Summary
Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Herstellung von lebensfähigen präzisionsgeschnittenen Leberscheiben von Mäusen. Die Ex-vivo-Gewebeproben können mehrere Tage lang unter Labor-Gewebekulturbedingungen aufbewahrt werden, was ein flexibles Modell zur Untersuchung der Leberpathobiologie bietet.
Abstract
Das Verständnis der Mechanismen von Leberschäden, Leberfibrose und Zirrhose, die chronischen Lebererkrankungen zugrunde liegen (d. h. virale Hepatitis, nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen und Leberkrebs) erfordert eine experimentelle Manipulation von Tiermodelle und In-vitro-Zellkulturen. Beide Techniken haben Einschränkungen, wie z. B. die Anforderung einer großen Anzahl von Tieren für in vivo-Manipulation. In-vitro-Zellkulturen reproduzieren jedoch nicht die Struktur und Funktion der multizellulären Leberumgebung. Die Verwendung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben ist eine Technik, bei der einheitliche Scheiben lebensfähiger Mausleber in der Laborgewebekultur für experimentelle Manipulationen gepflegt werden. Diese Technik nimmt eine experimentelle Nische ein, die zwischen Tierstudien und In-vitro-Zellkulturmethoden besteht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode, um präzisionsgeschnittene Leberscheiben von Mäusen zu isolieren und zu kultiieren. Als Anwendung dieser Technik werden ex vivo Leberscheiben mit Gallensäuren behandelt, um cholestatische Leberverletzungen zu simulieren und schließlich die Mechanismen der Leberfibrogenese zu bewerten.
Introduction
Die Pathogenese der meisten chronischen Lebererkrankungen (d.h. Viralhepatitis, nichtalkoholische Steatohepatitis, cholestatische Leberverletzung und Leberkrebs) beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen mehreren verschiedenen Leberzelltypen, die Entzündungen, Fibrogenese und Krebsentwicklung antreiben1,2. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesen chronischen Lebererkrankungen zugrunde liegen, müssen die Wechselwirkungen zwischen mehreren Leberzelltypen untersucht werden. Während mehrere Leberzelllinien (und in jüngerer Zeit, Organoide) in vitro kultiviert werden können, emulieren diese Modelle nicht genau die komplexe Struktur, Funktion und zelluläre Vielfalt der leberförmigen Mikroumgebung3. Darüber hinaus können kultivierte Leberzellen (insbesondere transformierte Zelllinien) von ihrer ursprünglichen Quellbiologie abweichen. Tiermodelle werden experimentell verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen mehreren Leberzelltypen zu untersuchen. Sie können jedoch aufgrund signifikanter Off-Target-Effekte in extrahepatischen Organen (z. B. bei der Erprobung potenzieller Therapeutika) in der Ergreifung simontierungsmittel signifikant reduziert werden.
Die Verwendung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben (PCLS) in der Gewebekultur ist eine experimentelle Technik, die zuerst in Arzneimittelstoffwechsel- und Toxizitätsstudien verwendet wird, und es beinhaltet das Schneiden lebensfähiger, ultradünner Leberscheiben (ca. 100 x 250 m dick). Dies ermöglicht die direkte experimentelle Manipulation von Lebergewebe ex vivo4. Die Technik überbrückt eine experimentelle Lücke zwischen in vivo Tierstudien und In-vitro-Zellkulturmethoden und überwindet viele Nachteile beider Methoden (d. h. praktische Grenzen des Versuchsspektrums, die bei ganzen Tieren durchgeführt werden können, sowie Verlust von Struktur/Funktion und zellulärer Vielfalt mit In-vitro-Zellkulturmethoden).
Darüber hinaus erhöht PCLS die Experimentelle Kapazität im Vergleich zu ganzen Tierstudien erheblich. Da eine Maus mehr als 48 Leberscheiben produzieren kann, erleichtert dies auch die Verwendung von Kontroll- und Behandlungsgruppen aus der gleichen Leber. Darüber hinaus trennt die Technik physisch das Lebergewebe von anderen Organsystemen; Daher entfernt es potenzielle Off-Target-Effekte, die bei ganzen Tieren auftreten können, wenn die Auswirkungen exogener Reize getestet werden.
In diesem Protokoll werden PCLS mit einem Vibratom mit einer seitlich vibrierenden Klinge erzeugt. Andere Studien haben erfolgreich einen Krumdieck-Gewebeschneider verwendet, wie in Olinga und Schuppan5beschrieben. Im Vibratom verhindert die seitliche Vibration der Klinge das Reißen des ultradünnen Gewebes, das durch Scherspannung verursacht wird, da die Klinge in das Gewebe geschoben wird. Sowohl der Vibratome als auch der Krumdieck-Gewebeschneider arbeiten effektiv ohne strukturelle Einbettung von Lebergewebe, was das Schneidverfahren rationalisiert. Diese Technik kann auch verwendet werden, um PCLS aus erkrankten Lebern zu erstellen, einschließlich derer von Mausmodellen der Fibrose/Zirrhose6 und der Hepatischen Steatose7.
Neben dem Nachweis der für die Präparation und Gewebekultur von PCLS erforderlichen Techniken untersucht dieser Bericht auch die Lebensfähigkeit dieser Ex-vivo-Gewebe, indem adenosintriphosphat (ATP)-Spiegel gemessen und die Gewebehistologie zur Beurteilung von Nekrose und Fibrose untersucht wird. Als repräsentatives experimentelles Verfahren werden PCLS mit pathophysiologischen Konzentrationen von drei verschiedenen Gallensäuren (Glyochkol-, Taurocholi- und Cholsäuren) behandelt, um cholestatische Leberverletzungen zu simulieren. Im Zusammenhang mit cholestatischen Leberverletzungen hat sich insbesondere bei Kindern mit mukovisenfibroseassoziierter Lebererkrankung8gezeigt, dass Taurocholsäure sowohl im Serum als auch bei der Galle signifikant erhöht ist.
Lebervorläuferzellen wurden auch in vitro mit Taurocholsäure behandelt, um die erhöhten Taurocholsäurespiegel bei Patienten zu simulieren, und diese Behandlung verursachte erhöhte Proliferation und Differenzierung von Lebervorläuferzellen in Richtung eines gallenhaltigen (Cholangiozyten) Phänotyps9. In der Folge wurden PCLS ex vivo mit erhöhten Stufen von Taurocholsäure behandelt, und erhöhte Cholangiozytenmarker wurden beobachtet. Dies unterstützt die In-vitro-Beobachtung, dass Taurocholsäure die Gallenproliferation und/oder Differenzierung im Zusammenhang mit der pädiatrischen Mukoviszidose-assoziierten Lebererkrankung9antreibt.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke am QIMR Berghofer Medical Research Institute mit Genehmigung der Instituts-Tierethikkommission durchgeführt. Männliche C57BL/6 Mäuse (15 bis 20 Wochen alt) wurden aus dem Animal Resources Centre, WA, Australien, gewonnen.
HINWEIS: Alle Lösungen, Medien, Instrumente, Hardware und Rohre, die mit den Proben in Berührung kommen, müssen mit einer 70 %-Ethanollösung sterilisiert oder gründlich desinfiziert und mit sterilen Techniken behandelt werden, um das Risiko einer Kulturkontamination zu minimieren.
1. Einrichtung des Vibrames
- Bereiten Sie sterile Krebs-Henseleit Pufferlösung mit 2 g/L Glukose(Materialtabelle). Überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Puffers 7,4 beträgt. Wenn der pH-Wert höher ist, sättigen Sie den Puffer mit Carbogen (95% O2 + 5%CO2) oder inkubieren Innerhalb eines 5% CO2-Gewebekultur-Inkubators, um das Bicarbonat-Puffersystem zu korrigieren.2 Kühlen Sie die versiegelte sterile Pufferlösung bei 4 °C.
- Setzen Sie die Vibratomklinge in den Schneidarm ein. Stellen Sie sicher, dass die Klinge fest am Schneidarm befestigt ist, da Vibrationen dazu führen können, dass sich die Klinge löst.
- Desinfizieren Sie die Klinge und den Schneidarm mit einer 70%igen Ethanollösung.
VORSICHT: Vermeiden Sie den Kontakt mit der Klinge. - Desinfizieren Sie die Pufferschale mit einer 70%igen Ethanollösung und wischen Sie sie mit einem sterilen Gewebe ab.
- Setzen Sie die Pufferschale in das Vibratome ein und ziehen Sie den Montagemechanismus fest.
- Stellen Sie den Schneidarm auf die maximal verfügbare Höhe ein.
- Stellen Sie den Klingenwinkel auf 10° unter der Horizontalen einstellung ein und abfallen nach unten zur Probe. Stellen Sie sicher, dass der Klingenwinkel fest fixiert ist.
HINWEIS: Der optimale Klingenwinkel kann je nach Vibratom-Modell und Gewebeeigenschaften variieren. - Desinfizieren Sie den Probenhalter mit einer 70%igen Ethanollösung.
- Schließen Sie das Kühlwasser für den thermoelektrischen Peltier-Kühler unter der Pufferwanne an.
HINWEIS: Einige Vibramme-Modelle verwenden stattdessen ein Eisbad zum Kühlen. - Befestigen Sie das Wasserrohr an einem Abfluss und schalten Sie das Wasser ein. Stellen Sie den Kühler auf 4 °C ein. Kühlwasser mit einer Geschwindigkeit von >400 ml/min laufen.
- Füllen Sie die Pufferschale fast bis zur Spitze mit sterilem eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer (mit 2 g/L Glukose). Lassen Sie zusätzliche Krebs-Henseleit Pufferlösung auf Eis.
2. Leberentfernung und -zubereitung
- Sterilisieren oder desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente, einschließlich gekrümmter Zangen, flacher Quadratspitzenzange, Pinzette, chirurgischen Klemmen und Scheren mit Autoklavieren.
- Vor der Leberentfernung, tief anästhesisieren Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin.
HINWEIS: Andere Anästhetika können verwendet werden, oder Mäuse2 können durch CO2-Erstickung/Zervixdislokation eingeschläfert werden, wenn die Leber schnell entfernt wird, um Hypoxie-induzierte Schäden zu verhindern. - Desinfizieren Sie Hautoberflächen an Mäusen, indem Sie mit einer 70%igen Ethanollösung benetzen. Sichere Mäuse auf dem Rücken mit allen Extremitäten, die an ein Sezierenbrett gepinnt sind.
- Machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt in die Haut von der Basis der Bauchhöhle bis knapp über dem Zwerchfell.
HINWEIS: Einschnitte in Richtung der Extremitäten werden gemacht, um das Zurückziehen der Haut zu erleichtern. - Ziehen Sie die Haut zurück, während Sie das Bindegewebe zwischen Haut und Bauchhöhle schneiden. Verhindern Sie, dass Haare so weit wie möglich in die Bauchhöhle übertragen werden. Pin oder klemmen Sie die Haut weg von der Bauchhöhle.
- Mit sauberen Zangen und Schere, öffnen Sie die Bauchhöhle und unteren Brusthöhle.
- Schnelles Entfernen der Leber ohne Beschädigung der Lappen
- Mit stumpfen Werkzeugen (z.B. flache Quadratspitzenzange) führen Sie die oberen Leberlappen nach unten in Richtung Bauch. Schneiden Sie das Bindegewebe um die oberen Leberlappen mit einer Schere.
- Führen Sie die Leberlappen nach oben zum Zwerchfell. Halten Sie das zentrale Gefäßbündel der Leber mit Zange.
HINWEIS: Es hat keinen Einfluss auf das Verfahren, wenn das zentrale Gefäßbündel beschädigt ist. - Ziehen Sie das zentrale Gefäßbündel von der Maus weg und schneiden Sie das verbleibende Bindegewebe, Blutgefäße, etc., um die Leber zu entfernen. Achten Sie darauf, nicht 1) die Leberlappen zu beschädigen und 2) in den Magen-Darm-Trakt geschnitten, da dies die Leber mit Mikroorganismen kontaminieren kann.
- Die entfernte Leber in eine sterile 10 cm Gewebekulturschale halbgefüllt mit eiskalter Krebs-Henseleit-Pufferlösung geben. Mit einem stumpfen Instrument, um die Lappen zu führen, schneiden Sie die Mitte der Leber, um es in separate Lappen zu teilen.
- Wählen Sie einen Leberlappen (verwenden Sie den größten zuerst), und legen Sie ihn flach auf eine neue sterile 10 cm Schale. Alle anderen Leberlappen in der Schale der Krebs-Henseleit Pufferlösung auf Eis für die nachträgliche Verwendung gelagert.
- Schneiden Sie etwa 10% des Materials von der höchsten Kante des Leberlappens, während Sie flach liegen.
HINWEIS: Trimmen ist wichtig, da diese Gewebekante zuerst mit der Schneidklinge in Kontakt kommt; Daher verhindert eine Gewebekante, die relativ senkrecht zum Schneidmesser ist, eine Gewebekompression, die aufgrund flacher Winkel in den ungeschnittenen Leberlappen auftreten kann. - Trimmen Sie die anderen drei Gewebekanten.
HINWEIS: Dadurch wird ein Teil der faserigen Glisson-Kapsel entfernt und die Trennung der Gewebescheiben wird erleichtert. - Montage des Leberlappens auf dem Probenhalter
- Legen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber (Superkleber oder medizinisch/veterinärmedizinischer Cyanoacrylatkleber) auf den Probenhalter nach vorne, etwas größer als der getrimmte Leberlappen.
HINWEIS: Prüfen Sie, ob der Cyanoacrylatkleber keine Nicht-Cyanoacrylat-Zusätze enthält. - Nehmen Sie den Leberlappen vorsichtig mit sterilen Zangen mit einer Ecke weg von der Schneide auf, dann klopfen Sie jeden Restpuffer von der flachen Seite des Leberlappens mit sterilem absorbierendem Material trocken.
- Legen Sie die große flache Seite des Leberlappens auf den Cyanoacrylat-Kleber-Patch mit der größten Kante nach vorne. Lassen Sie es in der Luft für 1 x 2 min aushärten.
HINWEIS: Cyanoacrylat-Klebstoffe härten schnell (ca. 2 min) als Reaktion auf Restfeuchte und Gewebeproteine aus und werden das Gewebe fest am Probenhalter befestigen.
- Legen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber (Superkleber oder medizinisch/veterinärmedizinischer Cyanoacrylatkleber) auf den Probenhalter nach vorne, etwas größer als der getrimmte Leberlappen.
3. Herstellung von Leberscheiben
- Legen Sie den Probenhalter mit dem beigefügten Leberlappen in die Vibram-Pufferschale. Stellen Sie sicher, dass der Leberlappen vollständig durch Puffer abgedeckt ist.
HINWEIS: Bei Bedarf die eiskalte Krebs-Henseleit-Pufferlösung aufladen. Wenn die Pufferebene den Schneidvorgang verdeckt, erhöhen oder verringern Sie den Pegel. - Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit ein.
HINWEIS: Dies muss möglicherweise empirisch bestimmt werden, abhängig vom Vibratommodell und den Klingeneigenschaften. Verwenden Sie als Startanleitung eine Geschwindigkeit von 57 Hz/3.420 Rpm. Die Vibratome-Geschwindigkeit kann mit einer Audio-Spektrum-Analysator-Anwendung auf einem Smartphone gemessen werden. - Senken Sie die Schneidklinge, bis sie sich mit dem Höhenzifferblatt direkt über dem Leberlappen befindet. Führen Sie den vibrierenden Schneidarm über die Probe.
- Geben Sie die Klinge mit dem Kurbelgriff rückwärts zurück. Aktivieren Sie die Vibrationen, während Sie die Klinge zurückgeben. Nachdem die Klinge zurückgegeben wurde und sich nicht über der Probe befindet, senken Sie die Klingenhöhe um 250 m.
- Wiederholen Sie den Schneidvorgang, bis die Oberseite des Gewebes entfernt ist. Entsorgen Sie die ersten ein oder zwei Scheiben, da diese Glissons Kapsel enthalten und daher im Vergleich zu anderen Scheiben nicht viel funktionelles Lebergewebe enthalten.
- Um Leberscheiben zu schneiden, schieben Sie langsam die vibrierende Klinge in das Gewebe, indem Sie den Griff drehen. Verwenden Sie einen kleinen Pinsel (mit einer 70% Ethanollösung desinfiziert), um das Gewebe während des Schneidprozesses sanft zu leiten.
- Mit dem Pinsel die geschnittenen Gewebescheiben heben und die Gewebescheibe in eine sterile Röhre eiskalten Krebs-Henseleit-Puffers legen. Wenn nicht in Gebrauch, halten Sie diese Röhre auf Eis zwischen den Scheiben.
HINWEIS: Manchmal reißt das Gewebe während des Schneidprozesses, aber für die meisten Zwecke ist das Gewebe noch nutzbar. - Wiederholen Sie den Schneidprozess, bis die Basis des Leberlappens erreicht ist. Entsorgen Sie alle Leberscheiben, die sichtbaren gehärteten Kleber haben.
HINWEIS: Der ausgehärtete Kleber ist als weißer Bereich auf den Gewebescheiben sichtbar. Ein typischer Leberlappen hat nur eine gebrauchsfähige Dicke von ca. 2 mm. Daher werden aus jedem Lappen nur etwa acht 250-m-Leberscheiben hergestellt. - Schneiden Sie die Gewebescheiben bis in die Nähe des Cyanoacrylatklebers. Nicht in den Kleber schneiden.
- Wiederholen Sie den gesamten Prozess mit anderen Leberlappen, bis die erforderliche Anzahl von Gewebescheiben erhalten ist.
- Um den ausgehärteten Cyanoacrylatkleber und das Gewebe vom Probenhalter zu reinigen, verwenden Sie entweder eine Klinge, um das ausgehärtete Leim-Gewebe-Gemisch abzukratzen, oder erweichen und reinigen Sie die Mischung mit Aceton oder Dimethylsulfoxid.
4. Gewebekultur
HINWEIS: Alle Gewebekulturarbeiten müssen in einer sterilen laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden.
- In einer Gewebekultur laminare Nließhaube, Pipette 1 ml von Williams E Medium enthält 2,0 g/L Glukose, 10% fetales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin Ergänzung, 100 U/ml Penicillin, und 100 g/ml Streptomycin in 12 Brunnengewebe Kulturplatten.
HINWEIS: Es können auch andere Antibiotika und Antimykotika zugesetzt werden. Einige Studien haben Additive im Gewebeinkubationsmedium (d. h. Dexamethason und Insulin10) verwendet, aber diese können die Zellsignalisierung stören. - Legen Sie die Tube mit Leberscheiben aus Eis in die Gewebekulturhaube. Um die Gewebescheiben zu entfernen, wirbeln Sie die Mischung vorsichtig und kippen Sie vorsichtig in eine sterile 10 cm Schale, während Sie wirbeln.
- Mit sterilen Scharfpunktzangen und einem Skalpell die Gewebescheiben in etwa gleichmäßige Größen schneiden (z.B. 15 mm2).
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um eine konsistente Oberfläche zu gewährleisten. Da Mausleberlappen in der Größe deutlich unterschiedlich sind und einige Gewebescheiben reißen, wird dies eine Reihe von PCLS mit unterschiedlichen Oberflächen produzieren. Die endgültigen Flächengrößen des PCLS hängen davon ab, wie viel Material in nachfolgenden Analyseanwendungen benötigt wird und wie viele Replikationen benötigt werden. Das Schneiden großer PCLS in kleinere Mehrere Teile der gleichen ungefähren Größe ermöglicht von Natur aus eine erhöhte Anzahl experimenteller Replikationen. - Mit sterilen Zangen oder einem kleinen Pinsel die geschnittenen Gewebescheiben in die Brunnen einer 12 Brunnenplatte mit 1 ml Medium übertragen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Konsistenz der Dicke und Form von Gewebescheiben zu bestätigen. Abschnitte, die dunkler als der Durchschnitt sind, deuten darauf hin, dass die Gewebedicke größer ist und verworfen werden muss. Leichtere Scheiben deuten auf das Vorhandensein von gehärtetem Cyanoacrylatkleber hin und müssen entsorgt werden. - Die Leberscheiben bei 37 °C und 5%CO2 unter 95% Luftfeuchtigkeit inkubieren.
HINWEIS: Andere Gruppen haben Methoden verwendet, um die Sauerstoffzufuhr zu PCLS zu verbessern, die die Überlebenszeit des Gewebes zu verlängern scheinen6,10,11,12,13 (siehe Diskussionsabschnitt). - Ändern Sie am nächsten Tag das Kulturmedium mit einer manuellen Pipette (anstelle von Saugvorrichtungen), um den Gewebeverlust durch Saugfehler zu verhindern. Anschließend wechseln Sie das Medium auf dem PCLS täglich. Die PCLS sind nun für den experimentellen Einsatz bereit.
5. Beispielanwendung von PCLS
- Nach der Generation 16 h pcLS mit drei verschiedenen Gallensäuren behandeln: Glyocholsäure (GCA), Taurocholsäure (TCA) und Cholsäure (CA) (als Natriumsalze, alle in einer Konzentration von 150 m) für 2 Tage.
- Nach 2 Tagen Gallensäurebehandlung mRNA extrahieren, indem Sie Gewebescheiben in eiskalten RNA-Lysepuffer legen und schnell mit Perlen mit einem Perlenhomogenisator(Materialtabelle)homogenisieren.
- Reinigen Sie die RNA mit einem RNA-Isolationskit (Table of Materials) und erstellen Sie cDNA aus der gereinigten RNA.
- Führen Sie die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Materialtabelle) mit spezifischen Primern (Tabelle 1) auf der cDNA durch, um die Genexpression zu untersuchen.
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Representative Results
Um die Zelllebensfähigkeit von PCLS im Laufe der Zeit zu bestimmen, wurden die ATP-Gewebespiegel des Gewebes gemessen. ATP-Werte sind in der Regel proportional zur Rentabilität. PCLS (ca. 15 mm2 im Bereich) wurden im normalen William es E Medium mit 10% FBS kultiviert, dann wurden zu bestimmten Zeitpunkten Leberscheiben aus der Gewebekultur entfernt und mit ATP- und Proteinkonzentrationen (zur Normalisierung) homogenisiert (Materialtabelle) gemessen (Abbildung 1A). Für biochemische Assays wie diese ist die Normalisierung wichtig, da die geschnittenen Leberscheiben in den Dimensionen nicht unbedingt identisch sind. Die ATP-Spiegel (bezogen auf das Protein) wurden unmittelbar nach der Isolation und nach 1 h (Abbildung 1A) unterdrückt, was auf kurzfristigen metabolischen Stress durch die Kühl- und Schneidverfahren hindeutet. Jedoch, ATP-Spiegel erholt um 3 h. ATP-Spiegel blieb erhöht bei bis zu 5 Tagen gewebekultur, was auf keine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit. Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung von Leberscheiben deutete darauf hin, dass begrenzte Gewebenekrose (gekennzeichnet durch Kernpleomorphismus) trat in der Kultur von etwa Tagen 2 und 3. Die Konzentrationen der Gewebenekrose stiegen bis zum Tag 5 (Abbildung 1B). Unter Berücksichtigung dieser morphologischen Daten, zusammen mit den ATP-Ergebnissen, wird empfohlen, dieses experimentelle Gewebemodell für bis zu 3 Tage zu verwenden.
PCLS zeigte auch eine zunehmende Kollagenakkumulation zu späteren Kulturzeitpunkten, wie die Verdickung von Picro-sirius rot gefärbten Kollagenfasern an Tag 5 zeigt (Abbildung 2). Diese Verdickung von Kollagenfasern deutet darauf hin, dass spontane fibrogene Prozesse in PCLS aktiv sind, die mit dieser Methode erhalten werden. Dieser Prozess erscheint unabhängig von der PCLS-Isolationsmethodik mit der Verdickung der Kollagenfasern6 und der profibrogenen Genexpression14, die sowohl aus Vibratome als auch aus Krumdieck-Gewebeschneidern im Laufe der Zeit auftreten. Die Entwicklung dieser spontanen fibrogenen Prozesse muss bei der Interpretation der PCLS-Biologie berücksichtigt werden, insbesondere bei Experimenten im Zusammenhang mit fibrotischen Prozessen.
Wir haben zuvor die signifikante Induktion von Cholangioyt-spezifischem Genconnexin 43 (Cx43) und Sekretion von Glutamyltranspeptidase (Ggt1) Protein durch TCA in PCLS9gezeigt. Die Expression von cholangioytenspezifischen Genen im Verhältnis zu Haushaltskontrollen (Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase [Gapdh] und Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1 [Hprt1]) in PCLS, die mit TCA, GCA oder CA behandelt wurden, wurden von qPCR mit spezifischen Primern untersucht. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht, eine signifikante Induktion in der Expression der Cholangiozyten-spezifischen Gene Cytokeratin 19 (CK19; Abbildung 3A) und Connexin 43 (Cx43; Abbildung 3B) wurden sowohl von GCA als auch von TCA beobachtet. Die Ggt1-Expression wurde durch beide Gallensäuren erhöht; Obwohl dies keine statistische Signifikanz erreichte, möglicherweise aufgrund experimenteller Variationen (Abbildung 3C). Die Expression von CA wurde von keiner Gallensäure beeinflusst. Die Induktion von cholangioytenspezifischen Genen legt nahe, dass GCA auch an cholestatischen Leberverletzungen beteiligt sein kann, wie zuvor für TCA8,9berichtet.
Abbildung 1: Gewebelebensfähigkeit von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben (PCLS). (A) ATP- und Proteinspiegel in PCLS wurden sofort (T + 0) und bei 1 h, 3 h, 6 h und 1-5 Tagen nach der Isolation gemessen. (B) Um die Zellmorphologie zu untersuchen, wurden PCLS fixiert, paraffin-eingebettet, geschnitten und sofort mit H&E (Tag 0) und bei 1, 2 und 5 Tagen nach der Isolierung gefärbt. Ein Kruskal-Wallis-Test mit Dunns mehrfachem Vergleichstest wurde relativ zu T + 0 durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert -SEM (n = 2-3-Mäuse) mit *p < 0,05 dargestellt. Die Skalenbalken stellen 100 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der Kollagenablagerung in PCLS. PCLS wurden fixiert, paraffin-eingebettet, geschnitten und mit Picro-Sirius Red gefärbt, um Kollagenfasern an den Tagen 0, 1, 2 und 5 nach der Isolation zu visualisieren. Die Skalenbalken repräsentieren 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gallensäuren induzieren cholangioytspezifische Genexpression. Bei 16 h nach der Isolierung wurde das Medium auf PCLS verändert, und es wurde ein neues Medium zusammen mit 150 M Glyochkol (GCA), taurocholic (TCA) oder cholischen (CA) Säuren (Natriumsalze) hinzugefügt. PCLS wurden nach 2 Tagen geerntet, und die Expression von Cytokeratin 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B) und die Glutamyltranspeptidase 1 (Ggt1; C) wurde relativ zum geometrischen Mittelwert von Gapdh und Hprt1untersucht. Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurde relativ zu unbehandelten Kontrollgewebescheiben (n = 15) durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert dargestellt (n = 4 Mäuse, dreifache Scheiben; *p < 0,05, **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: qPCR-Primer.
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Discussion
Das Protokoll demonstriert die Anwendung der murinen PCLS-Isolierung und Gewebekultur, und die Verfahren sind entworfen, um sowohl die Lebensfähigkeit und nützlich zu bewerten sowie die Auswirkungen von exogenen Mediatoren der Leberpathobiologie mit biochemischen Assays, Histologie und qPCR zu untersuchen. Der experimentelle Nutzen der PCLS-Gewebekultur bei Nagetieren und Menschen wurde in einer Vielzahl von Anwendungen nachgewiesen, einschließlich experimenteller Untersuchungen in microRNA15/RNA9/Proteinexpression16, Stoffwechsel17, Viralinfektionsdynamik10,18, Infektionssignalisierung19, Tumorinvasion12, Toxizitätsstudien4,13,15,20, DNA-Schäden Studien21, Zellbiologie14, und Sekretionsstudien9.
Während ATP-Spiegel die zelluläre Lebensfähigkeit in PCLS bis zu 5 Tage in der Kultur angeben, deuten H&E-Färbung darauf hin, dass schwere Nekrose durch 5 Tage in der Kultur aufgetreten ist. Der Hauptfaktor, der die Lebensfähigkeit von PCLS zu begrenzen scheint, ist die Sauerstoffverfügbarkeit6,11. Mehrere Studien haben eine verbesserte Sauerstoffverfügbarkeit und folglich die Lebensfähigkeitszeit von PCLS in der Gewebekultur erhöht. Methoden zur Erhöhung der Sauerstoffverfügbarkeit umfassen die Inkubation von Gewebe in sauerstoffreichen Atmosphären10,11, Verwendung der Sauerstoffträgerperfusion Perfluorodecalin12, Schütteln / Rollen der Kultur während der Inkubation6,10,13, und GewebekulturPlatten entwickelt, um die Sauerstoffversorgung zu maximieren6.
Kürzlich wurde ein innovatives Luft-Flüssig-Schnittstellen-Gewebekultursystem mit funktionellem Nutzen beschrieben, der länger als 7 Tage in Kultur14angegeben wurde. Dieses Protokoll verwendet Luftsauerstoff in der Atmosphäre in einem normalen Gewebekultur-Inkubator. Die Methode ermöglicht es PCLS, für Laboratorien zugänglich zu sein, die nicht über hochspezialisierte, kundenspezifische Geräte verfügen, um die Sauerstoffzufuhr sicher zu verbessern. Jedoch, Wenn solche Methoden zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr verfügbar sind, Sie können langfristige PCLS-Lebensfähigkeit in der Kultur zu verbessern.
Die Anhäufung von Kollagen in PCLS nach Tag 3 in der Kultur legt nahe, dass spontane fibrogene Prozesse innerhalb dieses Modells aktiv sind. Spontane Fibrose wurde auch zuvor in PCLS6,14,22,23,24 beobachtet und wird möglicherweise durch schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) vermittelt, die durch den Schneidprozess oder Gewebenekrose freigesetzt werden. DAMPs fungieren als Signalmoleküle, die anschließend pro-fibrotische Signalwege aktivieren25,26. Darüber hinaus könnte die spontane Fibrose in PCLS durch Chemokine vermittelt werden, die durch die Aktivierung von stellaten Zellen und/oder Kupffer-Zellen freigesetzt werden (d. h. transformierende Wachstumsfaktor-Beta [TGF-B]). In diesem Zusammenhang legt ein kürzlich erschienener Artikel von Bigaeva et al.24 nahe, dass spontane Fibrose bei PCLS teilweise durch TGF--Signalisierung vermittelt wird, da die Inkubation von PCLS mit TGF-Hemmer Galunisertib Genexpressionsveränderungen im Zusammenhang mit spontaner Leberfibrose hemmte. Ein weiterer möglicher Mechanismus ist, dass das Slicing-Verfahren zunächst Zellproliferationssignalwege und das Eindringen von Hepatozyten in den Zellzyklus induziert; Dieser Mechanismus schlägt jedoch fehl und führt zu einem Zellzyklusstillstand in der Mitte der G1-Phase27. Zellzyklus-Arrest ist mit Leberfibrose statt Leberregeneration verbunden28.
Im repräsentativen experimentellen Verfahren werden PCLS 2 Tage lang mit drei verschiedenen Gallensäuren (GCA, TCA und CA) behandelt, um cholestatische Leberverletzungen zu simulieren. Zwei der Gallensäuren (GCA und TCA) induzieren signifikante Expression von CK19 und Cx43, die Gene mit Cholangiozytenfunktion assoziiert sind. Dies deutet auf die Ausdehnung oder Differenzierung von Zellen zu einer Cholangiozyten-Linie in PCLS mit diesen Gallensäuren behandelt. Dies steht im Einklang mit unserer früheren Arbeit, die einen ähnlichen Effekt mit TCA9 auf PCLS zeigt. Darüber hinaus stimmt es auch mit In-vivo-Beobachtungen überein, die zeigen, dass die Fütterung von Taurocholat an Ratten die Cholangiozytenzahlenerhöht 29. Die Behandlung von Lebergewebescheiben mit Gallensäuren simuliert Lebercholestase, und es wird spekuliert, dass die Zunahme der Expression von Genen, die mit der Cholangiozytenfunktion verbunden sind, ein Versuch des Lebergewebes ist, zusätzliche Gallendukulien zu schaffen, um die Gallensekretion zu erhöhen. Angesichts der spezifischen Induktion dieser Gene wird durch die konjugierten Gallensäuren (GCA und TCA) produziert, aber nicht die unkonjugierte CA, Es wird vermutet, dass diese Effekte durch den Sphingosin-1-Phosphatrezeptor 2, ein Zelloberflächenrezeptor mit bevorzugter Aktivierung durch konjugierte Gallensäuren30vermittelt werden.
Eine wesentliche Einschränkung der Anwendung von PCLS ist die individuelle Replikationsvariabilität. Da die Leber nicht homogen ist und es Variabilität in der Produktion gibt, neigen Leberscheiben dazu, eine größere biologische Variation als Zellkulturexperimente zu haben. In experimentellen Studien mit wenigen Variablen, wie dem oben gezeigten repräsentativen Verfahren, wird dies durch die Verwendung einer erhöhten Anzahl von Replikationen überwunden. Dies kann jedoch zu einem Problem für größere Screening-Studien werden. Zusammenfassend ist das beschriebene Protokoll eine einfache und zuverlässige Methode, um Aspekte der Leberpathobiologie ex vivo zu studieren, die nur wenig spezielle Ausrüstung mit Ausnahme des Vibratom erfordert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia (Grant No. APP1048740 und APP1142394 zu G.A.R.; APP1160323 bis J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm wird von einem Senior Research Fellowship des NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo wurde vom TALENTO-Programm von Madrid, Spanien (T1-BIO-1854) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
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