백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

요약

유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.

초록

유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산 (UAA)을 단백질에 도입하여 특성을 수정하거나 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나 단백질 컨쥬게이트에 액세스 할 수있는 강력한 도구입니다. 스톱 코돈 억제, 특히 앰버 코돈 억제는 정의된 위치에서 UAA를 유전적으로 도입하는 가장 인기있는 방법으로 부상했습니다. 본명에서 생물요르토곤 기능성 군을 수용하는 UAA를 함유하는 담체 단백질의 제조에 적용된다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 1:1 탄수화물 hapten/반송파 단백질 비율에서 글리코콘주게이트의 합성으로 제한되지만 수많은 바이오트호고날 기능성 군으로 만만치 않습니다. 글리코코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하기 위한 중요한 기준이며, 이로 인해 점점 더 까다로운 약물 규제 기관의 권고, 고전적인 융합 전략에 의해 충족되지 않은 기준을 충족시다. 더욱이, 이 프로토콜은 실제 컨쥬게이트 백신의 구조를 미세하게 조정하여 구조-면역원성 관계를 해결하는 도구를 제공할 수 있게 한다.

서론

글리코콘주게이트 백신은 전염병의 예방 치료에 사용할 수 있는 백신 무기고의 필수 요소입니다. 그들은 젊은 유아를 포함하여 광범위한 연령 집단에서 안전하고, 잘 용납되고 능률적입니다. 그들은 수막구균, 폐렴구균 또는 혈우병 인플루엔자 형 b^1과같은 캡슐화된 박테리아에 의한 감염에 대한 최적의 방어를 제공한다. 글리코코콘주게이트 백신은 담체 단백질에 공동으로 연결되는 이러한 표면 발현 다당류^2를모방한 박테리아 또는 합성 올리고당류의 캡슐을 형성하는 정제된 세균다당류로 만들어집니다. 담체 단백질의 존재는 탄수화물 항원^3에의해 표현된 항원 결정제에 대하여 지시된 보호적인 유머 면역 반응을 승진시키기 위하여 필수적이다 3. 탄수화물 항원의 신중한 선택 및 생산 외에도, 글리코콘주게이트 백신의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려진 특징은 담체 단백질의 성질, 융합 화학(사용되는 경우 링커의 성질 및 길이 포함), 또는 당캐라이드/단백질 비^3이다. 명백하게, 사카라이드가 단백질에 접합되는 위치뿐만 아니라 연결점의 수는 면역원성에 관련이 있습니다. 현재까지, 이 두 매개 변수는 글리코콘주게이트의 준비가 주로 경험적으로 남아....

프로토콜

1. UAA의 합성 : propargyl-리신 (PrK)

1. N ^α합성 -Boc-propargyl-리신¹⁸
   1. 500 mg의 Boc-L-Lys-OH(2.03 mmol)를 플라스크에 수성 1 M NaOH(5mL) 및 THF(5mL)를 혼합하여 블래스크에 넣고 플라스크에 실리콘 중격을 맞춥니다.
   2. 얼음 욕조에서 플라스크를 식힌 다음 교반하는 동안 미세한 고리를 사용하여 158 μL의 프로파일 클로로포메이트(1.62mmol)를 드롭와이즈(2-3분 동안)를 넣습니다.
   3. 반응 혼합물을 실온에 데우고 10 시간 동안 계속 저어줍니다.
   4. 디틸 에테르 50mL, 수성 1M 염산 50mL, 얼음 욕조에서 에틸 아세테이트 60mL의 냉각 솔루션을 식힙니다.
   5. 얼음 목욕에서 조잡한 반응 혼합물을 식히고 혼합물을 분리 깔때기에 붓습니다. 50mL의 다이틸 에테르로 혼합물을 추출한다. 유기 층을 폐기하십시오.
   6. 조심스럽게 분리 깔때기의 수성 상에 수성 1 M 염산을 추가합니다. 그런 다음 에틸 아세테이트 30mL를 사용하여 수성 층을 두 번 추출합니다. L2 Cl_{2-메탄올(9:1)을}용출물로 사용하여 TLC....

결과

이 프로젝트에서, 균일한 글리코콘주게이트 백신은 정의된부위(도 1)에서UAA를 도입하기 위한 호박스톱 코돈 억제 전략을 사용하여 제조하였다. 폐렴구균 표면 접착제 A는 담체 단백질 모이티로 선택되었다. 이 단백질은 염충균 폐렴^22의모든 변종에 의해 높게 보존되고 표현된다. 그것은 고액 면역원성 및 이전에 폐렴구균 백신 제형^21,23에서담체로서 사용된다. 개념 증명으로서, UAA propargyl-lysine 효율적으로 고고학 메타노사르키나 미제이의 야생 형 pyrlysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA 쌍에 의해 충전 조사되었다. propargyl-lysine는 시판되 게 가능하지만 두 개의 합성

토론

현장 지향 돌연변이 발생은 글리코콘주게이트 백신^7,8,14를준비하는 것을 목표로 거의 사용되지 않는 단백질의 정의된 위치에 특정 아미노산을 통합하는 간단한 전략이다. 20가지 천연 아미노산 접근법에 기초한 고전적인 돌연변이 발생은 번역 기계의 수정이 필요하지 않으므로 매우 효율적입니다. 시스테인 돌연변이는 일반적으로 두단계(예를 들어,탈수알라아닌 중간체로 수정한 후, 번역 후 돌연변이 발생)라는 전략인^27,28의고유한 티올 반응성을 더 탐구하기 위해 표적화된다. 유전 코드 확장은 아마도 훨씬 더 매력적이고 유연하기 때문에 다양한 기능^9,10을

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	고체 분말
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	고체 분말
BL21 (DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli< / em> str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &람다; (DE3 [lacI, lacUV5-T7p07, ind1, sam7, nin5]) [malB+]K-12(λ S)
투석 막
DNAseI
여과기 0.45 &마이크로; m
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA 수지	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA는 20% 에탄올
Pall 원심 장치
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	이 연구		pET24d-mPsaA-WT와 동일하지만 K32TAG 돌연변이가 있습니다. mPsaA 유전자
pET24d-mPsaA-WT	이 연구		BamHI 및 XhoI 제한 부위 사이에 복제된 Wt mPsaA 유전자를 사용한 pET24d 플라스미드를 TEV 프로테아제 서열에 이어 mPsaA 유전자의 C-말단 말단에 His6 태그를 부착하고 Edward
Lemke EMBL(ref 19)의	pEVOL 플라스미드		p15A 유래 플라스미드, MmPylRS 사본 2개(GlnS 프로모터 하에서 1개, pAra 프로모터에서 1개), ProK 프로모터에서 tRNACUA 사본 1개, 클로람페니콜 내성 유전자
프로파르<[>	알드리치	460923	액체
초음파 발생기	Thermo Fisher	FB120-220

는 는 Kanamycine 내성 유전자 선물을 운반합니다.