Summary
В этом протоколе мы описываем модель мыши неполной хирургической резекции саркомы мягких тканей для тестирования (нео)адъювантной терапии.
Abstract
Хирургия часто является первым методом лечения многих твердых опухолей. Тем не менее, местные рецидивы часто происходят после первичной резекции опухоли, несмотря на адъювантные или нео-адъювантные терапии. Это происходит, когда хирургические поля недостаточно без опухоли, в результате чего остаточные раковые клетки. С биологической и иммунологической точки зрения, хирургия не является нулевым событием; рана исцеления окружающей среды, как известно, вызывают как про-и противоопухолевых путей. Как следствие, доклинические модели для разработки лекарств, направленных на предотвращение местного рецидива должны включать хирургической резекции при тестировании новых (нео)адъювантной терапии, для моделирования клинических условий у пациентов, получавших хирургическое вмешательство.
Здесь мы описываем модель мыши неполной хирургической резекции саркомы мягких тканей WEHI 164, которая позволяет тестировать (нео)адъювантные терапии в установке реакции заживления ран. В этой модели, 50% или 75% опухоли удаляется, оставляя некоторые ткани рака на месте для моделирования валового остаточного заболевания после операции в клинических условиях. Эта модель позволяет тестирование терапии в контексте хирургии, а также с учетом раны исцеления ответ, который может повлиять на эффективность (нео) адъювантных методов лечения. Неполная хирургическая резекция приводит к воспроизводимой отрастающей опухоли у всех мышей при отсутствии адъювантной терапии. Адъювантное лечение блокадой контрольно-пропускных пунктов приводит к уменьшению отрастания опухоли. Эта модель, таким образом, подходит для тестирования терапии в контексте хирургии debulking и связанных с ней раны исцеления ответ и может быть распространена на другие виды твердого рака.
Introduction
Хирургия остается основным вариантом лечения для многих твердых опухолей1, в том числе саркома мягких тканей2,3. Несмотря на улучшения в методах хирургии рака, и комбинации с (нео) адъювантной терапии, есть еще высокий риск рецидива рака и метастазов после первичной резекции опухоли4,5. В саркоме мягких тканей рецидивы возникают особенно локорегически, в месте проведения операции, что приводит к повышенной заболеваемости и смертности. В клинических условиях может быть трудно получить достаточно широкие поля (например, из-за анатомических ограничений), что приводит к неполной резекции и последующему рецидиву опухоли6. Хирургическое напряжение и последующий процесс заживления ран, как известно, создают иммуносупрессивную микроокироволиню опухоли, благоприятную для рецидива опухоли7,,8. Поэтому при открытии и разработке новых методов лечения саркомы мягких тканей, особенно иммунотерапии, следует в идеале учитывать хирургическую реакцию на заживление ран.
Большинство доклинических исследований для адъювантной терапии первоначально проводятся с использованием подкожной сингенной или ксенотрансплантации мыши модели, без включения хирургического стресса и раны исцеления ответ9,10. Поэтому мы разработали сингенную подкожную модель саркомы мягких тканей мыши, включающую неполную хирургическую резекцию. WEHI 164 фиброзаркома клетки прививки подкожно, и как только опухоли установлены, мы удаляем 50-75% опухоли навалом (Рисунок 1A-E). Опухоли постоянно вновь растут из оставшейся опухоли. Эта модель позволяет для тестирования адъювантной терапии при рассмотрении эффекта хирургического стресса и заживления ран. Аналогичные хирургические модели неполной резекции были использованы в ряде исследований несколькими группами и оказались воспроизводимыми и эффективными11,12,13. Здесь мы предоставляем подробное описание этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Звери, использовавшиеся в этих экспериментах, были получены из Центра ресурсов для животных (Перт, Западная Австралия). В Северном фонде медицинских исследований Имени Гарри Перкинса (Perth, Западная Австралия) животные находились в стандартных условиях, свободных от патогенов. Все эксперименты проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по медицинской этике Института медицинских исследований Гарри Перкинса. В этих экспериментах использовались мыши 8-12 недель. Линия клеток WEHI 164 фиброзаркома была получена от CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Прививка клеток
- Подготовка клеток и животных
- Убедитесь, что линия ячейки поддерживается в рекомендуемых носителях. Например, поддерживать WEHI 164 клеточной линии в Розуэлл Парк Мемориал институт (RPMI) 1640 средних дополнен 2 мМ L-глютамин, 10% плода бычьей сыворотки, 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркаптопотоэтаноло, 100 U /mL пенициллин, и 100 мкг/млептецин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проходные клетки не менее 3 и до 5 раз после удаления из криогенного хранилища. Чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность клеток, клетки должны быть разделены, когда они находятся между 70-80% слияния. Линии опухолевых клеток должны быть проверены на микоплазму, так как инфекция может изменить рост клеток и влиять на иммунный ответ in vivo. - За день до прививки, брить мышей на правом нижнем фланге с помощью клиперов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте были использованы самки мышей BALB/c в возрасте от 8 до 12 недель нормального веса (16 -22 грамма). - В день прививки, урожай WEHI 164 клетки, когда 70-80% сливаются при трипсинизации.
- Аспирировать культурную среду из тканевых фляг, а затем добавить стерильные фосфат буферизированный раствор (1x PBS), чтобы удалить оставшиеся следы сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
- Аспирировать PBS из ткани культуры фляги. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина (для колбы T75), а затем закружите колбу так, чтобы вся поверхность колбы с клетками покрывалась трипсином.
- Инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатора в течение 3 мин. Периодически проверяйте клетки, нажав по бокам колбы, чтобы увидеть, если клетки выбили.
- Удалите колбы из инкубатора культуры клеток и добавьте 5 мл носителей, дополненных FBS, чтобы нейтрализовать трипсин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте клетки в трипсине дольше, чем это необходимо, так как это может повредить клетки и привести к низкой жизнеспособности клеток. - Pipet подвеска несколько раз, чтобы получить одноклеточную подвеску. Перенесите суспензию к конической центрифуге.
- Пеллет клетки, вращаясь на 350 х г в течение 3 мин.
- Вымойте клетки три раза в 1x PBS.
- Resuspend клетки в 50 мл стерильных 1x PBS и мыть клетки с помощью pipetting клеточной подвески вверх и вниз. Пеллет клетки, вращаясь на 350 х г в течение 3 мин.
- Аспирировать супернатант и resuspend клетки в 15 мл стерильных 1x PBS. Вымойте клетки с помощью суспензии ячейки вверх и вниз. Пеллет клетки, вращаясь на 350 х г в течение 3 мин.
- Аспирировать супернатант и resuspend клетки ровно в 10 мл стерильных 1x PBS. Вымойте клетки, как в шаге 1.1.4.2 и передачи небольшое количество (примерно 100 мл) клеточной подвески в центрифугу трубки для подсчета. Пеллет клетки, вращаясь на 350 х г в течение 3 мин.
- Определите номер ячейки с помощью метода синюю исключение Trypan либо с помощью гемоцитометра, либо с помощью автоматизированного счетчика клеток. Resuspend клетки в стерильных 1x PBS в концентрации 5 х 106 клеток/mL. Держите суспензию клеток на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность опухолевых клеток должна быть равной или выше 80%, чтобы обеспечить воспроизводимый рост опухоли.
- Убедитесь, что линия ячейки поддерживается в рекомендуемых носителях. Например, поддерживать WEHI 164 клеточной линии в Розуэлл Парк Мемориал институт (RPMI) 1640 средних дополнен 2 мМ L-глютамин, 10% плода бычьей сыворотки, 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркаптопотоэтаноло, 100 U /mL пенициллин, и 100 мкг/млептецин.
- Подкожная прививка
- Тщательно перемешайте суспензию клетки и заполните шприц иглой 26 Г с 100 мл клеточной суспензии (5 х 105 ячеек) в стерильном 1x PBS. Повторите смешивание клеток перед загрузкой следующего шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите клетки на льду на протяжении всей процедуры для поддержания жизнеспособности. - Сдержать мышь соответствующим образом, обеспечивая доступ к нижнему правому флангу. Прививать мышь подкожно на бритом нижнем правом фланге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что прививка не в брюшной полю, подняв иглу немного, которые должны быть видны под кожей. Пузырь-как комок должен образовываться под кожей после прививки. - Монитор мышей в соответствии с применимыми утверждения этики и выполнять хирургическую резекцию, когда опухоли выросли до размера около 50 мм2.
- Тщательно перемешайте суспензию клетки и заполните шприц иглой 26 Г с 100 мл клеточной суспензии (5 х 105 ячеек) в стерильном 1x PBS. Повторите смешивание клеток перед загрузкой следующего шприца.
2. Частичная хирургическая резекция опухоли
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует двух исследователей; один для хирургических процедур (SURGEON), а другой для мониторинга мыши (ASSISTANT).
- Хирургия установки
- На 12-й день после прививки, когда опухоли достигли размера около 50 мм2, доза мышей с 100 мл (0,1 мг/кг) бупренорфина s.c. в потертости шеи, за 30 минут до операции.
- Настроите хирургическую зону с тепловой площадкой, покрытой скамейкой, и установите носовой конус для анестезии. Стерилизовать хирургические инструменты перед использованием, и между каждым животным с помощью стерилизатора тепловой шарик, что позволяет инструменты для охлаждения перед использованием. Иметь следующее хирургическое оборудование чистой и в пределах легкой досягаемости: хлоргексидин, тампон, марля, гель для глаз, два изогнутых щипцы, ножницы, клип аппликатор, клип удаления, клип пополнения (Рисунок 2A, 2B).
- Разогрейте нагревательную камеру до 37 градусов по Цельсию и установите еще одну тепловую площадку для восстановления(рисунок 2C). Поместите стерилизованные инструменты на стерильную поверхность, такие как автоклавированные прокладки.
- Анестезии
- Поместите мышь в индукционной камере и обезболить мышь 4% изофлуран (4% в 100% кислорода со скоростью потока 1 л/мин) до тех пор, пока частота дыхания замедляется примерно до 60 вдохов в минуту (1 в секунду) (это обычно занимает йтт;1 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте мышь в камере слишком долго, как это может привести к удушью и смерти. Только одна мышь под наркозом за один раз. - Перенесите мышь на тепловую площадку на хирургическом столе, поместите мышь с носом в носовый конус и поддерживайте состояние анестезии с 3-4% изофлураном в 100% кислороде со скоростью потока 0,5 л/мин. Мониторинг скорости дыхания, чтобы обеспечить сохранение глубины анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: ASSISTANT должен контролировать дыхание мыши на протяжении всей операции, чтобы обеспечить правильный уровень анестезии поддерживается. Снижение концентрации анестезии, если дыхание становится слишком медленным или увеличить концентрацию, если глубина анестезии слишком мелкой. Если мышь начинает задыхаться, удалите мышь из носового конуса, уменьшите анестезирующую концентрацию и подождите, пока дыхание нормализуется, прежде чем снова поместить на нос конус. - Выполните "пинч-тест" и "рефлекторный тест роговицы"14, чтобы убедиться, что мышь полностью анестезируется перед началом операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение любой части мыши является признаком того, что мышь не полностью анестезируется. Животному следует немедленно дать дополнительную анестезию, увеличив анестезирующую концентрацию. - Обложка глаза мыши с небольшим количеством офтальмологического геля, чтобы избежать сухости глаз.
- Поместите мышь в индукционной камере и обезболить мышь 4% изофлуран (4% в 100% кислорода со скоростью потока 1 л/мин) до тех пор, пока частота дыхания замедляется примерно до 60 вдохов в минуту (1 в секунду) (это обычно занимает йтт;1 мин).
- Хирургическая процедура (SURGEON)
- Swab хирургической области 3 раза с алкогольным хлоргексидином. Используя щипцы и ножницы, сделайте 1 см прямой разрез вдоль спинной стороны, в 3 мм от опухоли(рисунок 3A, 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизация разреза до 1 см в каждой мыши (с помощью линейки) позволяет даже оценить заживление ран между мышами. Обнаружение разреза в 3 мм от опухоли позволяет проводить последующую внутриопухолевую адъювантную терапию без утечки из раны. - Используя пинцет, вытяните фасию и подкожную жировую ткань между опухолью и брюшумом. Подкожная опухоль обычно прикрепляется к коже.
- Откройте рану, аккуратно удерживая кожу на стороне подшипника опухоли с помощью пинцета, и "инвертировать" опухоль так, чтобы она была видна снаружи(Рисунок 3C, 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел опухоли, которые будут обнуляются должны быть ближе всего к открытию, чтобы иметь достаточно кожи, чтобы закрыть рану. Будьте осторожны, чтобы не сократить кожу при удалении опухоли. - Используя ножницы, отрежьте опухоль капсулы из половины, чтобы удалить, начиная с основания опухоли ближе всего к открытию.
- Для 50% хирургии дебулка, сократить через середину опухоли. Используя изогнутые щипцы, зачерпните участок опухоли, чтобы удалить (50%); зачерпнуть любые остатки из обнуляемой области.
- Для 75% debulk, выполните 50% двойки опухоли, как в части 2.3.5 выше. Затем разрезать пополам оставшиеся 50% опухоли и зачерпнуть 25% опухоли, используя изогнутые щипцы, как описано выше.
- Swab хирургической области 3 раза с алкогольным хлоргексидином. Используя щипцы и ножницы, сделайте 1 см прямой разрез вдоль спинной стороны, в 3 мм от опухоли(рисунок 3A, 3B).
- Закрытие хирургического участка
- Поместите оставшуюся опухоль обратно под кожу, и с помощью щипцов, потяните лоскуты кожи вместе и выстроить кожу вдоль раны.
- Держите кожу вместе 5 мм от края раны, и использовать хирургические зажимы, чтобы закрыть рану, начиная с стороны ближе всего к щипцам. Применить столько клипов, как это необходимо для обеспечения не основной ткани подвергается. Как правило, три-четыре клипа применяются с 2 мм зазоры между клипами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо клипы не очень хорошо применяются, удалите его с помощью удаления клипа и заменить новыми клипами.
- Восстановление мышей (ASSISTANT)
- Разрешить мышам, чтобы восстановить, поставив их в теплую (37 градусов по Цельсию) нагревательной камеры.
- Поместите клетку мыши на тепловую площадку. Мониторинг мышей в отопительной камере, пока они не оправились от анестезии (бодрствование и ходьба), а затем положить мышей обратно в клетку. Оставьте клетку на теплотрассе еще на 10 минут, пока мыши не станут более активными.
- Дайте мышам влажную и мягкую пищу. Мониторинг мышей 1 час после операции для восстановления и обеспечить клипы остаются на месте. Убедитесь, что клетка наполовину на / половина от тепловой площадки, чтобы позволить животным саморегулировать температуру в то время как без присмотра.
- Доза мышей с бупренорфином 0,1 мг/кг (100 мл подкожно в потертости шеи), через 6-8 часов после операции (в конце дня). Монитор мышей рано утром следующего дня, и доза мышей снова с 0,1 мг/кг бупренорфина (100 МЛ подкожно в потертости шеи). Дайте больше мокрой пищи по мере необходимости.
- Монитор мышей ежедневно в течение следующих семи дней. Клипы могут быть удалены через семь дней с помощью удаления клипа.
- Адъювантное или неоадъювантное лечение
- Лечить мышей peri-оперативно с (нео)адъювантной терапии в любой момент времени, в зависимости от лечения интереса.
- Например, лечить мышей с одной дозой 100 мкг анти-CTLA-4 интраперитонально (т.е.п.) на 15-й день после прививки, или с тремя дозами 200 мкг анти-PD-1 i.p. на 15, 17 и 19 день после прививки.
- Экспериментальные элементы управления
- При использовании этой модели для оценки последствий воспаления / заживления ран, рассмотреть вопрос об использовании следующих контрольных групп: 1) Нет-хирургия контроля (лечение все еще может быть введено внутриопухоле); 2) Контроль хирургии Шам: хирургический разрез делается в коже; опухоль манипулируется и подвергается, но не удаляется опухолевая ткань; рана закрывается зажимами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост опухоли размером 50 мм2 является идеальным размером для частичного дебулка. Неполная хирургическая резекция 50 мм2 опухолей приводит к 100% (n'5) воспроизводимого отрастания опухолей при отсутствии адъювантной иммунотерапии(рисунок 4A). Затем мы использовали модель для тестирования адъювантных иммунотерапий с использованием антител против контрольно-пропускных пунктов молекулы Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) и запрограммированный рецептор смерти 1 (PD-1). Лечение мышей с анти-CTLA-4 или анти-PD-1 привело к лечению ставка 80% и 25% (n'4-5 в группу), соответственно(Рисунок 4B, 4C). Ответ с анти-PD-1 дает возможность проверить новые комбинации для дальнейшего повышения скорости ответа.
Рисунок 1: Схематическая диаграмма частичной хирургической резекции опухоли. (A) Яшей BALB/c привиты 5 x 105 WEHI-164 клеток на правом нижнем фланге. (B) Когда опухоль достигает 50 мм2,операция может начаться. (C) Опухоль частично резект (50% показано). (D) Хирургическое место закрыто с клипами. (E) Адъювантная терапия может быть введена, внутривенно, внутриперитонально (показано) или внутриопухоле в области раны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель изображения операции создана. (A) Весь образ операции создана с указанием хирургических инструментов (перечислены в шаге 2.1) и обезболивающее машины. (B) Снимок изображения хирургического стола, показывающего все материалы в пределах легкой досягаемости. (C) Нагревательная камера и грелку для восстановления мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель фотографии частичной опухоли debulk техники. (A) Полностью анестезироваемая мышь с опухолью 50 мм2 в размерах до операции. (B) Место разреза в 3 мм от опухоли; 1 см разреза. (C-D) Отверстие раны, мягко держа кожу на стороне подшипника опухоли с помощью пинцета, и "инвертирование" опухоли так, чтобы она видна снаружи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Отрастание опухолей после неполной резекции опухоли и иммунотерапии. (A) Опухолевые кривые отрастания частично резекированных опухолей WEHI-164 в отсутствие адъювантной иммунотерапии. (B-C) Рост опухоли после операции и адъювантное лечение против CTLA-4 (B) или анти-PD1(C). Пунктирная линия указывает на день операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы предоставляем протокол для мышиной модели неполной хирургической резекции саркомы мягких тканей для проверки пери-оперативной терапии. Мы также стандартизировали хирургический разрез, чтобы дать оценку заживления ран между мышами после лечения.
Размещение опухоли является важной частью этого протокола. Мы выбрали подкожную модель опухоли, чтобы обеспечить легкий хирургический доступ к месту опухоли и введение местных методов лечения с минимальным бременем на мышах. Важно также обеспечить, чтобы опухоли растут в подкожном пространстве, а не в брюшной полости, что может привести к неожиданной заболеваемости и смертности.
При выборе линии опухолевых клеток для этого протокола, мы советуем, что клетки, когда выросли in vivo образуют твердую массу (например, модель WEHI-164), а не полутвердой массы (например, модель B16), так как это технически трудно частично резекть. Кроме того, если опухоль начинает расти через кожу (обычно наблюдается в опухолях больше, чем 100 мм2),debulking не рекомендуется, как кожа может стать некротическим и не исцелить хорошо после операции. Мы преодолели эту проблему путем удаления опухолей, как только они достигают 50 мм2 в размерах.
Поскольку наша модель может быть использована для оценки влияния заживления ран на терапию, мы предлагаем контроль / шам группы в качестве сравнения. Контроль может быть неизменным опухоли, или фиктивные операции, которые будут иметь только разрез кожи, воздействие опухоли, и закрытие раны без частичного опухоли debulk. Эта фиктивная контрольная группа может быть использована при распознавании эффекта хирургического воспаления и заживления ран от частичного дебулка на результат лечения.
Для успешной частичной хирургии без выпушения необходимо учитывать некоторые технические моменты. Важным аспектом является правильная имплантация и рост опухоли. Опухоли необходимо имплантировать на правом нижнем фланге, вдали от задней ноги. Опухоли, которые имплантируются слишком близко к задней ноге может помешать их способности ходить и может привести к дополнительной силы на клипы заставляя их оторваться. Кроме того, последовательность в размере опухоли имеет решающее значение для того, чтобы избежать изменчивости в относительном проценте рассылающихся. Мы решили провести операцию с опухолями, которые имеют размер 50 мм2,чтобы сделать операцию технически простой, хотя мы предполагаем, что частичная резекции на меньших опухолей возможно. Чтобы предотвратить несоответствие в размере опухоли, используемая линия клеток должна быть проходной в соответствии с соответствующими стандартными методами клеточной культуры, и исследователь должен быть надлежащим образом обучены надлежащей технике прививки опухоли. При распространении этого протокола на другие подкожные модели опухоли, физические характеристики опухоли имеют важное значение. Например, мы обнаружили, что клеточные линии, которые приводят к мягким, желатиновые опухоли (например, M3-9-M rhabdomyosarcoma, и B16 меланомы15) являются технически сложными для debulk.
Есть также технические моменты, которые должны быть рассмотрены во время операции. Мыши должны быть адекватно анестезированы, чтобы предотвратить движение во время процедуры. Помимо импоста, что недостаточно анестезируемых мышей будет терпеть, любое движение мышей во время процедуры может сделать хирургическую резекции трудно, в результате чего изменчивость в размере опухоли удалены между мышами. Кроме того, частота дыхания мыши должна быть тщательно проверена во время операции Концентрация Isoflurane должна быть скорректирована для поддержания соответствующей глубины анестезии. Поэтому помощник всегда необходим во время хирургической процедуры, чтобы контролировать частоту дыхания во время операции, а также обеспечить адекватный уровень анестезии. Размер разреза должен быть последовательным, чтобы избежать изменчивости в реакции заживления ран. Мы обнаружили, что разрез 1-1,5 см достаточен для обезболивания опухоли, с минимальным шансом дехискэнции раны.
Наша модель частичной резекции имитирует остаточную болезнь, оставшуюся после операции, как видно в клинической обстановке многих твердых опухолей и предлагает преимущества по сравнению с традиционными сингеническими моделями мыши, принимая во внимание эффект хирургического заживления ран. Кроме того, существующие традиционные модели хирургии используют полную резекцию опухоли, которая не всегда приводит к рецидиву опухоли16. Другие исследователи успешно использовали модели частичной резекции с использованием других линий раковых клеток11,,12,13, подчеркивая надежность этого метода. Кроме того, было продемонстрировано, что частичная резекция, но не полная резекция, привела к защитной противоопухолевой иммунной памяти, когда адъювантная терапия дается12, которая была приписана к сохранению антигенов из остаточной опухоли.
Эта модель предназначена для изучения влияния воспаления и заживления ран на терапию. Наш подход к борьбе с выбросами клинически напоминает клинические ситуации, когда валовое остаточная болезнь остается после операции (резекция R2), а не макроскопически полная резекция с микроскопическим остаточной болезнью (резекция R1). Например, хирургическая резекция в инвазивной саркоме мягких тканей может привести к положительным полям, когда опухоль находится рядом с критическими структурами, такими как нервы, артерии или соседние органы, исключая полную резекцию с широкими краями17. Хирургические модели резекции, приводящие к микроскопическим положительным маржам, были опубликованы13; наш протокол может быть использован для изучения влияния раневой заживляющей реакции на терапию при макроскопическом остаточном заболевании.
Ограничение нашей модели заключается в том, что она не приводит к отдаленному рецидиву и микрометастазу, который является общим после операции при твердых опухолях, таких как рак молочной железы или рак поджелудочной железы. Другие модели хирургии, такие как модель рака молочной железы мюрин 4T118,19,20 или мурин модели де Новометастазы рака молочной области21 лучше подходят для расследования системного рецидива после локальной резекции. Другим ограничением является то, что этот протокол предназначен для подкожных моделей и, таким образом, не позволяет оценить патологию тканей. Для этого, ортотопические модели опухолевых мышей подходят7,,22,23. Тем не менее, ортопедические модели являются более сложными и, как правило, включают в себя больше импост для мышей, и являются более трудоемкими идорогостоящими 22. Подкожные модели хорошо подходят для оценки влияния (нео-) адъювантной терапии, как системно, так и локально, на локальный рецидив рака, в экономически эффективной и относительно высокой пропускной способности с минимальным импостом для животных.
Неполная частичная резекция, как указано в этом протоколе, полезна для тестирования адъювантной терапии при включении хирургического заживления ран в качестве фактора, переменная, которая часто упускается из виду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никаких разоблачений.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантами от Sock его в Саркому! Фонд, Австралийская и Новозеландская ассоциация сарком, Детский фонд исследований лейкемии и рака и вечная благотворительность. WJD поддерживается Саймон Ли стипендий и научно-исследовательских стипендий от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям, и рак Совета WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
