다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

요약

여기에 설명된 것은 각진 관상 접근 법을 사용하여 도전적이고 도달하기 어려운 뇌 영역(공간 제한으로 인해)을 표적으로 할 수 있는 입체적 절차입니다. 이 프로토콜은 마우스와 쥐 모델에 모두 적응할 수 있으며, 바이러스 구조의 캐뉼라 이식 및 미세 주입을 포함하여 다양한 신경 과학 응용 분야에 적용 될 수있다.

초록

입체 수술은 현대 신경 과학 실험실에서 필수적인 도구입니다. 그러나 도달하기 어려운 뇌 영역을 정확하고 정확하게 표적으로 삼는 능력은 여전히 어려움을 겪고 있으며, 특히 미드라인을 따라 뇌 구조를 대상으로 할 때 더욱 그렇다. 이 도전은 우수한 처상 부비동과 세 번째 심실의 피하고 일관되게 선택적이고 이산적인 두뇌 핵을 표적으로 하는 기능을 포함합니다. 또한, 보다 진보된 신경과학 기술(예를 들어, 광유전학, 광섬유 광측정, 2광화상)은 뇌에 중요한 하드웨어의 표적 이식에 의존하고 있으며, 공간적 한계는 일반적인 장애물이다. 여기에 제시된 각진 관상 접근 방식을 사용하여 설치류 뇌 구조물의 입체 적 표적을 위한 수정 가능한 프로토콜이 있습니다. 그것은 1) 마우스 또는 쥐 모델, 2) 다양한 신경 과학 기술, 및 3) 여러 뇌 영역에 적응 할 수있다. 대표적인 예로, 광유전학억제실험을 위한 마우스 시상하부 환원핵(VMN)의 표적화를 위한 스테레오전술 좌표의 계산을 포함한다. 이 절차는 광에 민감한 염화물 채널(SwiChR+++)을 크레의존 마우스 모델에 인코딩한 아데노 관련 바이러스(AAV)의 양자 간 미세 주입으로 시작하여 광섬유 캐뉼라의 각진 양자 이식이 뒤따릅니다. 이 접근법을 사용하여, 사실 인정은 인슐린 유도한 저혈당에 대한 포도당 반규제 반응을 위해 VMN 뉴런의 서브세트의 활성화가 필요하다는 것을 보여줍니다.

서론

행동, 먹이 주기 및 신진 대사의 신경 제어는 매우 복잡 한의 조정을 포함, 통합, 그리고 중복 신경 회로. 신경 과학 분야의 운전 목표는 신경 회로 구조와 기능 사이의 관계를 해부하는 것입니다. 고전적인 신경 과학 도구 (즉, 병변, 국소 약리학적 주사 및 전기 자극)는 행동과 신진 대사를 제어하는 특정 뇌 영역의 역할에 관한 중요한 지식을 발견했지만, 이러한 도구는 특이성과 가역성의 부족에 의해 제한됩니다^1.

신경 과학 분야의 최근 발전은 높은 현시성 해상도를 가진 세포 형 특정 방식으로 회로 기능을 심문하고 조작하는 능력을 크게 향상했습니다. 변성² 및 화학 유전학³ 접근은, 예를 들면, 자유롭게 움직이는 동물의 유전으로 정의된 세포 모형에 있는 활동의 급속하고 가역적인 조작을 허용합니다. 광유전학은 신경 활동을 통제하기 위하여, 관상자극증이라고 칭한 광과민이온 채널의 사용을 관련시킵니다. 이 기술의 핵심은 채널로독신의 유전자 전달과 opsin을 활성화하는 빛의 원천입니다. 유전자 전달을 위한 일반적인 전략은 1) 유전자 조작 마우스의 조합을 통해 이산 뉴런에서 Cre-recombinase를 발현하고, 2) 채....

프로토콜

모든 절차는 국립 보건원, 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 승인되었으며 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 환경 보건 및 안전 모두에 의해 승인되었습니다.

1. 각진 좌표 계산

1. 관상 동맥을 사용하여, hypotenuse가 관심의 대상 영역을 통과 할 수 있도록 오른쪽 삼각형을 표시합니다. 대표적인 예에서(도 1),시상하심 심근핵(VMN)은 관상 동맥 중음부로부터 15° 각도를 표적으로 한다.
   참고: 도 1(따라서 측면 C의 길이)에 묘사된 회전 축의 배치는 임의적이며 임의의 뇌 영역을 대상으로 수정할 수 있습니다. 직관적이지 않은 것처럼 보일 수 있지만 프로토콜의 이후 단계는 이 점이 회전의 입체 중심과 정렬될 수 있도록 z축에서 헤드의 위치를 조정합니다(섹션 6 참조). 그러나 헤드 홀더 장치의 물리적 제약으로 인해 15°의 관상 회전 각도를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
2. 원하는 각도(a) 및 측면 B의 추정 길이를 설정하고 삼각방법을 사용하여 측면 A 및 C의 길이를 계산합니다. 이 단계는 회전 중에 헤드를 올바르게 배치하는 데 중요합니다.
   참고:

결과

이 프로토콜은 혈당 조절^9에서시상 하 부 VMN 뉴런의 역할을 심문하기 위한 광유전학 연구를 수행하기위한 외과 적 절차를 설명합니다. 먼저 활용된 것은 VMN에 대한 억제 채널로도신 바이러스의 양자 미세 주입을 위한 표준(비각각) 입체적 접근법이었다. 각진 접근법도 적합하지만, 관심 있는 뇌 영역을 대상으로 하기에 충분하고 쉽고 신뢰할 수 있고 일관된 접근 방식이기 때문에 표준(비각각) 접근법이 선택되었습니다. 그러나, VMN이 중공선에 근접한 점을 감안할 때, 공간 제약은 양측 광섬유의 비각각 이식을 허용하지 않았고, 광섬유를 각도로 정확하게 이식하기 위한 외과 전략의 개발이 필요하였다(그림6).

이 외과 전략을 사용하여, 우리는 "SwiChR ++" 바이러스^10이라고칭한 변형된 채널로 도프신 애니온 전도 채널을 표현하는 Cre 의존AAV를.......

토론

신경 과학의 최근 발전은 뇌 신경 회로의 활동과 기능에 대한 고급 통찰력과 이해를 지원했습니다. 이것은 생체 내의 이산 신경 인구 및 그들의 투영 사이트를 활성화하거나 침묵하기 위하여 optogenetic 및 화학 유전학 기술의 응용을 포함합니다. 최근에는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(예를 들어, GCaMP, RCaMP) 및 기타 불소 측정 생체 센서(예: 도파민, 노르에피네프린)의 개발을 포함하고 있으며, 자유롭게 움직이는 동물의 정의된 세포 유형에서 신경 활성을 생체 내에서 기록하는 데 포함되어 있다. 그러나 이러한 기술의 효과적인 고용은 관심 영역을 대상으로 성공적인 입체 수술에 의존합니다. 많은 두뇌 지구를 표적으로 하는 데 적합한 이러한 방법을 설명하는 몇몇 확립된 프로토콜이 있는 동안, 중간선을 따라 깊은 두뇌 지구를 표적으로 하는 것은 중요한 추가 도전을 나타냅니다. 여기에 입증 각도 입체 접근 방식을 통해 이산 뇌 영역을 대상으로 상세한 수술 기술입니다. 중요한 것은, 이 기술은 적응하고 신경 과학 기술의 다양한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
광섬유 캐뉼라	Doric 렌즈	MFC_200/230-0.57_#_MF1.25_FLT	사용자 정의
가능한 Kopf 모델 1900 입체 정렬 시스템	Kopf	모델 1900
Kopf 모델 1900-51 중심 높이 게이지	Kopf	모델 1900-51
Kopf 모델 1905 정렬 표시기	Kopf	모델 1905
Kopf 모델 1911 입체 드릴	Kopf	모델 1911
Kopf 모델 1915 센터링 스코프	Kopf	모델 1915
Kopf 모델 1922 60도 비파열 이어바	Kopf	모델 1922
Kopf 모델 1923-B 마우스 가스 마취 헤드 홀더	Kopf	모델 1923-B
Kopf 모델 1940 마이크로 매니퓰레이터	Kopf	모델 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
마우스 뼈 나사	플라스틱 1개	00-96 X 1/16
입체식 캐뉼라 홀더, 1.25mm 페룰	Thor Labs	XCL
수술용 드릴	셀 포인트 과학적	이상적인 마이크로 드릴