Summary
血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、繊細な脳機能を破壊する可能性のある血液中枢神経系(CNS)を様々な要因から保護する神経血管ユニット(Nvus)によって形成される。したがって、BBBは、CNSへの治療薬の送達に対する主要な障害である。蓄積された証拠は、BBBが神経疾患の発症および進行において重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、健康と病気におけるBBBの役割を解明するだけでなく、CNS標的薬の浸透を予測できるBBBモデルが非常に必要とされています。
最近、臓器オンチップと誘導多能性幹細胞(iPSC)技術を組み合わせて、人間に完全にパーソナライズされたBBBチップを生成しました。この新しいプラットフォームは、ヒトBBBを横断する薬物および分子輸送の予測に適した細胞、分子、および生理学的特性を表示する。さらに、患者固有のBBBチップを用いて、神経疾患モデルを生成し、個別化された予測医療用途の可能性を実証しました。ここでは、iPSC由来のBBBチップを生成する方法を示す詳細なプロトコルを提供し、iPSC由来の脳微小血管内皮細胞(iBME)の分化から始まり、神経前駆細胞を含む混合神経培養を生み出す結果、分化されたニューロン、およびアストロサイト。また、制御された層流下でBBBチップを培養して臓器チップに細胞を播種する手順についても説明する。最後に、BBBチップ分析の詳細な説明は、薬剤および分子透過性を評価するための細胞内透過性アッセイ、ならびにチップ内の細胞タイプの組成を決定するための免疫細胞化学的方法を含む提供される。
Introduction
BBBは循環血液からCNSを分離する非常に選択的な障壁である。これは、潜在的に破壊的な物質、要因、および異種生物学から重要な脳機能を保護する一方で、脳の恒常性を維持するために必要な栄養素やその他の代謝産物の流入を可能にする1.BBBは、多細胞NVUであり、ペリサイト、アストロサイトエンドフィート、およびニューロンプロセスが脳微小血管内皮細胞(BMECs)と直接接触する。これらの相互作用により、BMEC は、密閉ジャンクション2、3でサポートされる特殊なバリア プロパティを形成できます。このバリアの形成は、分子の傍細胞通過を制限しますが、分子をCNSに積極的に輸送したり、血液1に戻すために偏光輸送体を含んでいます。これらのユニークなバリア特性により、BBBはバイオ医薬品の脳への送達に対する大きな障害となり、FDA承認低分子の5%未満がCNS4に到達できると推定される。
動物モデルはBBBの浸透およびBBB開発に関与する分子機構を研究するために広く使用されている5.動物モデルは、複雑な多細胞インビボ環境を忠実に表すが、BBBトランスポーターの発現および活性の違いならびに種間の基質特異性は、ヒトへの動物データの正確な外挿を妨げる場合が多い6。したがって、ヒトベースのモデルは、ヒトBBBを研究し、CNSを標的にするように設計された薬物の開発に使用するために重要である。この必要性は、医薬品開発分野における生物学的、ヒト特異的薬物の優位性の増加に伴ってさらに明らかになる。蓄積された証拠は、侵害されたBBBが脳腫瘍および神経疾患7、8、9を含む多くの重度のCNS障害に関連していることを示唆している。これらの疾患を忠実に反映するヒトモデルは、1)創薬の対象となり得る新しい経路を同定し、2)CNS浸透を予測し、前臨床試験における時間と資源を減少させ、臨床試験における失敗率を低下させる可能性がある。
インビトロモデルは、BMECとNVUの他の細胞との相互作用を研究し、将来のBBB透過性薬物10のスクリーンを実施するために広く実施されている。ヒトBBBの重要な側面を再現するには、インビトロモデルは生理学的に関連する特性(すなわち、低い細胞内透膜透過性および生理的に関連する内皮単層にわたる経内皮性電気抵抗[TEER])を示さなければならない。また、インビトロ系の分子プロファイルには、代表的な機能的輸送システムの発現が含まれなければならない。典型的には、インビトロモデルは、BBB特性を増強するために他のNVU細胞の組み合わせと半透過性膜上で共培養される内皮細胞で構成される11。このアプローチにより、バリア機能と分子透過性を簡単かつ比較的迅速に評価できます。このような細胞ベースのBBBモデルは、外科的切除または不死化BMEC線から単離された細胞を含む動物またはヒト細胞源で確立することができる。
近年、BMECsにヒト多能性細胞を分化するプロトコルが、インビトロヒトBBBモデル12、13の魅力的な供給源として導入された。人工多能性幹細胞(iPSC)由来BMECs(iBMECs)は、非常にスケーラブルであり、ヒトBBBの重要な形態学的および機能的特徴を実証し、患者の遺伝学を運ぶ。培養では、iBMECsは、タイトな接合マーカーを表現し、生体内のようなタイトなジャンクション複合体に表示する単層を形成する。これらの細胞はまた、BBBグルコーストランスポーター、グルコーストランスポーター1(GLUT1)を含むBBBマーカーを発現する。重要なことは、ヒトBMECの他の代替細胞源とは異なり、iBMECはvivo14で測定されたものと同じくらい高い値を持つバリア特性を獲得し、バソ辺膜軸に沿って偏光し、機能的な流出ポンプを発現する。さらに、様々な被験者のiPSCを用い、両方とも1)は、BBBの側面を個別化した医薬の方法で試験する機会を歓迎し、2)NVUの追加細胞タイプを生成するための柔軟な供給源を提供する。アイソジェニック細胞源からこれらの細胞を生成してパーソナライズされたBBBチップを作成することは、薬物応答の個人差間を理解するのにも役立ちます。
iBMEIcを皿の単層として、または半透水性トランスウェルインサートで使用すると、BBBモデリングのための強力なアプローチを表します。これらのシステムは、堅牢で再現性が高く、コスト効率が高い傾向があります。さらに、TEERや透透度などの機能解析は比較的簡単に行えます。しかし、2次元(2D)系では生体内組織の3D性を再現できず、血液や血液細胞の循環によって生じる生理的剪断力が欠如しています。これは、これらのモデルにおける血管内皮の能力を制限し、固有のBBB特性および機能を開発し維持する。
生きた細胞が並ぶマイクロエンジニアリングシステムは、オルガンオンチップと呼ばれる概念で様々な器官機能をモデル化するために実装されています。生体構造の多細胞構造、組織組織のインターフェース、物理化学的微小環境、血管灌流を再現することにより、これらのマイクロエンジニアリングプラットフォームは、組織および器官の機能性のレベルを生成する従来の2D培養システム。また、生体内組織や臓器のコンテキストで生きた細胞と同様の生化学的、遺伝的、代謝のプロファイルを高解像度、リアルタイムイメージング、および分析することができます。しかし、オルガン・オン・チップの特定の課題は、これらのマイクロエンジニアリングチップの設計、製造、および応用には、生物学的指向の学術ラボに通常欠けている専門的なエンジニアリング専門知識が必要です。
最近、iPSCとオルガンオンチップの技術を組み合わせて、パーソナライズされたBBBチップモデル15,16を生成しました。説明されている技術的な課題を克服するために、市販のChip-S1は、シンプルで堅牢な方法でチップのメンテナンスを自動化するように設計された、カルチャーモジュールと一緒に使用されます(Emulate Inc.)。BBBチップは、神経細胞と内皮細胞の相互作用を再現し、統合された金電極17を有するカスタムメイドのオルガンチップによって測定される生理学的に関連するTEER値を達成する。さらに、BBBチップは低い細胞透過性を示し、臓器レベルでの炎症の手掛かりに応答し、活性な流出ポンプを発現し、可溶性バイオマーカーおよびバイオ医薬品の予測輸送を示す。特に、いくつかの個体から生成されたBBBチップは、神経疾患15を有する健康な個人と患者との間の期待される機能的な違いを捉える。
以下に詳述するプロトコルは、動的流動条件下でヒトiPSCベースのBBBチップを生成するための信頼性、効率的、および再現性のある方法を記述しています。BBBチップで直接、またはサンプリング排水から実行できるアッセイおよびエンドポイント分析のタイプに関するガイダンスが提供されます。このように、このプロトコルは、人間関連モデルにおける生物学的および機能的特性および応答を評価するために適用できる技術のスペクトルを示す。
iPSCベースのBBBチップの簡単な説明は、ここに提供されています。ヒトiPSCは、最初に分化され、EZ球と呼ばれる神経前駆物質の自由浮遊凝集体として組織培養フラスコに伝播される。Chip-S116,18,19のトップチャンネルには、細胞が7日間にわたって分化して神経前駆細胞(iNPCs)、iAストロサイト、およびiニューロンの混合培養に分化するため、チップの「脳側」を形成する解化されたEZ球体が播種されます。ヒトiPSCは、組織培養プレート内でもiBMECsに分けられます。チップの底流路はiBMECsで播種され、内皮管を形成するように発達する「血液側」を形成する(図1)。上下のチャネルを分離する多孔性細胞外マトリックス(ECM)コーティング膜は、チャネルと2との間の細胞間相互作用の形成を可能にし、2)は、ユーザーが従来の光顕微鏡を使用していずれかのチャネルで透過性アッセイおよび画像細胞を実行することを可能にする。
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Protocol
1. iPSC由来神経前駆細胞(iNPC)の生成
- iPSCコロニーからEZ球体を作製する(後述したように、以前に公開された20、21、22)。
- 培養iPSCコロニーは、基調膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(0.5 mg/plate)のmTESR1または他の商業用媒体に収束する(材料の表を参照)。
- iPSC培地を取り出し、2 mLのEZ球体媒体に置き換える [ESM;DMEM:F12 7:3 100 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、100 ng/mL表皮成長因子、5 μg/mLヘパリン、および2%B27サプリメントを添加した。
- 滅菌1000 μLピペットチップまたはセルスクレーパーの背面でよく各コンフルエントの底を削ります。
- すべての細胞を収集し、自由浮遊球の自発的な形成を可能にするために超低の取り付けT25フラスコに置きます。37°Cで一晩インキュベートする。
- 媒体の半分を新鮮なESMに置き換えることによって、媒体が黄色に変わる2〜3日ごとに球を養う。これにより、球体は、成長と維持のために非常に重要である、コンディショナリンドメディアに残ることができます。
- 管の棚のフラスコを傾け、球がフラスコの隅まで1-2分の重力で沈降するようにします。
- 一度落ち着いたら、5 mLまたは10 mL血清ピペットで上清の半分を吸引し、新鮮な、予め温めたESMに置き換えます。
- 先に説明したように球を直径200μmに切り刻んでEZ球を毎週通過させる23,20,21.EZ-球は25までの通路のために維持することができ、通路8-25の間で使用される場合理想的である。
- iNPCの単一細胞懸濁液を準備する:
- 神経分化を誘導するために、EZ球体を単一細胞に解異させる。
- T75フラスコから3~4日後に球を集めて15mLの円錐形に移し、2分間、またはすべての球が底に落ち着くまで放置します。
- 落ち着いた球を破壊することなく、5 mLピペットでESMをゆっくりと取り除く。解離溶液1mL(材料表参照)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
- 5分のインキュベーション後に解離溶液と球を旋回させ、落ち着いた球体が確実に処理されるようにします。
- 解離ソリューションをゆっくりと削除します。1 mL の神経分化培地を追加 [NDM;DMEM:2%B27マイナスビタミンA、1%N2サプリメント、およびヒト脳由来神経栄養因子(hBDNF、20 ng/mL)を有するF12。
- 1 mLピペットを使用し、続いて200 μLピペットを使用して、すべての球が解き合うまで、球体を単一細胞にトリテレートします。トリチュレーション手順の間に気泡形成を避けてください。
- 解化細胞をヘモサイトメーターを用いてカウントし、細胞を1 x 106細胞/mLの最終密度に希釈する。用途によって密度を変更することができます。
注: 最大 6 x 106セル/mL の短期培養には、密度が高く 、3 週間までの長期適用には低密度が推奨されます。
注:セルは、チップの上部チャネルにシードして「脳側」を形成する準備ができました。
2. iPSCのiBMECへの分化
- 1:6の比率で6ウェルプレートの単一のコンフルエントウェルから6ウェル基調膜マトリックスコーティングされたプレートへのパッセージiPSC。24時間、細胞を接着させ、iPSC培地を毎日変化させます。
- ヘモサイトメーターを使用して毎日細胞を数える。
- 細胞が1.5~3.0 x 105細胞/ウェルの密度に達した場合は、iPSC培地をbFGFを使用せずに3mLの未整合培地に置き換えます[DMEM:F12 1:1,10%ノックアウト血清置換(KOSR)、1%の非必須アミノ酸(NEAA)、0.5%グルタミンサプリメント(材料表)、100μP-βM-βMP.6日間毎日媒体を交換してください24.
- 6日目に、培地を内皮細胞(EC)培地で置換する[血小板不良血漿由来ウシ血清、20ng/mL bFGF、および10μMオールトランスレチノイン酸(RA)を補充したヒト内皮性血清中皮培地(hESFM))。2日間培地を残します。
- EC培地を取り除き、1ウェル当たり1 mLの解離液を加えます。37°Cで35分間インキュベートします。
注:これはここで使用される解離溶液の長いインキュベーション時間と考えられていますが、iBMECsは90%以上の細胞生存率でこの治療に耐えることができます。 - 細胞懸濁液を静かにピペットで取り出し、全ての細胞を15mLの円錐形チューブに集めることで、細胞をウェルから切り離します。
注:過酷なピペッティングは避けてください。細胞が容易に切り離されない場合は、さらに5分間インキュベートします。 - 15 mL円錐に1ボリュームのEC培地を加えてアキュターゼを不活性化し、5分間200 x gで遠心分離し、培地を除去し、1 mLのEC培地で交換します(bFGFとRAは除く)。
- 細胞をヘモサイトメーターでカウントし、細胞密度を14~20 x 106細胞/mLに調整します。
注:細胞は、チップの下部チャネルにシードして「血液側」を形成する準備が整いました。
3. オルガンチップの微細加工
- BBBチップモデルにはオルガンチップを使用し、以前に行った16、18、19のようにその生産。高いチャネルオルガンチップ(材料の表を参照)は、柔軟な多孔膜によって分離された2つの重ね合わされ、平行なマイクロスケールチャネルを含む非常に柔軟なポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーから製造されています。上部および底部のマイクロチャネルサイズはそれぞれ1mm x 1mmおよび1.0 mm x 0.2 mmである。2つのチャネルは、厚さ50μmのPDMS製の柔軟な多孔膜で分離され、直径7μmの細孔と40μmの間隔を有する。チャネルを隔て、多孔膜の表面積は0.171cm2である。
4. チップの準備
- オルガンチップはチップキャリア内にあらかじめパッケージ化されて供給されるため、ハンドリング中にチップの位置合わせを邪魔したり歪めたりする必要がなくなります。さらに、チップキャリアは、文化モジュールとチップの間のインターフェースとして機能するポータブルモジュール(「ポッド」)に安全に接続します。
- 70%エタノールでチップの包装をスプレーし、バイオセーフティキャビネット(BSC)に持ち込みます。
- 包装を開き、無菌ペトリ皿にオルガンチップをレイアウトします。チップとの直接接触を避けるため、チップキャリアは側面のみで処理してください。
- キャリアのタブが右に向いていること (図2)を確認し、複数のチップを使用する場合は、すべてのチップを同じ向きに揃えます。
- 各チップにキャリアタブにラベルを付けます(完全なチップの準備とワークフローは図3に示されています)。
5. 表面活性化とECMコーティング
- 表面活性化溶液の調製
- エミュレーション試薬1(ER-1)は、5mgを含むバイアルに設け、光感受性である。使用する直前に、新鮮なER-1溶液を準備します。ER-1の完全性は、チップの正常な準備において非常に重要です。
- ER-1を扱う際には、BSCのライトを消してください。
注:ER-1は眼刺激性であり、適切な手袋および目の保護とBSCで扱われなければなりません。 - ER-1とER-2の試薬を室温(RT)に平衡させてから使用してください。
- 空の無菌15 mL円錐形チューブをホイルで包むことで、溶液を光から保護します。
- BSCでは、ER-1バイアルを短時間タップして、粉末を底部に沈着させる。
- 1 mL の ER-2 バッファーをバイアルに加え、その内容を 15 mL ラップされた円錐形チューブの底にすぐに移します。混ぜるピペットは使用しないでください。円錐管に転がれた溶液の色は赤になります。
- 手順 5.1.6 3x を繰り返します。最後のラウンドで、ER-1バイアルをキャップし、蓋から残った粉末を収集するために反転し、その後、円錐形チューブに溶液を移します。これにより、ER-1ソリューションの総体積は4 mLになります。
- ER-2溶液の6 mLを15 mL円錐管の4 mLのER-1溶液に加え、最終濃度0.5mg/mLに添加した。ER-1はER-2溶液内で完全に溶解する必要があります。
- サーフェスのアクティブ化
- P200ピペットと無菌200μLのピペットチップを利用して、ER-1混合物の200 μLを取ります。
- 下部の入口にピペットを入れ、下部チャネルから20 μLのER-1混合物を押し出し、その混合物が下部チャネル出口から流出し始めるまで押します。
- ER-1混合物を約50μL加え、上部のチャネル入口に入れます。上部チャネルの出口から流れ出始めるまで、上部チャネルを通して混合物を押し込みます。
- 優しい吸引によってチップの表面から余分なER-1混合物をすべて取り除きます。ER-1の混合物がチップ表面からのみ取り除かれ、チャネルから取り除かれていないことを確認してください。
- 紫外線(UV)が活性化する前に、チャネルに気泡が含まないことを確認します。気泡が検出された場合は、ER-1混合物でチャネルを洗浄することによって気泡を除去します。
- チップを入れ開いた皿をUVライトボックス(Emulate Inc.提供)に入れます。
- UV ライト ボックスの背面にあるスイッチを「コンシステント」設定に設定します。電源をオンにして UV アクティベーションを開始します。チップはUV光の下に20分間放置します。
メモ:UVライトへの人員の露出を避けてください。 - 両方のチャネルから ER-1 混合物を取り除きます。
- 各チャンネルを200μLのER-2溶液で洗浄します。
- 両方のチャネルから ER-2 を削除します。
- 200 μLの無菌性の冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で各チャネルを洗浄します。
- 次のステップに進むまで、チャネル内に冷たいDPBSを残します。
- 細胞外マトリックス(ECM)の調製およびコーティング
- 個々のECM成分を冷たいDPBS、水、または他の溶媒と組み合わせて最終作業濃度にしてECM溶液を調製します。ECM溶液は、使用するたびに新鮮に調製する必要があります。
- チップの上下の両方のチャネルをECMでコーティングし、種をまく細胞タイプによって決定される組成物を用いる。ECM混合物は、使用するまで氷の上に維持されなければなりません。
- ラミニン(50 μg/mL)を使用して「脳側」をコーティングし、5.6項で説明したようにコラーゲンIVとフィブロネクチンを4:1比(320:80 μg/mL)で混合して「血液側」をコーティングします。
- ECMアリコートの調製
- 冷たいDPBS中の1mg/mLラミニンを50μg/mLの最終濃度に希釈します。使用するまで-20°Cでアリコートと保管してください。
- コラーゲンIVを0.1%酢酸に溶解し、濃度1mg/mLにする。溶液を一晩2~8°Cで、またはRTで1~3時間、または完全に溶解するまでインキュベートします。
- コラーゲンIV:フィブロネクチンの1mL混合物を調製する(コラーゲンIVの320μL、フィブロネクチンの80μL、無菌二重蒸留H2Oの600μL)。混合物は-20°Cで貯蔵することができる。
- ECMでチップをコーティング
- 両方のチャネルから冷たいDPBSを完全に吸引します。P200ピペットを100μLのコラーゲンIV:フィブロネクチン溶液を取るように設定します。
- 小さな液滴が出口に形成されるまで、下部チャネル入口を通して溶液を導入します。ピペットの先端を取り外した後、入口に小さな液滴を残します。
- 小さな液滴が出口に形成されるまで、上部チャネル入口を通してラミニン溶液を導入します。ピペットの先端を取り外した後、入口に小さな液滴を残します。
- チャネルをよく見て、泡が存在しないようにします。気泡が存在する場合は、すべての気泡が除去されるまで、適切なECM溶液でチャネルを洗浄します。
- 各チップについて、手順 5.5.1 ~ 5.5.4 を繰り返します。
- 15 mL円錐形チューブのキャップに 1.5 mL の DPBS を追加します。DPBSキャップをチップと一緒に150mm培養皿に入れ、余分な湿度を提供し、パラフィルムで皿を密封します。最良の結果を得るには、チップを一晩4°Cでインキュベートします。
注:必要に応じて、細胞はチップ活性化およびECMコーティングと同じ日に播種することができるが、一晩のインキュベーションが好ましい。チップは、ECMを添加し、チップを37°Cでインキュベートした後、4時間のシード処理の準備ができます。
6. 「脳側」チャネルを播種し、EZ球体を混合神経培養に分化する
- 準備したチップを入った皿をBSCに持ち込む。200 μL の NDM で両チャネルを静かに洗浄します。
- ポートとの接触を避け、チップの表面から余分な媒体液滴を注意深く吸引する。各チップをシードする前に細胞懸濁液を静かに攪拌し、均質な細胞懸濁液を確保する
- iNPCをトップチャネルにシードして「脳側」を生成する
- 細胞(1 x 106セル/mL)をチップの上部チャネルにシードします。30~100 μLの細胞懸濁液を含むP200チップを上部のチャンネル入口に加え、ピペットからチップを軽く離します。空のP200ピペットを取り、プランジャーを押し下げ、トップチャンネルの出口に挿入し、チップを通して単一の細胞の懸濁液を慎重に引っ張ります。
- 皿を覆い、顕微鏡に移して、トップチャネル内の細胞の播種密度と均質な分布を確認します。チップ入口と出口ポートからピペットチップを軽く取り外します。
- シード密度は、カバレッジが 20% として表示されます。シード密度が予想よりも高いか低い場合、または不均等な場合は、チップを BSC に戻し、200 μL の新鮮な培地でチャネル 2x を洗浄し、ステップ 6.3.1 を繰り返します。
- 正しい細胞密度を確認した後、チップを各バッチのチップを播種した後、直ちに37°Cで2時間インキュベーターに入れる。新鮮なNDMで付着しない細胞を洗い流します。
- 流れを開始する前に少なくとも48時間の毎日のNDM交換で37 °Cの静的条件下で細胞を保ちます。iNPC のシード後、iNpcs がアタッチされた後、または iNPC シード処理後の後続の日に、iBMEC をシードすることができます。
7. iBMEIcをボトムチャンネルにシードして「血液側」を生成
- 準備したチップを入った皿をBSCに持ち込む。200 μLのEC培地で下部のチャンネルを静かに洗います。
- ポートとの接触を避け、チップの表面から余分なEC培地の液滴を注意深く吸引し、両方のチャネルに媒体を残すようにしてください。各チップをシードする前に細胞懸濁液を静かに攪拌し、均質な細胞懸濁液を確保します。
- P200ピペットを使用して、iBMEC細胞懸濁液(14~20 x 106セル/mL)を30~100μLにして、先端を下部の水路入口に入れ口に入れ口に入れ口に入れましょう。入口ポートにセルを含む先端を残して、ピペットからチップを軽く外します。
- 空の先端を持つP200ピペットのプランジャーを押し下げ、下部チャネルの出口に挿入し、ピペットプランジャーをゆっくりと放出して、ボトムチャンネルを通して単一セルの懸濁液を慎重に引き抜きます。
- チップの表面から余分な細胞懸濁液を吸引する。入口および出口ポートと直接接触しないようにして、細胞懸濁液がチャネルから吸引されないようにしてください。
- チップを覆い、顕微鏡に移して播種密度を観察します。顕微鏡で4xまたは10xで観察した場合、底流は細胞間の観察可能な隙間なしで満たされるべきである(図4)。
- シード密度が 90% 未満の場合、または不均等に分散されている場合は、それに従ってセル密度を調整し、チャネル内で正しい密度が得られるまで手順 7.2 ~ 7.6 を繰り返します。正しい細胞密度を確認した後(図4)、残りのチップに細胞をシードする。底のチャネルの上部にある多孔質膜に細胞を取り付けるには、各チップを反転させ、チップクレードルで休みます。
- 150 mm皿の中に小さなリザーバー(無菌DPBSを含む15mL円錐形チューブキャップ)を入れて、細胞に湿度を与えます。チップを約3時間、または底流の細胞が付着するまで37°Cでインキュベートする。iBMEIcが取り付け(約3時間のポストシード)したら、チップを直立した位置に戻して、底流の下部にセルを取り付けられるようにします。
8. フローの開始
- フローは通常、iBMECsの48時間のシード後に開始されます。この時間は、iBMECsがチップにしっかりと取り付けるために必要です。
- チップを通る層流を維持するためには、媒体の温度を脱気して平衡化することが重要である。培地は37°Cの水浴で1時間予熱する必要があります。
- 最大50 mLの温熱媒体は、真空駆動の濾過システムの下で15分間インキュベーションすることにより脱気できます。
- ポータブルモジュールのプライミング
- 70%エタノールでポータブルモジュールのパッケージとトレイの外観を消毒し、拭き取り、BSCに転送します。パッケージを開き、モジュールをトレイに入れます。貯水池をトレイの背面に向けます。
- ピペット3mLの前平衡化された、各入口貯蔵所に暖かい媒体。一番下のチャネルの入口貯留所に EC 培養培地を追加し、NDM を上部チャネルの上部チャネル入口リザーバに追加します (図 5)。
- ピペット300μLの前取り付けされた、各出口貯蔵所に暖かい媒体、各出口ポート上に直接(図5)。
- 各トレイに最大6個のポータブルモジュールを設置します。トレイをインキュベーターに持ち込み、トレイハンドルを外側に向けて完全に培養モジュールにスライドさせます。
- カルチャ モジュールで [プライム] サイクルを選択して実行します。インキュベータードアを閉め、培養モジュールがポータブルモジュールを準備できるようにします(~1分かかります)。プライミング サイクルは、ステータス バーに "準備完了" と表示されたときに完了します。トレイを培養モジュールから取り出し、BSC に持ち込みます。
- BSC の各ポータブル モジュールの裏面を調べて、ポータブル モジュールのプライミングが正常に行われたことを確認します。4 つのポートすべてに小さな液滴が存在することを確認します。
- ポータブルモジュールに液滴が表示されない場合は、それらのモジュールのプライムサイクルを再実行します。いずれかの媒体がトレイに滴下した場合(これは出口ポートによってより頻繁に起こる可能性があります)、70%のエタノールでトレイをきれいにしてください。
- チップのポータブルモジュールへの接続、規制、流れの開始
- 各チップの両方のチャネルを温かく平衡化した細胞固有の培地で静かに洗い、チャネル内の可能な気泡を取り除き、各入口と出口ポートの上部に小さな液滴の媒体(チャネル内の媒体に従って)を置きます。
- キャリア付きのチップをポータブルモジュールに挿入し、各トレイに最大6個ずつ配置します。トレイをカルチャ モジュールに挿入します。適切なオルガンチップ培養条件(流量および伸張)を、培養モジュール上でプログラムする。
- 「規制」サイクルが完了するとすぐにプログラムされた条件が開始されます。
注: 各チャネルの流量は個別に制御でき、0 ~ 1,000 μL/h の範囲のレートに設定できます。BBBチップは、通常30μL/hで培養されます。ECメディアやESMなどの流動媒体を30 μL/hおよび1000 μL/hで流す場合、せん断力はそれぞれ0.01 dyn/cm2および0.33 dyn/cm2です。 - 約 2 時間かかる「調整」サイクルを実行し、その後、培養モジュールは、事前に設定されたオルガンチップ培養条件で流れ始めます。
血液間脳内細胞透過性評価
- 10 μg/mL デキストラン-FITC (4 kDa) を補充した NDM を準備します。この溶液は、「血液側」チャネルの入力として使用されます。
- ポータブルモジュールの底部のチャネルリザーバーを、デキストラン-FITCで補完されたNDMで満たします。トレーサーなしでNDMの上部チャネルの貯蔵所を埋める。
- プレートリーダー(通常100μL)で蛍光の評価のために十分な媒体が集まるまで、少なくとも4時間の流量30μL/hの上部および下部チャネルの両方を浸透させます。
- 上部および下部チャネルの入力および出力の貯蔵所からメディアサンプルを収集します。光からサンプルを保護します。
- NDMをトレーサーなしで10 μg/mLデキストラン-FITC 1:1で補ったNDMを連続的に希釈し、10~12点のキャリブレーション曲線を生成します。
- キャリブレーション曲線を含む各サンプルの100μLを黒い96ウェルプレートに取り込み、プレートリーダーを使用して蛍光を読み取ります(485 nm励起、530 nmの放出)。
- 測定値を使用して、Pアプリの値を次のように計算します。
- バリア特性を評価し、BBB チップがまだ機能していることを確認するために、毎日の測定を行います。
10. 免疫細胞化学
- 化学ヒュームフードにチップを持参してください。P200ピペットを使用して、DPBSで200 μLのパラホルムアルデヒド(PFA)を両方のチャネルに浸透させ、RTで10分間インキュベートすることで細胞を固定します。
- 固定後、各チャンネルに200μLのDPBSを浸透させ、5分間インキュベートします。
- 一次ブロッキング溶液(PBS、5%正常ロバ血清および0.1%トリトンX-100)を補うことによって、チップ上の細胞をブロックおよび透過する。RTで1時間インキュベートします。
- 一次ブロッキング溶液中の希薄化一次抗体を4°Cで一晩インキュベートする。BMECsマーカーは、グルト1(1:100希釈)、ZO-1(1:300)、PECAM-1(1:250;CD31)、およびVEカドヘリン(1:200)。ニューラルマーカーはβIII-チューブリン(1:1000;Tuj1α)、S100β(1:500)、ネスチン(1:1000)およびGFAP(1:1000)。
- 冷たいDPBSでチップを3倍洗います。
- 二次遮断液中の希薄化二次抗体(トリトン-Xを含まない5%の正常ロバ血清を有するDPBS)。
- 両方のチャネルを通して二次抗体溶液を浸透させます。典型的には、蛍光二次抗体は1:1000で希釈される。光から保護されたRTで1時間インキュベートします。
- DPBSでチップを3倍洗います。
- 100 μLのDAPI溶液をチップに浸透させることにより、細胞核を染色する。RTで5分間インキュベートします。
- DPBSでチップを3倍洗います。
- チップは、直立または反転蛍光顕微鏡を使用してイメージングの準備が整いました。PDMSの透明性は、インタクトな臓器チップでのイメージングを可能にします。10xを超える倍率は、臓器チップの厚さによる長時間の距離目標を必要とする場合があります。
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Representative Results
図6A、B、Cは、「脳側」の上流にEZ球体を、そして「血液側」の底流にiBMECsを播種したBBBチップを表す。iBMECは最初に種をまき、一晩で付着させ、その後EZ球体をシードした。その後、チップは静的条件下で培養され、毎日のメディア交換は7日間行われました。BBBチップは、RTで4%PFAを10分間用いて固定し、DPBSで3倍洗浄した。BBBチップ上で免疫細胞化学を行い、1)ネスチンを神経前駆細胞のマーカーとして、2)S100βまたはGFAPをアストロサイトのマーカーとして、および3)βIII-チューブリンをニューロンのマーカーとして行った。グルト-1およびペカム-1はBMECのマーカーとして使用した。イメージングは共焦点顕微鏡を用いて20倍で行い、画像はフィジーを使用してImageJソフトウェア用に処理した。
図6Dは、iBMECおよびEZ球体を搭載したオルガンチップ、iBMEC単独(EZ球体なし)、またはEZ球体単独(iBMECなし)に対して行われた傍細胞透過性アッセイを表しています。「調整」サイクルの後、4 kDa デキストラン-FITCトレーサーを「血液側」の貯蔵所に10 μg/mL の最終濃度に加え、チップを一晩30 μL/h で浸透させた。次に、メディアを、上部および下部の両方のチャネルの入口および出口の貯留部から収集した。各サンプルの100μLを収集し、プレートリーダーを用いて蛍光を調べた。
重要なことに、1:1キャリブレーション曲線を使用して、蛍光値をDextran FITCの濃度値に変換しました。その後、透過性 (Pアプリ) の計算に値が使用されました。これらの結果は、iBMECsが機能的バリア特性を形成し、iBMEIcがEZ球体と共培養されるとさらに引き締まることを示している。EZ球体のみで培養されたチップは、バリアを形成することができません。同様のアプローチを使用して、使用可能な測定方法(例えば、蛍光、ELISA、または質量分光光測定)に応じて、BBBチップを介した任意の分子の輸送を調べることができます。
図1: iPSCベースのBBBチップの概略図チップ上で播種する前に、iPSCは培養プレートで(i)EZ球体(神経前駆細胞、iNPC)に分化され、懸濁液中で球体として成長し、(ii)脳微小血管内皮細胞(iBME)に分化される。EZ-球体は、単一の細胞に解化され、器官チップの上部チャネルに播種され、そこでさらに混合神経培養に分化して「脳側」を形成する。iBMECsは、臓器チップの底流に種をまき、「血液側」に血管様構造を形成する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:チップキャリアのチップの上部図を図表し、ラベル付きポートを使用します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: iPSCベースのBBBチップの準備とワークフローのフローチャートワークフロー開始前にiPSCからの神経細胞と内皮細胞の事前分化が必要である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:下部チャネルにおけるiBMECのシーディング。細胞が付着した後、下のチャネル(A)、または(B)24時間後シード後のiBMECのブライトフィールド画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ラベル付きの入口および出口メディア貯蔵所を備えた接続されたチップおよびポータブルモジュールの概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 代表的な結果iPSCベースBBBチップ上の免疫細胞化学は、7日後の播種後に行った。EZ-球体は、上の「脳側」チャネルの混合神経細胞群に分化し、(A)S100β+(緑色)アストロサイト、ネスチン+(赤)神経前駆細胞ならびに(B)GFAP+(赤色)βブリン+およびIII-チューブリン+(赤)ニューロンを含む。スケールバー = 200 μm.(C)底部の「血液側」チャネルにシードされた iBMEC は、GLUT-1 および (緑色) PECAM-1 (CD31、 赤) を表します。スケールバー = 200 μm. (D) BBB チップ透過性の評価は、下部チャネルのリザーバにデキストラン-FITC (4 kDa) を加えて行った。結果は、iBMECとEZ球体を播種したオルガンチップは、iBMECだけで播種されたオルガンチップ(*p <0.05)と比較して緊密な障壁を示すことを示しています。EZ球体だけでシードされたオルガンチップは、バリアプロパティを表示しません(***p < 0.001;Tukeyの多重比較テストを伴う一方方向のANOVA)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
NVUのオルガン・オンチップ技術とiPSC由来細胞の組み合わせは、ヒトBBBの正確なモデリングを約束しています。ここでは、最近公開されたiPSCベースのBBBチップ16のシンプルで堅牢なアプリケーションのための詳細なプロトコルを提供します。シードパラダイムの概要とタイミングを図 3に示します。BBB モデリングに適したバリア機能を得て維持するには、均質な iBMEC 単層を生成し、その完全性を維持することが重要です。機能的単層の生成に向けた第1のステップは、ECMタンパク質の付着を可能にする非極性PDMS表面の化学的活性化を含む。表面活性化試薬は再構成時に急速に分解し、最終的には細胞の最適な結合性を低下させる可能性があります。そのため、試薬を新鮮に保ち、プロセス全体を通して光から保護することが重要です。
UV活性化(セクション5.2)の間、試薬は、一貫したECMコーティングと均質な細胞アタッチメントを達成するために、各チャネル内で均等に分散する必要があります。このプロトコルで提供されるECM組成物および濃度は、特定のタイプの細胞(すなわち、iBMECおよびEZ-球体由来神経前駆細胞)に最適化された。セルの組成を変更することは可能ですが、最適化が必要な差分ECM条件が必要な場合があります。ECMコーティングに続いて、iBMECsを適切にシードすることが重要です。高い細胞播種密度(>14 x 106セル/mL)は、完全な単層を得るために不可欠です。完全な細胞の集結性を達成するために失敗した場合、播種中に20 x 106細胞/mLまでの細胞懸濁液の密度をさらに高めることが推奨されます。
層流は、iBMEC成熟15を増強するために以前に提案され、マイクロ流体プラットフォームによって提供される利点を満たすために不可欠である。しかし、チップのチャネルを流れるマイクロバブルは、物理的にストレスを与え、常駐細胞を剥離し、BBBチップの完全性を破壊する可能性があります。層流中のマイクロバブル形成を避けるためには、灌流が開始される前に培地を平衡化することが重要である。平衡化は、使用前に媒体の前温・脱ガスを必要とする。
個人向けチップの生成は、ヒトiPSC由来のiBMECとiNPCの両方を使用して可能になります。iBMECの分化は短く、むしろ単純な24、22であるが、神経細胞21、25へのiPSCの分化はより困難である。しかし、チップの「脳側」に存在する神経細胞は、原発神経細胞やiPSC由来運動ニューロン16などの任意の神経細胞型に置き換えることができる。「ボナフィデス」内皮細胞と同様に、iBMECsは異なる神経共培養に応答して遺伝子発現に可塑性を示す。したがって、この柔軟性は、チップ上のさまざまなIUSの将来の開発をもたらす可能性があります。システムのさらなる柔軟性は、細胞の播種タイミングおよび順序を調整することによって得ることができる。iBMECは神経細胞の前または後に播種することができ、神経細胞の播種と結合の直後、またはEZ球体がチップ環境でより成熟した神経培養に分化した後にiBMECsを播種することが可能になる。これは特に重要です, iPSC由来の神経細胞の未熟な性質を考えると.EZ球体が初期の神経前駆細胞であることを考えると、より長い分化期間はまた、アストロサイトおよびニューロンの割合の増加をもたらす可能性があります。
プロトコルから欠落している1つの成分は、生理学的NVUに重要な成分を提供する血管内皮細胞である。iPSCがペリサイト様細胞26,27に分化する最近の進歩により、この追加細胞タイプの導入が可能になり、パーソナライズされた性質を維持しながらBBBのレプリカを改善することができます。
IBMECは、細胞マーカーの発現、TEERの確立、および流出ポンプ28、24、5の機能的活性を含むBBBモデリングに不可欠な様々な特性を実証するために以前に示されている。しかし、分子分析により、これらの細胞は、いくつかの上皮マーカー15も発現する。機能改善及び内皮マーカー発現を示すiBMEC生成の進歩は、最近29、30について記載されている。ここで示すパラダイムに続いて、これらの潜在的に改善された細胞は、将来のアプリケーションのためにBBBチップモデルに容易に組み込むことができます。ここで説明する柔軟で堅牢なプラットフォームは、疾患モデリングと新しいCNS薬の開発と評価の両方を促進する可能性があります。
このプロトコルは、特定の市販製品に依存していますが、追加の商業企業は、代替の利点を提供する可能性があり、多様な微小生理学的プラットフォームを提供しています31.さらに、マイクロ流体オルガンチップの「社内」製造のためのプロトコルも32利用可能であり、ここで使用されるプラットフォームから欠落しているTEER電極17の統合を含むより多くのモジュール性を提供することができる。
現在の細胞培養33の生理学的文脈を改善するための代替アプローチとしてオルガンオンチップが導入された。しかし、この技術の応用には、生物学的指向のラボに欠けている専門的なエンジニアリングスキルが必要です。ここで採用されているような市販のチッププラットフォームは、モジュール性が低く、堅牢性と再現性が向上しており、より幅広いユーザーが適用できます。さらに、マイクロ流体チップ上の層流の適用は、シリンジまたは蠕動ポンプの適用に依存し、これは複雑さの別のレベルを導入する。この障害は、複数のチップの同時灌流を容易にする培養モジュールの適用により克服することが容易になりました。
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Disclosures
シダーズ・シナイは、研究のマイクロ流体オルガンチップを生産するエミュエミュレートの少数株の株式を所有しています。シダーズ・シナイの役員もエミュレーションの取締役会で働きます。エミュレートは、この研究のための財政的支援を提供していません。シダーズ・シナイとエミュレーションは、この作品に関連して特許を出願しています。
Acknowledgments
批判的な編集に対するソシャナ・スヴェンセン博士に感謝します。この研究は、イスラエル科学財団助成金1621/18、科学技術省(MOST)、イスラエル3-15647、カリフォルニア再生医療研究所助成金DISC1-08800、シャーマンファミリー財団、NIH-NINDS助成金1UG3NS105703、ALS協会助成金18-SI-389によって支援されました。AHはワレンバーグ財団(助成金番号2015.0178)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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