Summary
同じ宿主種からの一次抗体を用いた多重免疫染色に対して、いくつかの異なる方法が確立されている。ここでは、ホルマリン固定パラフィン組み込みマウス副腎切片でのマルチプレックス免疫染色中の抗体クロス反応性を遮断するためのマイクロ波媒介抗体ストリッピングおよびフルオロフォア・チラミドの使用について説明する。
Abstract
免疫染色は、与えられたタンパク質の細胞発現パターンを示す生物医学研究で広く使用されている。多重免疫染色は、複数の一次抗体を使用して標識を可能にします。抗体の交差反応性を最小限に抑えるために、間接染色を用いた多重免疫染色には、異なる宿主種からの標識されていない一次抗体が必要です。しかしながら、異なる種抗体の適切な組合せは、必ずしも利用可能とは限らない。ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)マウス副腎切片に対する多重免疫蛍光に対して、同じ宿主種からの非標識一次抗体(例えば、この場合は両方の抗体がウサギ由来)を用いる方法を説明する。この方法は、抗原検索ステップで使用された同じ手順と試薬を用いて、前染色された一次抗体複合体の活性を取り除く。スライドは、一般的な免疫染色プロトコルを使用して第1一次抗体を染色し、その後にビオチン化二次抗体との結合ステップを行った。次に、フッ素動素を基質として、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼシグナル現像法を用いた。第1次抗体複合体の免疫活性を、8分間のマイクロ波沸騰クエン酸ナトリウム溶液に浸漬して剥ぎ取った。不溶性の蛍光素体の沈着はサンプル上に残り、スライドを他の一次抗体で染色することができた。この方法は、ほとんどの偽陽性シグナルを排除しますが、抗体の交差反応性の背景が残る可能性があります。サンプルが内因性ビオチンで濃縮される場合、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用してビオチン化二次抗体を置換し、回収された内因性ビオチンからの偽陽性を回避することができる。
Introduction
多重免疫染色では、結合された一次抗体を用いた直接染色は有益な結果を提供することができる。二次抗体を使用しない場合、直接染色法は抗体交差反応性からの偽の共局在化シグナルのリスクが低い。しかし、一次抗体上の共役レポーター(フルオロフォア、酵素)またはビオチンは、その将来の使用を制限する。あるいは、間接免疫染色は、通常、標識された二次抗体を有する非共役一次抗体を用いてより強いシグナルを提供する。理想的には、多重免疫染色に使用される非共役一次抗体は、抗体交差反応性を回避するために異なる宿主種から来るべきである。しかしながら、異なる宿主種からの一次抗体の適切な組み合わせは、必ずしも利用可能とは限らない。
望ましくない一次抗体と反応する二次抗体のリスクを排除するために、いくつかの方法が確立されている。一般的な方法の1つは、第2一次抗体1で染色する前に、第1次抗体複合体上の残りの結合エピトープを遮断するF(ab)単量体抗体の使用である。抗体ストリッピングは、ウェスタンブロットシートのストリップおよび再プローブと類似しており、3,3'-ジアミノベンジドテトラヒドロリド(DAB)2および蛍光性チラミド堆積物3等の検出可能なレポーター分子の沈着を剥離することなく、以前染色した抗体複合体を除去する。この方法では、異なる色のレポーター分子が同じスライド上で多重結果を示すことができます。また、多重染色は、抗体の前に堆積した層を完全に除去し、その後に他の抗体から取得した画像のアライメントによっても達成可能である4、5。これらの方法はすべて信頼性の高い結果を得ることができますが、各方法には制限があり、複雑な手順または特別なイメージングシステムが必要です。
本プロトコルは、一般に利用可能な緩衝液を用いて抗体ストリッピング法を適用することを示す。このプロトコルは、同じホスト種からの2つの未標識一次抗体を有するホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)マウス副腎セクションに対して多重免疫蛍光染色を行うために使用することができる。
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Protocol
1. 第1抗体で染色する
- 脱ワックスおよびリハイドレートFFPEスライドは、以下の各ステップに5分ずつ割り当て済み:キシレンまたは同等の試薬3x、100%エタノール2x、95%エタノール1x、70%エタノール1x、50%エタノール1x、蒸留水2倍。
注:スライドは、最後のステップに取り付けるまで、この再水和ステップから始めて湿った状態を保つ必要があります。 - 任意抗原検索のために、8分間の沸騰クエン酸ナトリウム溶液(10mM、pH = 6.0)の275mLにスライドを置きます。溶液を沸騰させ続けるには、スライドを14 x 9.5 x 9 cm3(W x L x H)ピペットチップボックスの底に平らに置き、蓋をして70%のパワーで溶液を電子レンジで700W電子レンジで8分間置きます。その後、電子レンジからピペットチップボックスを取り出し、蓋を開け、溶液を室温(RT)で少なくとも20分間冷やします。
- スライドをPBST(0.1%ポリソルベート20/80のリン酸緩衝生理食塩水)を含むCoplin瓶に移します。PBSTで5分3倍洗浄します。すぐに次のステップに進まない場合は、このステップでスライドをRTのCoplin jarに数時間、または4°Cで1〜2日間保存します。
- ブロッキング溶液を調製するには、二次抗体の宿主種の正常血清をブロッキング試薬として用いる。他の市販ブロッキング試薬も使用できる。本研究で提示された研究に用いた正常血清を用いた場合、PBSTの4.9 mLに100μLの正常なロバ血清を加える。ブロッキング溶液は、4°Cで最大3日間保存できます。
- ブロッキングの場合は、スライドからPBSTを振り払い、十分なブロッキング溶液で素早くカバーします。30分間加湿チャンバーでRTでスライドをインキュベートします。
- ブロッキング溶液を使用して一次抗体溶液(2回のスライドで500μL)を調製し、一次抗体を所望の濃度に希釈する。溶液は、使用するまで氷の上に保存する必要があります。
- 3βHSDの場合、498 μLのブロッキング溶液に3βHSDの2μLを加えます。
- THの場合、499 μLのブロッキング溶液に0.5μLのTH抗体を添加します。
- β-カテニンの場合、499 μLのブロッキング溶液に1μLのβカテニン抗体を添加します。
- 20αHSDの場合、ブロッキング溶液の499 μLに20αHSD抗体の1μLを加えます。
- CYP2F2の場合、CYP2F2抗体の2μLを498μLのブロッキング溶液に添加します。
- 一次抗体をスライドから遮断液を振り払い、それらを十分な一次抗体溶液で素早く覆すことで、一次抗体をインキュベートする。4°Cで一晩加湿チャンバー内のスライドをインキュベートする。インキュベーション中、スライドは、乾燥を防ぐためにパラフィンフィルムの小片で覆われてもよい。
- 翌朝、5分3倍のPBSTでスライドを洗います。
- ビオチン化二次抗体を所望の濃度(例えば、ロバ抗マウス抗体またはロバ抗ウサギ抗体の1μL)を499μLのブロッキングに希釈するブロッキング溶液(2つのスライドのための500μL)を使用して二次抗体溶液(2つのスライドのための500μL)を調製するソリューション)。溶液は、使用するまで氷の上に保存する必要があります。
- スライドからPBSTを振り払い、十分な二次抗体溶液で素早く覆うことによって、第2の抗体をインキュベートする。RTで1時間の加湿チャンバーでスライドをインキュベートします。
注:内因性ビオチンが懸念される場合は、ビオチン化二次抗体の代わりにペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用してください。ステップ1.10でペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用する場合は、ステップ1.14へジャンプする。 - 5分3倍のPBSTでスライドを洗います。
- ワサビ酸ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(SA-HRP)溶液(2回のスライドで500 μL)を調製し、0.5 μLのSA-HRPをPBSの499μLに加えます。最終濃度は1μg/mLです。
- SA-HRP溶液を使用してインキュベートします。スライドからPBSTを振り払い、十分なSA-HRPソリューションでスライドを素早くカバーします。RTで0.5時間の加湿チャンバーでスライドをインキュベートします。
- 5分3倍のPBSTでスライドを洗います。
- フッ素フォア・チラミド溶液を、メーカーの指示に従って希釈バッファーで希釈液(例えば、5 μLのフルオロフォア・チラミドを496μLの希釈バッファーに希釈)して希釈液を希釈して調製します。
- スライドからPBSTを振り払い、十分な蛍光体-腸溶性溶液でスライドを素早く覆すことで、フルオロフォア・チラミドでシグナル開発を行います。RTで1分間加湿チャンバーにインキュベートします。インキュベーション時間は、所望の蛍光強度を得るように調整されてもよい。PBSTを含むCoplinジャーにスライドを転送して反応を停止します。3分2xのPBSTでスライドを洗います。
- シグナルは、蛍光顕微鏡下で速やかにチェックして、この段階で結果を確認してもよい。カバースリップが使用されていない場合は、サンプルを湿らせたままに、各セクションにグリセロール:PBS(1:1)のドロップを適用します。3分2xのPBSTでスライドを洗います。スライドは、次のステップに移動する前に、3日間PBSTで数日間保存され得る。
2. 最初の抗体を取り除く
- 275 mLの沸騰したクエン酸ナトリウム溶液(10mM、pH = 6.0)に少なくとも8分間置きます。スライドを14 x 9.5 x 9 cm3(W x L x H)ピペットチップボックスの底に平らに置き、700Wの電子レンジで70%の電力で溶液をマイクロウェーブして沸騰させます。より長い剥離時間が好ましい場合は、常にスライドをバッファー溶液に浸し続けるために、沸騰したクエン酸ナトリウム溶液を使用して緩衝液を上に置く必要があるかもしれません。電子レンジからピペットチップボックスを取り出し、蓋を開け、溶液をRTで少なくとも20分間冷やします。
- スライドをPBSTを含むコプリン瓶に移します。PBSTで5分3倍洗浄します。すぐに実行しない場合は、次のステップをRTで数時間または4°Cで1〜2日間COPリンジャーに保存します。
3. 第2抗体を含む染色
- ブロッキング ステップから開始し、ステップ 1.5 からステップ 1.14 の同じ手順に従います。シグナル発生ステップ(ステップ1.15およびステップ1.16)で、異なる蛍光スペクトルで蛍光体-tyramideを使用します。
注: マルチプレックス染色を可能にするために、この方法を使用してスライドを複数回削除できます。最後の抗体は、レポーターとして蛍光体-腸化剤を必要としません。フルオロフォア結合二次抗体は、最後の一次抗体からのシグナルを示すために使用されるかもしれません。 - 核カウンター染色が必要な場合は、RTで2 μg/mL 4'、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)またはヘクスト溶液を1分間インキュベートします。その後、3分2倍のPBSTでスライドを洗います。
4. 蛍光顕微鏡を用いた画像診断による信号検出
- 免疫蛍光に適した取り付け媒体のドロップでカバースリップを取付けます。
- イメージングのために、蛍光顕微鏡を使用して、各蛍光チャネルのシグナルを検出します。核染色(DAPI)チャネルと4xレンズから始め、スライド上の組織を見つけます。
- イメージング用の10倍レンズに切り替えます。露光時間(300ミリ秒)と光源の強度(80%の強度)を調整します。信号が明るすぎる、または暗すぎる場合は、これらの設定を調整します。ステージを動かさずに各チャンネルの写真を撮ります。各チャンネルに再焦点を当てる必要があります。顕微鏡ソフトウェアまたはImageJ(imagej.nih.gov/ij/)を使用して、各チャンネルの画像をマージします。
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Representative Results
その結果は、抗原検索ステップ1.2を含む記載の全工程で処理されたサンプルから得られた。ここで使用した全二次抗体はビオチン化された。フルオロフォア・チラミドは、第1および第2の一次抗体からのシグナルを開発するために使用された。画像は、FITCキューブ(緑色蛍光用)、TxREDキューブ(Cy3用)、およびDAPIキューブ(DAPI用)を備えた蛍光顕微鏡を使用して撮影した。
マイクロウェーブ媒介型ストリッピングにより、クロスリアクティブ性を排除します。
マウスFFPE副腎切片は、2つの一次ウサギ抗体を用いて染色した。ストリッピングなし (図 1A-C),TH のための二次抗体は 3βHSD(+) 部位をピックアップし、副腎皮質に赤信号を与えました (図1B).ストリッピングの欠如は、黄色で見られる偽の共局在化信号につながった (図 1C)。この交差反応性は、(1)第1のチラミド反応を触媒したHRP酵素と(2)抗体種の交差反応性から来ている。最初の免疫染色から抗体の交差反応性とHRPを除去するために、1分(図1D-F)と8分のマイクロ波媒介ストリッピング(図1G-I)を試験した。両方の治療は、非特異的シグナルを排除するのに十分であり、きれいな二重染色結果を与えた(図1F,I)。陰性対照は、一次抗体によるインキュベーションを除いて、同じステップのすべてを追跡した(図1J)。ネガティブコントロールでは有意なシグナルは取り上げなかった。この結果、沸騰クエン酸緩衝液中の8分間のストリッピングは、副腎で一般的に使用される多くの抗体に対する抗体の交差反応性を排除するのに十分であることがわかった(図2)。
この制限は、マイクロ波媒介ストリッピングの有効性は抗体に依存する。
このプロトコルで使用されるマイクロ波媒介ストリッピングはほとんどの場合に機能しますが、この方法には制限があります。いくつかの抗体の場合、クエン酸緩衝液を用いたマイクロ波媒介ストリッピング法は、抗体の交差反応性を完全に除去しない場合があります。例えば、マウス抗TH抗体およびマウス抗CYP2F2抗体からほとんどの非特異的シグナルを除去した8分間のストリッピングが、依然として弱い偽陽性シグナルが検出可能であった(図3Eの髄質と図3Kの内側皮質)。なお、マイクロウェーブ時間が20分に増加しても、抗体の交差反応性は完全には除去されなかった(図3H,K)。
図1:P1 FFPEマウス副腎における代表的な二重免疫染色。FFPEマウス副腎切片は、ウサギ由来の2つの一次抗体で染色した:抗3βHSD(緑=皮質)、抗TH(赤色=髄質)。汚れの3つのグループには、(A-C)ストリッピングなし、(D-F)1分ストリッピング、および(G-I)8分ストリッピングの3つの異なるストリッピング手順が含まれます。なお、マイクロウェーブを伴わない、THを用いた二次抗体は依然として3βHSDシグナルを拾い上げ、一方、特異的染色結果は1分および8分マイクロウェーブ処理群で得られた。陰性対照には陽性シグナルはなく、一次抗体ではインキュベートされない。スケールバー = 100 μm. DAPI = 細胞核, 青.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:P21 FFPEマウス副腎における代表的な二重免疫染色。FFPEマウス副腎切片を、ウサギ由来の2つの一次抗体で、抗β-カテニン(緑=外皮質)と抗20αHSD(赤色=内皮質)で染色した。間に8分のストリッピングステップを行った。スケールバー = 100 μm;DAPI = 細胞核、青。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:一部の抗体は完全に剥がされておらず、弱い非特異的シグナルを引き起こす可能性があります。FFPEマウス副腎切片をマウス由来の2つの一次抗体で染色した:抗CYP2F2(緑=内皮質)および抗TH(赤色=髄質)。ストリッピング群(A-C)の結果は、CYP2F2タンパク質を検出するための反応がまだTH(+)領域を染色したことを示した。副腎髄質(C)に偽の共局在が見られた。8分と20分のマイクロ波処理は髄質の緑色蛍光強度を減少させたが、顕著な背景が依然として存在する(D-I)。抗CYP2F2抗体は、マイクロウェーブ(J-L)の20分後でもクロス反応性を完全に除去できないことを示す別の例である。なお、陰性対照には陽性シグナルが存在せず、一次抗体ではインキュベートされず、抗体の交差反応性(M)からの偽陽性シグナルを示す。スケールバー = 100 μm;DAPI = 細胞核、青。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
多重免疫染色は、2種以上の抗原の細胞共局在を調べるのに有用である。この広く使用されている技術は、一次抗体が異なるレポーター(直接染色)と共役する際に説得力のある共局在化結果を与えます。しかし、直接染色は通常、一次抗体を検出するために結合された二次抗体を含む間接染色と比較して弱いシグナルを提供する。間接染色において、高品質の多重免疫染色結果は、二次抗体が異なる一次抗体を区別できるかどうかに依存する。抗体の交差反応性の可能性があるため、間接染色法を利用した多重染色は、異なる宿主種からの一次抗体によりより明確に見られる。Carlたちは、過剰な非結合IgG F(ab)断片を用いて抗体交差反応性を遮断するプロトコルを開発した1.同様の戦略は、F(ab)単量体抗マウス抗体を使用して、抗マウス二次抗体が組織内の内因性マウス免疫グロブリンを検出するのを防ぐ「マウスオンマウス」染色にも使用されています。しかし、このブロッキング法は時間がかかり、特に検出抗原が高存在度の場合は、前のステップから抗体を完全に遮断しない可能性があります2。
熱媒介性ストリッピングは、多重免疫染色における抗体の交差反応性を防止する別の方法です。概念は、ウェスタンブロットのストリップと再プローブ法に似ています。クエン酸緩衝液中のスライドを沸騰させるマイクロ波の使用は、抗体の交差反応性を遮断する上で顕著な肯定的な効果を有した。2つの5分のマイクロ波処理は、着色免疫染色の連続ラウンド間で、マウスモノクローナル抗体2を用いて同じスライド上の複数の抗原の検出を可能にする。HRPの基質として蛍光体-チラミドを使用するチラミドシグナル増幅(TSA)法と組み合わせたマイクロ波処理は、免疫蛍光二重染色3、6、7にも有用である。第1染色サイクルと第2染色サイクルの間のマイクロ波処理は、その蛍光性チラミド沈殿を洗い流すことなく、第1の免疫複合体の活性を遮断する。しかし、マイクロ波処理では染色8の汚染を完全に防ぐことができない場合があります。ストリッピングバッファーの異なるタイプを使用する方法の中には、より良いストリッピング効果を提供するものもありますが、インキュベーション時間が長い特殊なバッファーが必要な場合や、サンプルは、別の汚れが適用される前に画像取得を行う必要があります 4,5,7,9,10,11.ここでは、多重免疫蛍光染色におけるマイクロ波媒介抗原検索のための、より複雑でない手順と共通のバッファーを用いた簡単な方法を示す。この方法は、ほとんどのクロス反応性を排除しますが、ユーザーは20分のマイクロ波処理後でも、いくつかの抗体と見なされる可能性のある弱い偽の共局在化を認識する必要があります。
内因性ビオチンは、副腎皮質12におけるステロイド原性細胞のマーカーとして使用することができる。ストレプトアビジン結合フルオロフォアだけでも内因性ビオチンを検出するのに十分であり、特に凍結した切片では副腎皮質全体を点灯します。内因性ビオチンは通常FFPEサンプル中でブロックされるため、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ手順(すなわち、ABCキット)は、FFPE副腎試料中の標的を増幅するために依然として広く使用されています。抗原検索工程はまた、内因性ビオチンのマスクを解除し、その免疫活性13を誘導することに注意することが重要である。マイクロ波媒介抗原検索とストレプトアビジン結合型HRPの使用を組み合わせた方法であるため、内因性ビオチンは、特に内因性ビオチン(肝臓、腎臓、一部の腫瘍)が豊富な組織において偽陽性シグナルにつながる可能性がある。シグナルを増幅するためにアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ処置が必要な場合、遊離アビジンおよび遊離ビオチンによるプレインキュベーションなどの追加ブロッキング工程は、内因性ビオチンシグナル14を減少させるのに役立つ可能性がある。本方法は、FFPEマウス副腎に低い内因性ビオチンバックグラウンドを与えますが、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ法を使用する場合は常に各サンプルに陰性対照を含める必要があります。代替アプローチは、ビオチン化二次抗体の代わりにペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用することです。
我々の結果は、クエン酸緩衝液によるマイクロ波処理が多重免疫蛍光染色に有用な方法であることを実証する。ただし、すべての相互再活動を完全にブロックできるわけではないことに注意してください。弱い偽の共局在化が可能です。このプロトコルは、異なる宿主種からの一次抗体の適切な組み合わせが利用できない場合の代替アプローチとして使用することができる。ユーザーは、残りの交差反応性だけでなく、回復された内因性ビオチンから可能な偽陽性を認識する必要があります。.適切な負のコントロールは常に含める必要があります。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、NIH R00 HD00 HD032636 によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
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