica para formar las arterias del arco aórtico2.
Los PAA 3, 4 y 6 se desarrollan a través de vasculogénesis, que es la formación de novo de los vasos sanguíneos3. Los defectos en la formación o remodel....
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Protocolo
El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rutgers.
1. Preparación de soluciones
- Preparar 1 L de solución salina tamponada de fosfato con 0.1% Triton-X-100 (PBST) y filtrar esterilizar. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) durante al menos un año.
- Preparar 600 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% del suero de burro normal en PBST. Haga que esta solución sea fresca cada vez.
- Preparar 50 ml de las siguientes diluciones de metanol (MeOH) en una campana de flujo: 25% MeOH en agua desionizada (d....
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Resultados
El protocolo de inmunofluorescencia de montaje completo presentado aquí produce resultados claros y limpios, permitiendo la reconstrucción 3D del endotelio del arco faríngeo, como se ve en la Figura 1A. Es importante incubar embriones durante una cantidad suficiente de tiempo en cada solución de anticuerpos para asegurar una penetración completa a través de la muestra, así como lavar a fondo los embriones después de la incubación de anticuerp.......
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Discusión
La capacidad de visualizar el endotelio en embriones de ratón en 3D ha proporcionado nuevas perspectivas sobre su desarrollo3. Aquí presentamos un protocolo que permite la toma de imágenes 3D de alta resolución de embriones, la visualización de la conectividad vascular y los análisis cuantitativos de la formación de PAA. Este protocolo se puede emplear para ver cómo las alteraciones genéticas o los insultos ambientales afectan el desarrollo de la PAA. El procedimiento descrito aquí utiliza anticue.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O'Donnell y Michael Warkala por la lectura y edición cuidadosa de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR cuenta con el apoyo de NHLBI HL103920-08S1 y la beca T32052283-11 del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de La Piel.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x objetivo de inmersión en agua | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-cabra | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-ratón | Invitrogen | A-31570 | |
| Software | de análisisImaris 9.2.0 | ||
| Alcohol bencílico | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzoato de bencilo | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cubreobjetos | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL de existencias) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Tubos Eppendorf (2,0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Etanol | VWR | 89370-084 | |
| Tubos Falcon (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast Pocillos | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Roboz | RS-5015 | ||
| Cabra anti-VEGFR2 | R& D Sistemas, Inc. | AF644 | |
| Metanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscopio | Nikon | A1HD25 | |
| Ratón anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Suero de burro normal | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehído | Microscopía electrónica Ciencias | 15710 | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20D Placas | |
| Petri (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Placas de Petri (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Moldes de plástico | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referencias
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart....
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Reimpresiones y permisos
