Summary
Het doel van dit werk is het ontwikkelen van een methode om cardiomyocyten reproduceerbaar te isoleren van het volwassen hart en het DNA-gehalte en nucleatie te meten.
Abstract
Het volwassen zoogdierhart bestaat uit verschillende celtypen, waaronder cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten. Omdat het moeilijk is om op betrouwbare wijze kernen van cardiomyocyten op histologische secties te identificeren, vertrouwen veel groepen op het isoleren van levensvatbare cardiomyocyten voorafgaand aan fixatie om immunostaining uit te voeren. Deze live cardiomyocyte isolatietechnieken vereisen echter optimalisatie om de opbrengst, levensvatbaarheid en kwaliteit van de monsters te maximaliseren, met inherente schommelingen van monster tot monster ondanks maximale optimalisatie. Hier rapporteren we een reproduceerbaar protocol, waarbij fixatie voorafgaand aan de enzymatische vertering van het hart, die leidt tot maximale opbrengst met behoud van de in vivo morfologie van individuele cardiomyocyten. We ontwikkelden verder een geautomatiseerd analyseplatform om het aantal kernen en DNA-inhoud per kern voor individuele cardiomyocyten te bepalen. Na het blootstellen van de borstholte, werd het hart gearresteerd in diastole door perfusie met 60 mM KCl in PBS. Vervolgens werd het hart bevestigd in 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing, en vervolgens verteerd met 60 mg/mL collagenase oplossing. Na de spijsvertering werden cellen ge singulariseerd door trituratie, en de cardiomyocyte fractie werd verrijkt via differentiële centrifugatie. Geïsoleerde cardiomyocyten werden gekleurd voor Troponin T en α-actinine om de zuiverheid van de verkregen populatie te beoordelen. Verder ontwikkelden we een beeldanalyseplatform om cardiomyocyte nucleatie en ploidy status te bepalen na DAPI-kleuring. Image based ploidy assessments leidden tot consistente en reproduceerbare resultaten. Met dit protocol is het dus mogelijk om inheemse morfologie van individuele cardiomyocyten te behouden om immunocytochemie en DNA-inhoudsanalyse mogelijk te maken en tegelijkertijd een maximale opbrengst te bereiken.
Introduction
Hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak in de meerderheid van de westerse landen voor vele decennia1,2. Hoewel veel verbeteringen in de behandeling van hart- en vaatziekten de overleving hebben verbeterd, zijn er momenteel geen behandelingen die verloren cardiomyocyten kunnen vervangen. Daarom zijn en blijven studies met betrekking tot cardiomyocytefunctie, proliferatie, apoptose en hypertrofie een belangrijke focus van de wetenschappelijke gemeenschap. Aangezien het volwassen zoogdierhart een zeer beperkte regeneratieve capaciteit heeft, met een geschatte cardiomyocytevernieuwingsgraad van minder dan 1% per jaar, is het van cruciaal belang om cardiomyocyte proliferative events3,4betrouwbaar te identificeren. De meeste strategieën die proliferative gebeurtenissen meten, zijn afhankelijk van kleuring voor opgenomen DNA-nucleotideanaana's om eerdere of huidige proliferatie te beoordelen, of vlek voor nucleaire markers van actieve proliferatie5. Het is vooral belangrijk om cardiomyocyte proliferative gebeurtenissen betrouwbaar te identificeren, omdat het totale aantal proliferative cardiomyocyten zo laag is3,6. Bijvoorbeeld, op basis van een 1% vernieuwing tarief van endogene cardiomyocyten per jaar, kan men verwachten te vinden tussen de 25 en 50 cardiomyocyten te worden proliferative op een bepaald moment in de volwassen muis hart7,8. Eventuele onnauwkeurigheden bij de identificatie van cardiomyocyte kernen kunnen leiden tot vals-positieve resultaten. Daarom is het van cruciaal belang om cardiomyocyte kernen betrouwbaar te identificeren, die moeilijk en onbetrouwbaar is gebleken uit histologische secties9. Identificatie van cardiomyocyten is veel nauwkeuriger uit enkele cellen dan van weefselsecties omdat het moeilijk kan zijn om cardiomyocyten te onderscheiden van andere celtypen, zelfs bij het gebruik van markers zoals α-actinine, hoewel PCM1 een betrouwbare marker van cardiomyocyte kernen in histologische secties10zou kunnen zijn.
De huidige protocollen zijn gebaseerd op het isoleren van levende cardiomyocyten voorafgaand aan fixatie, waarvan bekend is dat het de dood van ten minste 30% van de cardiomyocyten veroorzaakt en kan leiden tot onbedoelde selectie van specifieke populaties cardiomyocyten11. Bovendien zijn deze protocollen notoir moeilijk te optimaliseren om reproduceerbare resultaten te leveren. Zelfs geoptimaliseerde isolatietechnieken kunnen doorgaans niet meer dan 65% live, staafvormige cardiomyocyten met verschillende opbrengstenproduceren 12.
Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een protocol waarmee onderzoekers vaste cardiomyocyten kunnen isoleren. Aangezien de monsters zijn vastgesteld voorafgaand aan isolatie, wordt de opbrengst gemaximaliseerd en is in vivo morfologie goed bewaard gebleven. Bovendien is het met dit protocol mogelijk om cardiomyocyten te isoleren van klinische monsters, die doorgaans direct na de aanschaf worden vastgesteld. Bovendien, om nieuw gegenereerde cardiomyocyten te identificeren, is het belangrijk om de nucleatie en ploidy status van individuele cardiomyocyten te meten, omdat alleen diploïde cardiomyocyten doorgaans worden verondersteld nieuw gevormd te zijn. Flow cytometrie kan multinucleatie niet onderscheiden van polyploïdie en is een relatief tijd- en resource-intensief protocol. Handmatige uitstrepen en meten van kernen in beelden is zeer lage doorvoer en gevoelig voor menselijke bias. Geautomatiseerde kwantificering van beelden van vaste, geïsoleerde DAPI-gekleurde cardiomyocyten lost beide problemen op. Imaging-gebaseerde bepaling van nucleatie en ploidy distributies kunnen worden verkregen met een minimum aan tijd en reagentia met behulp van basisapparatuur.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Voorbereiding van de oplossingen en chirurgische apparatuur
- Steriliseer voorafgaand aan de isolatie de chirurgische apparatuur met behulp van 70% ethanoloplossing.
- Voeg 2,24 g KCl toe aan 500 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een uiteindelijke concentratie van 60 mM te verkrijgen. Bewaar KCl-PBS-oplossing op kamertemperatuur. Gebruik 3 mL KCl-PBS-oplossing per muis.
- Verdun 32% paraformaldehyde (PFA) oplossing met PBS tot het verkrijgen van de uiteindelijke concentratie van 4% PFA. Bereid 10 mL van 4% PFA in PBS per muis. Verdunde PFA-oplossing kan 2-3 weken in een glascontainer worden opgeslagen bij 4 °C.
LET OP: Bereide 4% PFA-oplossing kan voor langere tijd bij -20 °C worden opgeslagen. - Bereid 1 mL collagenase oplossing per muis door het toevoegen van 60 mg collagenase, type 2 per 1 mL PBS.
2. Perfusie en fixatie van het hart
- Verdoven het dier door gebruik te maken van 2-5% isoflurane met een zuurstofstroom van 1 L/min. Bevestig de anesthesie door het gebrek aan beweging en een lager ademhalingspercentage te bevestigen.
OPMERKING: Het injecteren van heparine (100-500 U/kg) vóór euthanasie kan de celkwaliteit en opbrengst verhogen door bloedstolsels te voorkomen, waardoor een efficiëntere perfusie van het hart met fixatief mogelijk wordt. - Euthanasereren het dier volgens goedgekeurde methoden.
OPMERKING: We volgden de Richtlijnen van de American Veterinary Medical Association voor de euthanasie van dieren en kregen lokale IACUC-goedkeuring voor euthanasie. - Plaats het geëuthanaseerde dier in supine positie, en tape naar beneden verlengde ledematen.
- Snijd door de borst om het hart bloot te stellen met behulp van stompe schaar. Snijd aflopende aorta en inferieure caval ader.
- Doorsnede het hart door het injecteren van 3 mL van KCl-PBS oplossing door de linker ventrikel met een stroomsnelheid van 3 mL / min met behulp van een peristaltische pomp bevestigd aan een infusie set met een 23 G vlindernaald (26 G voor neonaten). Zorg ervoor dat u niet door het septum doorboort.
OPMERKING: Gebruik ook een naald die aan een spuit is bevestigd om oplossingen te injecteren. - Doorsnee het hart door het injecteren van 10 mL van 4% PFA oplossing voor 10 minuten met behulp van een peristaltische pomp met een snelheid van 1 mL/min.
- Verwijder het hele hart met een schaar. Na het verwijderen van het hart is het mogelijk om een specifieke regio van het hart te isoleren door in te peren. Plaats het hart, of een segment ervan in een 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL van 4% PFA oplossing. Broed het hart op rocker op kamertemperatuur met schommelsnelheid tussen 20-30 rpm voor 1 uur.
3. Isolatie van vaste cardiomyocyten
- Plaats het hart in een petrischaaltje met PBS-oplossing. Knijp het hart om zich te ontdoen van een PFA resterende in ventrikels, en wassen in PBS.
- Zet het vaste hart in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis met collagenase oplossing (60 mg/mL). Plaats de buis op tuimelschakelaar (20-30 rpm) bij 37 °C voor nachtelijke incubatie.
OPMERKING: Verleng de incubatietijd tot 1 week en vul de collagenase-oplossing om de twee dagen aan om de mogelijke variatie in opbrengst te verminderen als er naar verwachting harten fibrotisch zijn, wat mogelijk langer tijd van collagenase spijsvertering nodig heeft om extracellulair collageen te verteren. - Doe collagenase oplossing en het hart in een petrischaaltje van 35 mm. Dissociate het hart in stukken van 1 mm met behulp van tangen of scharen.
- Gebruik een transferpipet om het gescheiden weefsel gedurende 2 minuten verder te tritureren. Als weefseldeeltjes nog steeds in de schotel blijven, gebruik dan een transferpipet met smallere opening en zet trituratie voort. Ga door totdat het grootste deel van het weefsel is afgebroken.
OPMERKING: Over trituratie zorgt ervoor dat individuele cardiomyocyten breken. Zorg ervoor dat niet over trituraat door regelmatig te controleren onder een microscoop. - Plaats een 200-600 μm nylon gaas over de opening van 15 mL centrifuge buis.
OPMERKING: Voor hypertrofie cardiomyocyten wordt aanbevolen om 400 μm nylon mesh te gebruiken in plaats van 200 μm. - Voeg 5 mL PBS toe aan de petrischaal met gescheiden cellen en filter de oplossing door nylon gaas, inclusief weefseldeeltjes. Was het nylon gaas door extra 4 mL PBS door te geven.
- Centrifugeren de gefilterde oplossing op 10-100 x g gedurende 1 min.
LET OP: 100 x g centrifugatie zal niet opleveren 100% pure cardiomyocyte bevolking, en sommige niet-cardiomyocyte cellen zijn waarschijnlijk worden opgenomen. - Gooi de supernatant, tenzij men wil vlek / evalueren niet-cardiomyocyten hartcellen ook. Resuspend de pellet in 10 mL PBS voorafgaand aan vlekken.
4. Kleuring cardiomyocyten
- Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 5 mL permeabilisatieoplossing toe (bijvoorbeeld 0,5% Triton X-100 in PBS). Incubeer voor 20 min bij kamertemperatuur op rocker.
OPMERKING: Voor de stappen 4.1, 4.2 en 4.4 gebruik 15 mL centrifugebuizen omdat het gemakkelijker is om het supernatant te verwijderen zonder de celpellet te storen in vergelijking met 1,5 mL microcentrifugebuizen. - Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min, voeg 5 mL blokkeerbuffer toe (bijvoorbeeld 3% runderserumalbumine [BSA] in PBS) en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker.
- Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 1 mL primaire antilichaamoplossing (in PBS) toe met de juiste verdunningsverhouding. Breng de oplossing in 1,5 mL microcentrifugebuis en incubeer cardiomyocyten in primaire antilichaamoplossing onder geoptimaliseerde omstandigheden (bijvoorbeeld 4 °C 's nachts).
- Breng cardiomyocyten met primaire antilichaamoplossing over naar een centrifugebuis van 15 mL en voeg 9 mL PBS toe. Incubeer de cardiomyocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker.
- Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 10 mL PBS toe. Incubeer de cardiomyocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Herhaal deze stap nogmaals.
- Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe die DAPI bevat. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker, gevolgd door twee keer stap 4,5 te herhalen om cardiomyocyten te wassen.
- Plaats de cellen op coverslips of microscoop-compatibele platen en ga verder met beeldvorming.
LET OP: Afbeeldingen in het manuscript zijn gemaakt met 10x en 40x doelstellingen. Gebruikte lasers waren: 405 nm voor DAPI, 561 nm voor Alpha actinine en 640 nm voor Edu.
5. Software voor het instellen van beeldvorming
OPMERKING: Volg deze stappen met behulp van Supplementy File 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Download de Fiji-distributie van ImageJ.
- Open Fiji. Klik op Help > Bijwerken... > Updatesites beheren. Controleer de updatesites "IJPB-plugins" en "Biomedgroup" om de afhankelijkheden plugins Ellipse Split en Morpholibj te downloaden.
- Klik op Sluiten. Fiji moet beginnen met het downloaden van de afhankelijkheden. Start Fiji opnieuw op als je klaar bent.
- Download Rstudio en open het.
- Kopieer install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) in de opdrachtregel van de R-console en druk op de Enter-toets. Typ "y" in reactie op alle aanwijzingen om alle R-afhankelijkheden te installeren (Screenshot 1 in aanvullend bestand 1).
6. Beeldkwantificering
- Open Fiji en sleep "AnalyzeNucleation.py" (geleverd als aanvullende codebestand) naar de statusbalk van Fiji. Hiermee wordt een venster voor het bewerken van scripts geopend. Klik linksonder op Uitvoeren om te beginnen (Screenshot 2 in Aanvullend bestand 1).
- Er verschijnt een dialoogvenster(Aanvullend bestand 1:Screenshot 3) waarin wordt gevraagd naar de locatie van de uitvoergegevensmap. Alle analysegegevens, cijfers en andere gegevens die door deze software worden gebruikt, worden in deze map opgeslagen. Een ander, groter dialoogvenster verschijnt, met alle instellingen voor beeldanalyse(Aanvullend bestand 1:Screenshot 4).
- Selecteer de locatie van de map met afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd.
- Voer de bestandsindeling voor afbeelding in met reguliere expressies. Voer de bestandsindeling voor afbeelding in, die aangeeft welke delen van de bestandsnaam overeenkomen met rij-, kolom-, kanaal- en (optioneel) site binnen braces, met behulp van reguliere expressies. Plaats geen spaties in de beugels. Variabele delen van de bestandsnaamindeling omringen in braces {}. De manier waarop bestanden worden opgeslagen, is afhankelijk van de beeldsoftware en deze stap haalt relevante informatie op uit de afbeeldingsbestandsnaam.
OPMERKING: de tekenreeks voor opmaak
r" Plaat 1-(? P[A-Za-z]+)(? P [0-9]+)-(? P [A-Za-z]+).tif"
beschrijft een bestandsnaam die begint met "Plaat 1-", die wordt gevolgd door een of meer alfabetische letters die de rij aangeven, gevolgd door een of meer cijfers die de kolom aangeven, die wordt gevolgd door "-", die wordt gevolgd door een of meer letters die het kanaal aangeven, gevolgd door ".tif". De letters in de hoekhaakjes zoals "<>" zijn variabele namen en worden automatisch gekopieerd naar de gegevens wanneer deze worden verzameld. Een van de variabele namen moet "" zijn - Geef de naam aan van kanalen waarin de nucleaire vlek zichtbaar is en waar de cardiomyocyten zichtbaar zijn. Deze namen moeten precies zijn zoals ze zijn in het deel dat wordt geëersed door de variabele "
" in de bestandsnamen voor reguliere expressie. - Geef aan hoe de afbeeldingen moeten worden gegroepeerd met variabele namen die van komma's zijn gescheiden. Alle afbeeldingen binnen een bepaalde groep worden in één batch geopend en geanalyseerd. Als de afbeeldingen bijvoorbeeld zijn onderverdeeld in sets voor elke put en er een goed is voor elke unieke combinatie van rij en kolom, schrijf dan 'rij, kolom' in dit veld.
OPMERKING: Deze groeperingsvariabelen moeten een subset zijn van de variabelen die in de opmaaktekenreeks worden gebruikt. Gebruik 'kanaal' niet als groeperingsvariabele, dit scheidt overeenkomstige kanaalafbeeldingen van elkaar. - Geef aan of afbeeldingen al dan niet in één putafbeelding aan elkaar zijn genaaid of voor elke site gescheiden zijn. In het eerste geval mag de site niet worden aangegeven in de tekenreeks bestandsnaam.
- Kies welke drempelmethode moet worden gebruikt om kernen van de achtergrond te scheiden. Alle standaard thresholdingsmethoden van Fiji zijn beschikbaar. Test verschillende drempelmethoden om te bepalen welke het beste werkt voor de afbeeldingsset. Kies in dit voorbeeld de Otsu-methode.
- Geef aan of de drempelwaarde voor elke siteafbeelding opnieuw moet worden berekend of dat voor elke afbeelding in de groep dezelfde drempelwaarde moet worden gebruikt. Geef aan of de cardiomyocyte-beelden brightfield zijn of een fluorescerende markering gebruiken.
- Geef de cardiomyocyte thresholding methode aan. Als brightfield in de vorige stap is gekozen, wordt deze drempelmethode toegepast op helderdere veldafbeeldingen met een rand. Geef aan of de drempelwaarde voor elke siteafbeelding opnieuw moet worden berekend of dat voor elke afbeelding in de groep dezelfde drempelwaarde moet worden gebruikt.
- Geef het aantal rijen siteafbeeldingen aan dat elk goed beslaat. Geef het aantal kolommen met siteafbeeldingen aan dat elk goed bestrijkt. Geef het minimumoppervlak van kernen in pixels aan. Gebruik een royaal lage minimumgrootte, een hogere en nauwkeurigere drempel wordt berekend in de analysestap. Geef het minimumgebied van cardiomyocyten aan.
- Klik na het kiezen van de gewenste instellingen op OK.
- Afbeeldingen die lijken op afbeeldingen in figuur 3 en figuur 4, verschijnen op het scherm, met de verschillende stadia van de analysepijplijn. Inspecteer deze afbeeldingen om ervoor te zorgen dat drempelwaardering en segmentatie correct plaatsvinden.
- De geselecteerde resultatenmap moet nu worden gevuld met analysegegevens(Aanvullend bestand 1: Screenshot 5). Andere bestanden dan analysegegevens kunnen veilig worden opgeslagen in deze map, zolang hun namen niet beginnen met "cm_", "nuclei_" of "nucleilink_".
7. Gegevensanalyse
OPMERKING: De geproduceerde csv-bestanden kunnen handmatig worden geanalyseerd. Elke geanalyseerde afbeeldingssubset produceert een triplet csv-bestanden met de naam "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" en "cardiomyocyten(metadata),csv", waarbij (metadata) wordt vervangen door een reeks naam-waardeparen van het formulier "_(name)=(waarde)", waarbij (naam) en (waarde) sequenties van alfanumerieke tekens zijn die zijn afgeleid van tekenreeksen die overeenkomen met de reguliere expressie die eerder is gegeven. (Als bijvoorbeeld rij en kolom in de bestandsnamen zijn aangegeven, zijn tekenreeksen als '_row=F' en '_column=8' aanwezig). De naamloze linkerste kolom van elke kernen en kernenlink bestand is een kern-ID-nummer. De "Min" kolom van de kernenlink bestand is de id van de cardiomyocyte die bevatte zei kern geheel of 0 anders. De "Max" kolom van de kernen is de ID van de hoogst genummerde cardiomyocyte die deze kern voor een deel bevatte, of 0 anderszins. De "Gemiddelde" kolom van het cardiomyocyten-bestand is het cardiomyocyte id-nummer.
- Open "AnalyzeMultinucleatedServer.R" in Rstudio (verstrekt als aanvullend codebestand).
- Boven aan dit bestand bevindt zich een variabele met de naam "folderName". Ernaast is een filepath. Typ hier het pad naar de uitvoergegevensmap die in de laatste stap is geselecteerd, zonder de laatste slash(Aanvullende bestand 1: Schermafbeelding 6).
- In de linkerbovenhoek van het venster voor het bewerken van scripts moet er een groene pijl met het label Run Appstaan. Klik op deze pijl. Het kan enige tijd duren voordat de gegevens zijn geladen en dat de app is op te duiken.
- In eerste instantie zullen drie gatinggrafieken zichtbaar zijn, één om de minimale geldige kernareaaldrempel aan te geven, één om de minimale geldige kernintensiteitsdrempel aan te geven, en één om de maximale geldige minimumbemestingsdiameter voor cardiomyocyten aan te geven. Gebruik de schuifregelaars om deze drempelwaarden in te stellen(Aanvullend bestand 1: Screenshot 7).
OPMERKING: In elk van deze grafieken moet een grote, brede piek aanwezig zijn die overeenkomt met geldige kernen of cardiomyocyten, geflankeerd door brede staarten die puin of foutieve gesegmenteerde cardiomyocyten vertegenwoordigen. Gebruik de drempels om een staart van elk van de pieken af te snijden. - Scroll naar beneden. Klik op de knop Geselecteerde drempelwaarden toepassen (onder aan Aanvullend bestand 1: Screenshot 7).
- Klik op de knop Plotintensiteitsverdeling. Hierdoor wordt voor elke groepingsvariabele een plot van de verdeling van de nucleaire intensiteit van zowel de gehele steekproef als afzonderlijke subplots weergegeven.
OPMERKING: Als bijvoorbeelden groeperingsvariabelen zijn ingevoerd in de reguliere expressie in het dialoogvenster Fiji, worden hier plots weergegeven die de intensiteitsverdeling per rij en per kolom aangeven(Aanvullend bestand 1: Schermafbeelding 8). Als de verlichting en de kleuringsvoorwaarden constant waren over de verschillende delen van het monster, zouden deze percelen allen duidelijk twee intensiteitspieken moeten tonen, dimmer, langere voor de diploïde kernen en helderder, kortere voor de tetraploid kernen. - Intrasample variatie zal resulteren in dit patroon niet zichtbaar in de hele steekproef plot en er is grote variatie in de locatie van de diploïde en tetraploïde pieken per rij, kolom, of andere groepering variabele. In het laatste geval schuift u naar beneden het selectievakje Afzonderlijk normaliseren per groep aan om rekening te houden met deze variatie(Aanvullend bestand 1: Screenshot 9).
- Klik op de knop Ploidy berekenen (Aanvullend bestand 1: Screenshot 9). Klik op de knop Plot Estimated Ploidy Distribution. Grafieken worden weergegeven in de lege vensters aan de rechterkant. In de genormaliseerde hele-sample grafiek, moet de twee-piek patroon zichtbaar zijn als het niet eerder was.
- Selecteer drempels om de diploïde en tetraploïde pieken van elkaar en uitschieters te isoleren met behulp van de schuifregelaars(Aanvullend bestand 1: Screenshot 9). Scroll naar beneden. Klik op de knop Ploidy en Nucleation (Aanvullend bestand 1: Screenshot 10).
- Klik op de map Plot en Opslaan in resultaten. De plot opgeslagen in de geselecteerde resultaten map zal ook verschijnen in dit interactieve venster(Aanvullende bestand 1: Screenshot 10).
Representative Results
Cardiomyocyten werden geïsoleerd volgens het hierboven beschreven protocol. Met behulp van deze methode krijgen we meestal uniform ge singulariseerde cardiomyocyten die relatief zuiver zijn zonder niet-cardiomyocytecellen te besmetten(figuur 1A). Cardiomyocyten zijn gemakkelijk te herkennen onder heldere veldmicroscopie vanwege hun karakteristieke grootte en birefringence. Deze techniek is eenvoudig te implementeren en levert consistente resultaten van verschillende isolaties met vergelijkbare cardiomyocyte opbrengsten en kwaliteit(figuur 1B). Geïsoleerde cardiomyocyten kunnen enkele weken voor verder gebruik bij 4 °C worden bewaard.
Cardiomyocyten die volgens het bovenstaande protocol geïsoleerd waren, kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, zoals het meten van cardiomyocytegrootte, cardiomyocyte ploidy en immunocytochemie. Als representatief resultaat tonen we aan dat cardiomyocyten geïsoleerd volgens dit protocol kunnen worden gekleurd met behulp van antilichamen en fluorochrome-geconjugeerde azides voor klikchemie om lokalisatie van specifieke eiwitten te detecteren of om cardiomyocyte DNA-replicatie te detecteren, respectievelijk. We bevlekten bijvoorbeeld cardiomyocyten met antilichamen die α-actinine herkennen om het karakteristieke z-line kleurpatroon van sarcomeres(figuur 2A)te laten zien. In een apart experiment hebben we de thymidine analoge 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) toegediend aan muizen voordat we vaste cardiomyocyten hadden geïsoleerd. Na cardiomyocyte isolatie, we bevlekt voor opgenomen EdU met behulp van standaard protocollen13, en waren in staat om cardiomyocyten die S-fase had ondergaan in een mononucleated, binucleated en trinucleated cardiomyocyten (Figuur 2B) op te sporen.
Om het nut van de isolatiemethode verder uit te breiden, ontwikkelden we een pijplijn die kwantificering van cardiomyocyte ploidy mogelijk maakt op basis van geïntegreerde DNA-kleuring. Om de ploidy-status van cellen of kernen te kunnen meten, moesten we kernen en cardiomyocyten segmenteren. Figuur 3 toont een weergave van de strategie die we gebruikten om individuele kernen te identificeren. Ten eerste wordt de oorspronkelijke beeld-DNA-bevlekte afbeelding(figuur 3A) drempels op basis van intensiteit(figuur 3B). Hier gebruikten we DAPI om te vlekken voor DNA, maar elke andere nucleaire kleurstof die een lineaire correlatie met DNA-gehalte toont zou werken. Het programma maakt het mogelijk voor een van fiji's intensiteit thresholding methoden worden gekozen, maar in dit voorbeeld Otsu's methode werd gebruikt. Kernmaskers die de rand van de afbeelding raken of kleiner zijn dan de opgegeven minimumpixelgebieddrempel, zijn uitgesloten. Dan zijn ellipsen geschikt voor de kernmaskers, waardoor individuele kernen worden gesegmenteerd. Figuur 3C toont deze ellipsen bedekt op de oorspronkelijke afbeelding. Vervolgens worden gaten opgevuld in de maskers, en de pixels van de afbeelding worden vervolgens verdeeld in gebieden op basis van welke ellips ze het meest proximaal aan (Figuur 3D). De grenzen van deze gebieden worden vervolgens gebruikt om lijnen te trekken door middel van nucleaire clusters, afwerking van de nucleaire segmentatie proces (Figuur 3E).
De volgende stap is de detectie van cardiomyocyten. Voor cardiomyocyte beelden die worden verkregen op basis van fluorescerend gekleurde cellen(figuur 4A), het proces is zeer vergelijkbaar met die voor kernen. De afbeelding wordt voordrempels berekend op basis van een intensiteitswaarde die wordt berekend door de geselecteerde drempelmethode, in dit geval de driehoeksmethode. Geïdentificeerde cardiomyocyte maskers die de grens van de afbeelding raken of onder een bepaalde grootte zijn uitgesloten en gaten worden gevuld in de maskers om goed gesegmenteerde cardiomyocyten te bieden (figuur 4B). Omdat cardiomyocyten een onregelmatigere vorm hebben dan kernen, wordt er geen poging gedaan om cardiomyocyte clusters te segmenteren. In plaats daarvan worden deze clusters uitgesloten op basis van de diameter van hun hoge minimum feret tijdens de analysestap. Segmentatie van heldere veldbeelden verloopt iets anders. Eerst wordt de oorspronkelijke heldere veldafbeelding(figuur 4C)verwerkt met een Sobel-randfilter. Dit filter berekent de absolute waarde van het verloop van elke pixel in de afbeelding. Pixels in regio's met snelle wijzigingen ontvangen hoge waarden en pixels in vloeiende gebieden van de afbeelding ontvangen lage waarden. Deze rand gefilterde afbeelding wordt vervolgens drempels door intensiteit, met behulp van de Driehoek methode, wat resulteert in gemaskerde cardiomyocyten (Figuur 4D). Deze zeer onregelmatige maskers worden vervolgens gladgestreken en met elkaar verbonden via morfologische sluiting met behulp van een cirkel met een straal van 2 pixels, die alle witte gebieden in het beeld opvult waar de cirkel niet kan passen zonder een zwart gebied te overlappen(figuur 4E). Ten slotte worden gaten in de maskers gevuld, zijn gebieden die de grens raken uitgesloten en worden kleine deeltjes verwijderd, waarbij het cardiomyocyte segmentatieproces wordt afgewerkt (figuur 4F).
Met behulp van de geschetste segmentatiestrategie kunnen we vervolgens de nucleatiestatus van individuele cardiomyocyten bepalen. Met behulp van deze aanpak hebben we de nucleatiestatus van cardiomyocyten geïsoleerd uit harten van outbred CD-1 muizen op vroege postnatale tijdspunten. Harten van pasgeboren muizen (eerste dag van het leven) bleek dat de meerderheid van de cardiomyocyten op dat punt zijn mononucleated (Figuur 5: neonatale). Deze hoge frequentie van mononucleated cardiomyocyten is veel lager bij jonge muizen (2 weken oud), waar mononucleated cardiomyocyten ongeveer 25% van de totale cardiomyocytepopulatie uitmaken(figuur 5: jeugd). Ten slotte kunnen we de ploidy status van individuele kernen binnen cardiomyocyten meten en bepalen of ze diploïde of tetraploïde zijn. Deze resultaten tonen een hogere frequentie van tetraploïde kernen bij adolescente muizen(figuur 6).
Figuur 1: Efficiëntie van cardiomyocyte isolatie na fixatie. (A) Representatief beeld van geïsoleerde cardiomyocyten bevlekt met DAPI om kernen te tonen. (DAPI (blauw), Brightfield (grijs)) (B) Opbrengst van cardiomyocyten geïsoleerd van verschillende muizen op 3 maanden oud. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Immunocytochemie van geïsoleerde cardiomyocyten. (A) Representatief beeld van cardiomyocyten bevlekt voor α-actinine (α-actinine (rood) en DAPI (blauw)). (B) Cardiomyocyten gekleurd voor opgenomen EdU (rood) en DAPI (blauw). Representatieve cardiomyocyten die mononucleated (links), binucleated (midden) en trinucleated (rechts) en EdU positief worden getoond. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Strategie voor nucleaire segmentatie. (A) Originele DAPI-kanaalafbeelding. (B)Drempelafbeelding (in dit voorbeeld werd de methode van Otsu gebruikt). (C) Maskers die zijn geïdentificeerd op basis van de drempel afbeeldingen bedekt op de oorspronkelijke DAPI gekleurde afbeelding. (D) Voronoi tessellation op basis van kernmaskers. (E) Laatste gesegmenteerde kernen, met gesplitste clusters gemarkeerd. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Strategie voor cardiomyocyte segmentatie. (A) Originele fluorescerende Troponin ik bevlekte cardiomyocyte beeld. (B) Driehoek-drempel beeld, na het vullen van gaten en met uitzondering van kleine objecten en die het aanraken van de rand. (C) Originele heldere veld cardiomyocyte beeld (D) Edge-gefilterd en driehoek-drempel cardiomyocyte beeld (E) Edge-gefilterde afbeelding na morfologische sluiting met een straal van twee pixels (F) Hetzelfde beeld na het vullen van gaten en met uitzondering van kleine objecten en die het aanraken van de rand. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Classificatie van cardiomyocyten op basis van het aantal kernen. Neonatale harten (1 dag oud) bevatten meer mononucleated cardiomyocyten dan jonge harten (14 dagen oud). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Distributie van cardiomyocyten-DNA-gehalte per kern. In neonaten (links) is 13,5% van de mononucleated CM-kernen tetraploïde en 11,9% van de binucleated CM-kernen tetraploïde. Bij jongeren (rechts) is 33,9% van de mononucleated CM-kernen tetraploïde en 31,2% van de binucleated CM-kernen tetraploïde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Softwarescreenshots. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend dossier 2: AnalyzeNucleation.py. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend bestand 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Aangezien cardiomyocyten niet in cultuur kunnen worden gehandhaafd, is het belangrijk om primaire cardiomyocyten te isoleren om hun architectuur en functie11te kunnen bestuderen. Vandaar, cardiomyocyte isolatie technieken zijn op grote schaal gebruikt in het hartveld. Als het doel is om functionele aspecten van cardiomyocyten te bepalen, is het belangrijk om levensvatbare cardiomyocyten te isoleren. Deze levende cardiomyocyten kunnen ook worden gebruikt om immunostaining uit te voeren op geïsoleerde cardiomyocyten. Echter, het optimaliseren van de techniek van het isoleren van levende cardiomyocyten is technisch uitdagend, en zelfs de beste technieken meestal alleen opleveren 60-65% live staafvormige cardiomyocyten, en de resterende cardiomyocyten zijn allemaal balled up en sterven of dood11,12. Hier ontwikkelden we een techniek waarmee onderzoekers eerst het hart kunnen repareren en cardiomyocyten vervolgens efficiënt kunnen isoleren. Dit nieuwe protocol zorgt voor veel hogere opbrengsten van staafvormige cardiomyocyten in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen. Verder ontwikkelden we een imaging analyse platform om cardiomyocyten automatisch te categoriseren op basis van nucleatie en ploidy. Met deze nieuwe methodologieën kunnen groepen cardiomyocyten vlekken voor verschillende eiwitten en cardiomyocyte ploidy en nucleatiestatus bestuderen als surrogaten voor het regeneratieve potentieel van het hart.
Het hier beschreven protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder geavanceerde apparatuur. De hoeveelheid collagenase en incubatietijd voor de spijsvertering kan variëren afhankelijk van de collagenase partij, en het bedrijf dat het. We gebruikten collagenase type 2, omdat dit het meest wordt gebruikt om het hart te verteren voor het verkrijgen van levende cardiomyocyten. Op basis van onze waarnemingen hebben we vastgesteld dat 's nachts incubatie met 60 mg/mL collagenase type 2 optimaal is voor bijna alle muisharten, ongeacht het niveau van fibrose. We hebben nog nooit een probleem van overdigestie als intracellulaire eiwitten zijn vastgesteld en niet zo toegankelijk als extracellulair collageen. Echter, als het hart niet goed wordt verteerd, meer krachtige trituratie nodig zou kunnen zijn, die celfragmentatie veroorzaakt als gevolg van schuifspanning. Zo is het cruciaal om ervoor te zorgen dat het hart goed wordt verteerd voordat u overgaat tot trituratie. Stijfheid van het hart kan worden getest door te knijpen met tangen om de mate van spijsvertering te beoordelen. Na incubatie met collagenase, moeten harten minder stijf en gemakkelijk uit elkaar te scheuren. Andere soorten collagenase kunnen ook worden gebruikt. In een eerder rapport werd een combinatie van collagenases B en D14gebruikt.
Bovendien zijn wij van mening dat dit protocol kan worden gebruikt om het totale aantal cardiomyocyten in het hart te beoordelen15. Echter, als het doel is om te verkrijgen en kwantificeren alle cardiomyocyten uit het hart, is het belangrijk om de harten uit te broeden voor langere tijd in de collagenase oplossing (bijvoorbeeld 3-7 dagen), waar de collagenase oplossing moet worden aangevuld een keer per dag. Dit minimaliseert inconsistenties in isolatie-efficiëntie door het elimineren van de impact van de mate van trituratie op cardiomyocyte opbrengst.
Het gebruik van DNA-inhoud om truc te meten is niet nieuw, en is gebruikt in flow cytometrie voor decennia. Onlangs werd aangetoond dat microscopie op dezelfde manier kan worden gebruikt om het DNA-gehalte per kern16te schatten. Hier hebben we deze strategie geïmplementeerd om de ploidie van cardiomyocyte kernen te meten, als een surrogaat voor nieuw gevormde cardiomyocyten. Het dogma op het gebied van hartregeneratie is dat alleen mononucleated, diploïde cardiomyocyten cytokinese kunnen ondergaan en aanleiding kunnen geven tot nieuwe cardiomyocyten. Aangezien het zeer uitdagend is om nieuwe cardiomyocytevorming in vivo te meten, isoleert cardiomyocyten die na toediening van een analoog DNA nucleotide zijn achtervolgd en het bepalen van het niveau van mononucleated, diploïde cardiomyocyten als benadering van het vermogen van het hart om nieuwe cardiomyocyten17te produceren . Hier bieden we een macro voor ImageJ die het mogelijk maakt gemakkelijk kwantificering van cardiomyocyte ploidy. Op zijn minimum moeten 500 kernen worden gemeten om een nauwkeurige schatting van de locatie van de G1-piek te bereiken. Als ervoor wordt gezorgd dat kleuring en beeldvorming consistent zijn in elke put van de afgebeelde plaat, hoeven slechts 500 kernen over het hele monster te worden afgebeeld, anders moeten er 500 kernen per beeldgroep18,19zijn . Beperkingen van beeldvorming-gebaseerde meting van nucleatie en ploidy omvatten moeite om kernen te onderscheiden van aanhangende cellen van de werkelijke cardiomyocyte kernen, bij het gebruik van tweedimensionale beelden. Dergelijke aanhangende cellen kunnen leiden tot overschatting van de hoeveelheid multinucleated cellen en de nauwkeurigheid van metingen van de tetraploïde cardiomyocyte kernpopulatie verminderen. Een mogelijke strategie om dit probleem op te lossen zou zijn om de cardiomyocyte nucleaire marker PCM16,20te gebruiken . We hebben echter problemen gehad om betrouwbare PCM1-vlekken op goed vaste cellen of weefsels te verkrijgen.
Een andere potentiële beperking is dat sommige nucleaire vlek beelden kunnen aanzienlijke achtergrond cytoplasmatische kleuring hebben, het voorkomen van een goede thresholding met behulp van Fiji's ingebouwde methoden zonder uitgebreide voorbewerking. Bovendien vermindert de onregelmatige bijdrage van deze achtergrond fluorescentie in ploidyramen hun nauwkeurigheid. Bovendien, als de cellen niet langer in DNA-kleuringsoplossing achterblijven, zal de fluorescerende kleurstof zich niet binden aan verzadiging binnen de kernen en zal de veronderstelling van een lineaire relatie tussen nucleaire geïntegreerde intensiteit en DNA-gehalte niet langer nauwkeurig zijn.
Opgemerkt moet worden dat de software cardiomyocyte clusters niet kan segmenteren en ze in plaats daarvan uit de analyse verwijdert. Daarom is het van cruciaal belang om cardiomyocyten te zaaien met een relatief lage dichtheid (bijvoorbeeld 1000 cellen/cm2). Verder kan de software geen onderscheid maken tussen twee cardiomyocyten die end-to-end en lange, enkelvoud cardiomyocyten op een rij zetten. Dit soort clusters kunnen ten onrechte multinucleatie schattingen opblazen.
Hoewel de beschreven methode het niet mogelijk maakt om levensvatbare cardiomyocyten te verkrijgen en dus niet kan worden gebruikt om dynamische cellulaire processen te meten, zijn wij van mening dat de beschreven methode superieur is aan bestaande protocollen met hogere opbrengsten van cardiomyocyten en een betere kwaliteit in termen van morfologie en eiwitlokalisatie. Ten slotte kan de beschreven methode worden gebruikt om cardiomyocyten te isoleren van klinische monsters14,21. Wij geloven dat de beschreven methodologie verschillende onderzoekers kan helpen om cardiomyocyten van hoge kwaliteit te verkrijgen en nucleatie en ploidy te meten als surrogaten voor nieuwe cardiomyocytevorming.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
JHvB wordt ondersteund door subsidies van de NIH, Regeneratieve Geneeskunde Minnesota, en een individuele Biomedical Research Award van The Hartwell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
