Method Article

تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق

DOI:

10.3791/60832

⸱

June 11th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتماسكة لتشفير جين من الاهتمام بشكل عابر باستخدام modRNA بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. في العقد الماضي، أصبح العلاج الجيني خيار علاج واعد لأمراض القلب، نظرا لكفاءته وآثاره العلاجية الاستثنائية. في محاولة لإصلاح الأنسجة التالفة بعد MI، استخدمت دراسات مختلفة العلاج الجيني القائم على الحمض النووي أو الفيروسية ولكن واجهت عقبات كبيرة بسبب التعبير الفقير وغير المنضبط للجينات المسلمة، وذمة، وعدم انتظام ضربات القلب، وضمور القلب. الاصطناعية تعديل مرنا (MODRNA) يقدم نهج العلاج الجيني رواية التي تقدم عالية, عابرة, آمنة, غير مناعة, والسيطرة على تسليم مرنا إلى أنسجة القلب دون أي خطر من التكامل الجينومي. بسبب هذه الخصائص الرائعة جنبا إلى جنب مع الدوائية على شكل جرس في القلب، أصبحت وزارة الدفاع الأميركية نهج جذاب لعلاج أمراض القلب. ومع ذلك، لزيادة فعاليتها في الجسم الحي، يجب اتباع طريقة تسليم متسقة وموثوقة. وبالتالي، لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التسليم MODRNA والاتساق العائد في استخدام MODRNA في التطبيقات في مجال المعلومات الحية، يتم تقديم طريقة الأمثل لإعداد وتسليم حقن داخل القلب modRNA في نموذج MI ماوس. وهذا البروتوكول سيجعل من تسليم وزارة الدفاع الأمريكية أكثر سهولة للأبحاث الأساسية والترجمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج الجيني هو أداة قوية تنطوي على تقديم الأحماض النووية لعلاج, علاج, أو الوقاية من الأمراض البشرية. على الرغم من التقدم المحرز في الأساليب التشخيصية والعلاجية لأمراض القلب، كان هناك نجاح محدود في توصيل الجينات في احتشاء عضلة القلب (MI) وفشل القلب (HF). كما واضحة كما يبدو عملية العلاج الجيني، بل هو نهج معقد بشكل ملحوظ بالنظر إلى العديد من العوامل التي تحتاج إلى تحسين قبل استخدام وسيلة تسليم معينة. يجب أن يكون ناقل التسليم الصحيح غير مناعيًا وفعالًا ومستقرًا داخل جسم الإنسان. وقد أدت الجهود المبذولة في هذا المجال إلى توليد نوعين من نظم الإيصال: الفيروسية أو غير الفيروسية. وقد أظهرت النظم الفيروسية المستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك نقل الجينات عن طريق الفيروس الغدي،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية في جبل سيناء.

1. توليفة من وزارة الدفاع

ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل توليف MODRNA في كوندرات وآخرون13.

  1. طلب القوالب plasmid(جدول المواد)وتوليد منتج PCR نظيفة لاستخدامها كقالب مرنا.
  2. إعداد modRNAs عن طريق النسخ في المختبر مع مزيج ribonucleoside مخصصة من التالي (جدول المواد):T7 النسخ عدة، 6 mM المضادة للتآكل تناظري (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G، 75 mM guanosine ثلاثي الفوسفات، 75 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات، 75 mM cytidin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تخدير الفئران التي يبلغ عمرها ثمانية إلى عشرة أسابيع باستخدام الأيزوفلوران والمخاتنة. بعد أن كان الحيوان تحت التخدير، تم حلق المنطقة الصدرية اليسرى وتعقيمها بالإيثانول، وتعرض القلب لأربطة LAD. تم انسداد الشريان التاجي الأيسر من قبل عقدة بحزم خياطة تحت الشريان (الرسم البياني الشكل 1A). بعد احتشاء ناجحة (المشار إليها من ابال الجدار الحر البطين الأيسر)، تم تسليم حقن مباشر من 100 ميكروغرام لوك أو كري MODRNA حل في عازلة سيترات السكروز مباشرة في عضلة القلب في ثلاثة مواقع مختلفة

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت العلاج الجيني إمكانات هائلة لدفع كبير في علاج أمراض القلب. ومع ذلك, الأدوات التقليدية المستخدمة في التجارب السريرية الأولية لعلاج HF أظهرت نجاحا محدودا وترتبط بآثار جانبية شديدة. الحمض النووي الريبي المعدل يقدم تسليم الجينات غير الفيروسية التي تكتسب شعبية باستمرار كأداة نقل الجينات في القلب. ModRNA لا يتطلب توطين النووية الجينات للترجمة، وبالتالي يوفر تعبير فعال وسريع من البروتين. وعلاوة على ذلك، بما أن الرنا لا يندمج في مستضيف الجينوم، فإن تسليم الجينات من قبل وزارة الدفاع يتخطى خطر الطفرات. ونتيجة لذلك، ونظرا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفان بـ آن أنو كوريان لمساعدتها في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء أمراض القلب التي قدمت لمختبر زنجي وكذلك من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 HL142768-01

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أدينوسين ثلاثي الفوسفاتInvitrogenAMB13345مدرج في مجموعة Megascript
أنتاركتيكا فوسفاتيزنيو إنجلاند BiolabsM0289L
التناظرية المضادة للانعكاس ، 30-O-Mem7G (50) ppp (50) GTriLink BiotechnologiesN-7003
نظام التصوير BioluminescensePerkin ElmerIVIS100 124262 نظام تصوير الجهاز المقترن بالشحن
ضام حادFST18200-09
تروبنين القلب IAbcam47003
سيتيدين ثلاثي الفوسفاتInvitrogenAMB13345متضمن في مجموعة Megascript
نظام التخدير المزدوججهاز هارفارد75-2001
ملقط- AdsonFST91106-12
ملقط - Dumont # 7FST91197-00
جوانوزين ثلاثي الفوسفاتInvitrogenAMB13345متضمن في مجموعة Megascript
طقم النسخ في المختبرInvitrogenAMB133455X MEGAscript T7 Kit
قنية التنبيبجهاز
مجموعة Megaclearالحياة
جهاز التنفس الصناعي للماوسجهاز هارفارد73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphateTriLink BiotechnologiesN-1081
NanoDrop SpectrometerThermo Scientific
Olsen hegar needle with stub sext مقص خياطةFST12002-12
قوالب البلازميدGeneArt ، Thermo Fisher Scientific
مقص تشريح حاد مدببFST14200-12
مجهر مجسمخيوط Zeiss
EthiconY433H5.00
خيوطEthiconY432H6.00
خيوطEthicon7733G7.00
T7 DNase إنزيمInvitrogenAMB13345مدرجة في محطة شريط مجموعة
MegascriptAligent4200
طقم تنظيف النسخInvitrogenAM1908Megaclear
Ultra-4 مرشحات الطرد المركزي 10kAmicon UFC801096
هارفارد تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
  2. Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modified mRNA DeliveryMyocardial Infarction ModelIntracardiac InjectionLAD LigationBioluminescence ImagingSucrose Citrate SolutionIntratracheal IntubationCre modRNA ExpressionLuciferase Protein ExpressionTransgenic ROSA26 Mice

Related Articles