Summary
Denne protokol præsenterer en enkel og sammenhængende måde at forbigående upregulate et gen af interesse ved hjælp af modRNA efter myokardieinfarkt i mus.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden. I det seneste årti er genterapi blevet en lovende behandlingsmulighed for hjertesygdomme på grund af dens effektivitet og ekstraordinære terapeutiske virkninger. I et forsøg på at reparere det beskadigede væv post-MI, forskellige undersøgelser har ansat DNA-baseret eller viral genterapi, men har stået over for betydelige forhindringer på grund af den dårlige og ukontrollerede udtryk for de leverede gener, ødem, arytmi, og hjertehypertrofi. Syntetisk modificeret mRNA (modRNA) præsenterer en ny genterapi tilgang, der tilbyder høj, forbigående, sikker, nonimmunogen, og kontrolleret mRNA levering til hjertet væv uden risiko for genomisk integration. På grund af disse bemærkelsesværdige egenskaber kombineret med sin klokkeformede farmakokinetik i hjertet, er modRNA blevet en attraktiv tilgang til behandling af hjertesygdomme. Men for at øge dens effektivitet in vivo, en konsekvent og pålidelig leveringsmetode skal følges. Derfor, at maksimere modRNA levering effektivitet og udbytte konsistens i modRNA brug for in vivo applikationer, en optimeret metode til forberedelse og levering af modRNA intracardiac injektion i en mus MI model præsenteres. Denne protokol vil gøre behandling af modRNA mere tilgængelig for grundforskning og translationel forskning.
Introduction
Genterapi er et kraftfuldt værktøj, der involverer levering af nukleinsyrer til behandling, helbredelse eller forebyggelse af sygdomme hos mennesker. På trods af de fremskridt i den diagnostiske og terapeutiske tilgange til hjertesygdomme, der har været begrænset succes i leveringen af gener i myokardieinfarkt (MI) og hjertesvigt (HF). Så ligetil som processen med genterapi synes, det er en markant kompleks tilgang i betragtning af de mange faktorer, der skal optimeres, før der anvendes en bestemt levering køretøj. Den korrekte leveringsvektor skal være ikke-immunogen, effektiv og stabil inde i den menneskelige krop. Indsatsen på dette område har skabt to typer af leveringssystemer: viral eller ikke-viral. De udbredte virale systemer, herunder genoverførsel med adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-associeret virus, har vist en usædvanlig transduktionskapacitet. Men, deres anvendelse i klinikker er begrænset på grund af den stærke immunrespons induceret1, risiko for tumorigenesis2, eller tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer3, som alle fortsat er en stor hindring for bred og effektiv anvendelse af virale vektorer i human genterapi. På den anden side, på trods af deres imponerende udtryk mønster, levering af nøgne plasmid DNA viser en lav transfection effektivitet, mens mRNA overførsel præsenterer høj immunogenicitet og modtagelighed for nedbrydning af RNase4.
Med den omfattende forskning inden for mRNA, modRNA er blevet et attraktivt redskab til levering af gener til hjertet og forskellige andre organer på grund af sine mange fordele i forhold til traditionelle vektorer5. Fuldstændig udskiftning af uridin med naturligt forekommende pseudouridin resulterer i et mere robust og forbigående proteinudtryk med minimal induktion af medfødt immunrespons og risiko for genomisk integration6. Nyligt etablerede protokoller bruger en optimeret mængde anti-reverse cap analog (ARCA), som yderligere forbedrer proteinoversættelsen ved at øge stabiliteten og transabiliteten af den syntetiske mRNA7.
Tidligere rapporter har vist udtryk for forskellige reporter eller funktionelle gener leveret af modRNA i gnaver myokardi efter MI. Med modRNA-applikationer er væsentlige områder af myokardiet, herunder både kardiomyocytter og ikke-kardiocycykardit, blevet transficeret efter hjerteskade8 for at fremkalde angiogenese9,,10,overlevelse af hjerteceller11og kardiomyocytproliferation12. En enkelt administration af modRNA kodet til muteret human follistatin-lignende 1 inducerer spredning af mus voksne cms og øger hjertefunktionen, nedsætter arstørrelse, og øger kapillær tæthed 4 uger efter MI12. En nyere undersøgelse rapporterede forbedret hjertefunktion efter MI med anvendelse af VEGFA modRNA i en svinemodel10.
Således, med den øgede popularitet af modRNA i hjertefeltet, er det vigtigt at udvikle og optimere en protokol for levering af modRNA til hjertet post-MI. Heri er en protokol, der beskriver forberedelse og levering af renset og optimeret modRNA i en biokompatibel citrat-saltvand formulering, der giver robust, stabil protein udtryk uden at stimulere nogen immunrespons. Den metode, der er vist i denne protokol og video viser standard kirurgisk procedure for en mus MI ved permanent ligation af venstre forreste faldende arterie (LAD), efterfulgt af tre site intracardiac injektioner af modRNA. Målet for dette papir er klart at definere en meget præcis og reproducerbar metode til modRNA levering til murine myokardiet for at gøre modRNA ansøgning bredt tilgængelig for hjertegenterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske procedurer, der er skitseret her, er blevet godkendt af Icahn School of Medicine på Mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Syntese af modRNA
BEMÆRK: Detaljerne i modRNA syntese kan findes i Kondrat et al.13.
- Bestil plasmid skabeloner (Tabel over materialer) og generere en ren PCR produkt til brug som mRNA skabelon.
- Forbered modRNAs ved transskription in vitro med en tilpasset ribosukleosid blanding af følgende (Tabel over Materialer):T7 transskription kit, 6 mM anti-reverse cap analog (ARCA) 30-O-Me-m7G (50) ppp(50)G, 75 mM guanosinturhosphat, 75 mM adenosinturhosphat, 75 mM cytidinturhosfat, 100 mM pseudouridin-5-triphosphat og T7 DNase-enzym.
- Rens modRNA lavet i trin 1.2 med en transskription oprydning kit (Tabel over materialer) og behandle med antarktisk fosfatase. Dernæst repurify modRNA med transskription oprydning kit og kvantificere det ved hjælp af et spektrofotometer.
- Udfæld modRNA med ethanol og ammoniumacetat og resuspendering i 10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA.
- Koncentrer modRNA til in vivo-levering ved hjælp af centrifugalfiltre, og mål kvaliteten ved hjælp af en automatiseret elektroforeseplatform (Tabel over Materialer).
2. Forberedelse af modRNA injektion til in vivo levering
- Det nødvendige volumen til 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA-injektion beregnes på baggrund af modRNA-koncentrationen.
- Det beregnede volumen af modRNA blandes med lige dele saccharoseopløsning fremstillet i nukleasefrit vand (0,3 g/ml) og 0,1 M citratopløsning (pH = 7) (20 μL hver anbefalet).
- Det endelige volumen af injektionen bringes op på 60 μL ved tilsætning af saltvandsopløsning.
3. Myokardieinfarkt kirurgi
- Anæstesi og klargøring af dyret
BEMÆRK: Denne undersøgelse bruger CFW-mus på 8-12 uger.- Anesthetize musen med 2% isoflurane ved hjælp af en induktion kammer og placere dyret på ryggen i en dorsal position med en ansigtsmaske over næsen og munden for at holde op anæstesi. Vedligehold anæstesien ved mekanisk ventilation ved hjælp af et åndedrætsværn udstyret med et 7-8 mm luftvejsrør og et filter.
- At immobilisere musen på kirurgi platform, sikre sine lemmer med kirurgisk tape. barber halsområdet og venstre side af brystkassen og desinficere med 70% ethanol og povidon jod. Gentag desinfektionstrinnet to gange. Kontroller dens reflekser, klemme halen og bagfødderne til at vurdere dybden af anæstesi.
- Kontinuerligt overvåge og vedligeholde kernekropstemperaturen ved normotermi (37,5−38 °C).
- Opretholde en åben luftvej ved at udføre intratracheal intubation. For at gøre dette, skal du placere musen i en ventral position med munden vender mod eksperimentatoren og forsigtigt trække tungen. Juster halsvinklen, og ret intubationsstien ud, og tryk intubationkanylen i.
- Hvis dyret ikke er i stand til at trække vejret igennem det, kan trakeostomi udføres. Udfør et cervikalt snit langs midterlinjen isolere hud, muskel, og væv skitserer luftrøret ved hjælp af et mikroskop. Når luftrøret er klart synligt, sættes endotrakealrøret ind i vævet mellem to patronringe under glottis ved at lave et lille hul og holde den kranielige del af luftrøret ved hjælp af mikrokirurgiske pincet.
- Overhold musens brystbevægelse for at kontrollere, at begge lunger får ilt. Respirationshastigheden (RR) skal være ca. 120 vejrtrækninger i minuttet med et inspiratorisk tryk på 17−18 cm H2O.
- Venstre forreste faldende (LAD) arterie ligation
- For at udføre LAD ligation, drej musen forsigtigt, så den ligger på sin højre side. Løft huden og udfør en venstresidet thoracotomy mellem 3. Brug en cautery for at forhindre blødning.
- Åbn brystkassen omhyggeligt, og når den er åben, skal du finde hjertet uden at røre lungen med en skarp genstand. Placer retractors i snittet for at holde brysthulen åben og har et klart udsyn til hjertet. Nu flytte lungerne til kanten af snittet og fjerne den del af hjertesækken, der dækker hjertet for at få adgang til den forreste overflade af hjertet.
- Omhyggeligt identificere LAD, som kan ses som en dyb lys rødt fartøj placeret mellem lungepulsåren og venstre aurikel. Ligate LAD proksimal med en enkelt sutur af en 7-0 silke sutur. Placer et brystrør (28 G, venalkateter), mellem 4.
- Luk brystindsnittet i lag. Brug 6-0 silkeløbe suturer til at tilpasse ribbenene og bruge 5-0 silkeløbende suturer til at lukke huden. Sørg for at efterlade et ordentligt vindue til fremtidig ekkokardiografisk måling.
- Forsigtigt dræne brystkassen med varm isotonisk opløsning (9 g natriumchlorid i 1 L vand) ved hjælp af en 2 ml sprøjte. Placer musen på ryggen. Hvis der udføres trakeostomi, tage endotrakeal rør ud og ved hjælp af 7-0 silke suturer tilpasse trakeal patron ringe med en enkelt søm. Placer ansigtsmasken på musen og luk huden ved hjælp af 5-0 silke kører suturer.
- I restitutionsfasen skal intubationkanylen kobles fra ventilatoren og tillade spontan vejrtrækning. Placer dyret under en varmelampe, indtil det opnår bevidsthed. Efterlad ikke dyret uden opsyn efter operationen, før det er helt vågent.
- Håndtere smertebehandling med buprenophine ved 0,1 mg/kg kropsvægt, injiceres subkutanet i de næste 3 dage med 12 timers mellemrum.
4. Hjertelevering af modRNA
- 60 μL af modRNA fremstillet i trin 2.3 intramuskulært (IM) ved hjælp af en insulinsprøjte (31 G) efter en MI.
- 20 μL af modRNA på tre forskellige steder i hjertemusklen omkring infarktområdet (to på hver side af ligationen og en i spidsen). Udfør injektionerne umiddelbart efter LAD, før brystet lukkes.
BEMÆRK: Repræsentative billeder af modRNA-injektionssteder kan ses i figur 1.
- 20 μL af modRNA på tre forskellige steder i hjertemusklen omkring infarktområdet (to på hver side af ligationen og en i spidsen). Udfør injektionerne umiddelbart efter LAD, før brystet lukkes.
5. Protein udtryk validering i hjerte post MI
- Luciferase modRNA-udtryk ved hjælp af et bioluminescensbilleddannelsessystem
BEMÆRK: I alt 100 μg Luc mRNA fremstillet i 60 μL af saccharosecitratbufferen injiceres direkte i hjertet af CFW-mus efter MI.- Ved 24 timers post MI og modRNA-injektion anæcize musene med 2% isofluran ved hjælp af et induktionskammer og intraperitoneally injicere luciferin (150 mg/g kropsvægt) for at validere Luc signal in vivo.
- Billede musene ved hjælp af en bioluminescens imaging system hver 2 min indtil Luc signalet når mætning.
- Kvantificer de indsamlede billeddata med billedanalysesoftware. Brug kun mus, der injiceres med saltvand, som basislinjeaflæsning for Luc-udtryk, og træk baggrundssignalet fra de saltvandsindsprøjtede mus.
BEMÆRK: Luc signalet udtrykkes i p/s/cm2/sr x 106.
- Immunstaining til validering af cre-transfekture
- For at validere transfekturet med Cre ofrer dyrene 24 h efterinjektion ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin efterfulgt af cervikal dislokation. Før du foretager et snit, desinficere brystet og maven ved hjælp af en 70% alkohol podning.
- Åbn brysthulen ved at gøre en tværgående snit ~ 1 cm lavere end brystbenet og flytte saks mod hovedet, skære gennem brystkassen.
- Åbn brystet og injicere 1 ml steril PBS i højre ventrikel kammer for at fjerne overskydende blod. Punktafgifter hjertet straks og læg det i den sterile PBS at vaske væk de resterende blod.
- Hjertet fastgøres i 4% paraformaldehyd (PFA) i 24 timer efterfulgt af inkubation natten over i 30% saccharoseopløsning ved 4 °C. Den følgende dag integrere hjerter i optimal skæretemperatur medium og sektion dem med en tykkelse på 10 μm ved hjælp af en kryostat.
- Plette sektionerne med primære antistof mod hjertetroponin I (cTNI) og mærke dem med et fluorescerende sekundært antistof. For at identificere kernen, pletten med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 5 min. Billede dias ved hjælp af en fluorescerende mikroskop.
6. Statistisk analyse
- En søjlegraf afbildes på grundlag af Luc-udtrykket i saltvands- og Luc-injicerede mus, og værdierne rapporteres som middel ± SEM. Sammenlign de to grupper ved hjælp af en ikke-parret t-test (****p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otte til ti uger gamle mus blev bedøvet med isofluran og intuberet. Efter dyret var under anæstesi, venstre thorax region blev barberet og steriliseret med ethanol, og hjertet blev udsat for LAD ligation. Den venstre koronararterie blev tilstoppet ved fast knuder suturen under arterien (diagram repræsentation Figur 1A). Efter en vellykket infarkt (indikeret ved paling af venstre ventrikelfri væg) blev en direkte indsprøjtning på 100 μg Luc eller Cre modRNA opløst i saccharosecitratbufferen leveret direkte ind i myokardiet tre forskellige steder (Figur 1B) omkring skadesområdet ved hjælp af en insulinsprøjte. MI-proceduren med modRNA-injektioner varede i 30−45 min pr. dyr. Dyrene viste ca. 90% overlevelsesrate efter proceduren. Efter proceduren, brystet og huden var fast sutureret i lag og dyret blev fjernet fra ventilation, så snart det begyndte at trække vejret normalt.
Efter at have udført LAD-ligationen og efterfølgende levering af Luc modRNA-injektionen validerede vi Luc modRNA-transfekturet ved at kontrollere for Luc proteinudtryk 24 h efterinjektion ved hjælp af et bioluminescensbilleddannelsessystem (Figur 2A). Vi har i tidligere publikationer fastslået, at selv om proteinudtrykket kan ses indtil dag 6 efter transtransfekturet, observeres den højeste transfektiseringseffektivitet af modRNA ved 24 h8. På samme måde har vi med succes opdaget Luc-signalet i hjertet behandlet med Luc modRNA-injektion (1,76 x 108) sammenlignet med mus injiceret med saccharosecitratbuffer efter MI (3,0 x 105) (Figur 2B).
Desuden forsøgte vi at validere modRNA-udtrykket ved at kontrollere dets oversættelse og biodistribution i en transgen Rosa26mTmG-mus. Dette musemodelsystem udtrykker det cellemembranlokaliserede tdtomat (mT) fluorescensudtryk i alle kroppens celler/væv og ændringer i cellemembranlokaliseret EGFP (mG) fluorescensudtryk ved Cre-rekombination. Således, at observere udtrykket af Cre modRNA, 100 μg Cre modRNA blev injiceret direkte ind i myokardi post-MI i Rosa26mTmG mandlige og kvindelige mus, og dyrene blev ofret 24 h postsurgery. Hjerter blev fastsat og behandlet til immunstaining med cardiomyocyt markør cTNI og nuklear markør DAPI (Figur 3A). Vellykket Cre udtryk var tydeligt på grund af fremkomsten af grønne farvede celler (Figur 3B), som var et resultat af rekombination med Cre modRNA leveret til musen, repræsenteret ved ændringen af tdTomato farve til EGFP omkring Cre injektionsstedet (Figur 3C).
Figur 1: LAD ligation og hjertelevering af modRNA. (A) Skematisk diagram, der viser området for LAD-ligation og tre steder, hvor modRNA-injektionen finder ud. (B) Repræsentative billeder af hele musen hjerte efter en vellykket MI induceret af permanent ligation (a) og steder for modRNA injektion efter MI. De 100 μg modRNA opløst i 60 μL saccharosecitratbuffer blev leveret i grænseområdet omkring infarktet, to på hver side af ligationen (b,c) og en i spidsen (d). Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Luc expression analyse post modRNA injektion. Saccharosecitratbuffer indeholdende 100 μg Luc modRNA blev injiceret direkte i myokardiet af CFW-mus i en åben brystoperation. Bioluminescens imaging systemet blev brugt til at beregne Luc protein udtryk på 24 timer efter injektion. (A) Sammenlignende bioluminescerende billeder af kontrolmus (transficeret med buffer) vs. mus injiceret med Luc modRNA. (B) Kvantificering af Luc-signal sammenlignet med kontrolmusene målt efter 24 timer ved hjælp af bioluminescensbilleddannelse. Fejllinjen repræsenterer SEM med p < 0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Validering af Cre-udtrykket in vivo. Repræsentative billeder af trans inficerede hjerte tværsnit (kort akse visning), der validerer udtrykket af Cre modRNA i Rosa26mTmG mus 24 timer efter injektion. (A) Kardiomyocytter immunostained med cTNI (rød). (B) Grønne farvede celler repræsenterer Cre transficerede celler. (C) Flettet billede, der viser Cre aktiverede celler omkring de to injektioner. Blå er den nukleare plet DAPI. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genterapi har vist et enormt potentiale til at fremme behandlingen af hjertesygdomme betydeligt. Men, traditionelle værktøjer ansat i de første kliniske forsøg til behandling af HF har vist begrænset succes og er forbundet med alvorlige bivirkninger. Modificeret RNA præsenterer en nonviral genlevering, der konstant vinder popularitet som et genoverførselsværktøj i hjertet. ModRNA kræver ingen nuklear lokalisering af gener til oversættelse, og giver dermed et effektivt og hurtigt udtryk for proteinet. Da mRNA ikke integreres i genomværet, springer genlevering fra modRNA over risikoen for mutagenese. På grund af sine fordele i forhold til konventionelle genleveringskøretøjer er modRNA derfor blevet en af de mest attraktive platforme til levering af enkelte gen- eller genkombinationer til hjertet. Men til dato er der ingen standardiseret protokol for forberedelse og overførsel af modRNA i hjertet efterberedning. Således var målet her at etablere en standard og optimeret protokol for intracardiac levering af modRNA i gnaver hjerte for at forbedre brugen af modRNA som et genterapi værktøj og gøre det egnet til terapeutiske formål.
I denne protokol fremstilles modRNA ved at erstatte uridine med pseudouridin, efterfulgt af capping med ARCA i 5' ende. Disse ændringer i den sekundære struktur af mRNA har vist sig at gøre højere proteinoversættelse sammenlignet med forskellige andre nukleotid modifikationer8. Desuden undslipper denne ændrede mRNA-struktur immunogeniciteten efter IM-injektioner hos mus ved at begrænse dens genkendelse af vejafgiftslignende receptorer og nukleaser6. Her viste vi, at nøgen mRNA levering med saccharose citrat buffer producerer stærk protein oversættelse i hjertet ved hjælp af en mus MI model. I vores tidligere undersøgelser, vi etableret overlegenhed modRNA leveret med saccharose citrat buffer i hjertet i forhold til indkapsling af modRNA i nanopartikler, såsom in vivo hungersnød eller in vivo jetPEI, som kan hindre modRNA oversættelse til protein8. Den høje bevaring af RNA ved citrat og ekstra energi, som saccharose for endocytose ud over at redde den enkeltstrengede modRNA-sammenklumpning kunne være årsagen til den markante stigning i oversættelsen af modRNA leveret i saccharosecitratbuffer.
Selv om brugen af modRNA er eskaleret i prækliniske og kliniske undersøgelser10,14 i det seneste årti, visse områder skal undersøges for forbedret succes modRNA i klinikken. For det første kan syntetisere modRNA i de store mængder, der kræves til terapeutiske undersøgelser være omkostningseffektive uoverkommelige. Derfor er det vigtigt at udvikle klinisk-grade og omkostningseffektiv modRNA at flytte området mod en klinisk RNA terapi fase hos mennesker. For det andet skal der identificeres en klinisk anvendelig leveringsmetode for modRNA. I betragtning af de skader forårsaget af hjerte-IM injektioner, mindre invasive kateter-baserede leveringsmetoder kan være mere plausibel i at overføre den store mængde af modRNA er nødvendige for at transfect store hjerter.
Afslutningsvis viste dette arbejde en vellykket levering af RNA indeholdende pseudouridin ændringer i musehjerte efter MI. Leveringen af modRNA i saccharosecitratbuffer gav et stærkt proteinudtryk 24 timer efter injektionen. Denne protokol gør det muligt for forskerne at følge en standardiseret levering og protein evaluering i hjertet efter skade og dermed give mere tilgængelighed i forberedelsen og leveringen af modRNA for deres forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Ann Anu Kurian for hendes hjælp med dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af et kardiologiudstartstilskud til Zangi-laboratoriet og også nih-tilskud R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
