Summary
Este protocolo proporciona un método simple y confiable para la producción de rodajas de hígado de piedra de precisión viables de ratones. Las muestras de tejido ex vivo se pueden mantener bajo condiciones de cultivo de tejido de laboratorio durante varios días, proporcionando un modelo flexible para examinar la patobiología hepática.
Abstract
Comprender los mecanismos de lesión hepática, fibrosis hepática y cirrosis que subyacen a las enfermedades hepáticas crónicas (es decir, hepatitis viral, enfermedad hepática grasa no alcohólica, enfermedad hepática metabólica y cáncer de hígado) requiere la manipulación experimental de modelos animales y cultivos celulares in vitro. Ambas técnicas tienen limitaciones, como el requisito de un gran número de animales para la manipulación in vivo. Sin embargo, los cultivos celulares in vitro no reproducen la estructura y la función del entorno hepático multicelular. El uso de rodajas de hígado cortadas con precisión es una técnica en la que las rebanadas uniformes de hígado de ratón viable se mantienen en el cultivo de tejido de laboratorio para la manipulación experimental. Esta técnica ocupa un nicho experimental que existe entre los estudios en animales y los métodos de cultivo celular in vitro. El protocolo presentado describe un método sencillo y confiable para aislar y cultivar rebanadas de hígado cortadas con precisión de ratones. Como aplicación de esta técnica, las rodajas de hígado ex vivo se tratan con ácidos biliares para simular una lesión hepática colestásica y, en última instancia, evaluar los mecanismos de la fibrogénesis hepática.
Introduction
La patogénesis de la mayoría de las enfermedades hepáticas crónicas (es decir, hepatitis viral, esteatohepatitis no alcohólica, lesión hepática colestásica y cáncer de hígado) implica interacciones complejas entre múltiples tipos diferentes de células hepáticas que impulsan la inflamación, la fibrogénesis y el desarrollo del cáncer1,2. Para entender los mecanismos moleculares subyacentes a estas enfermedades crónicas basadas en el hígado, se deben investigar las interacciones entre múltiples tipos de células hepáticas. Mientras que múltiples líneas celulares hepáticas (y más recientemente, organoides) se pueden cultivar in vitro, estos modelos no emulan con precisión la compleja estructura, función y diversidad celular del microambiente hepático3. Además, las células hepáticas cultivadas (en particular, líneas celulares transformadas) pueden desviarse de su biología original de origen. Los modelos animales se utilizan experimentalmente para investigar las interacciones entre múltiples tipos de células hepáticas. Sin embargo, pueden reducirse significativamente en el alcance de la manipulación experimental, debido a efectos significativos fuera del objetivo en órganos extrahepáticos (por ejemplo, al probar posibles terapias).
El uso de rodajas de hígado cortadas con precisión (PCLS) en el cultivo de tejidos es una técnica experimental utilizada por primera vez en estudios de metabolismo y toxicidad de fármacos, e implica el corte de rodajas de hígado viables, ultradelgadas (alrededor de 100 a 250 m de espesor). Esto permite la manipulación experimental directa del tejido hepático ex vivo4. La técnica cierra una brecha experimental entre los estudios en animales in vivo y los métodos de cultivo celular in vitro, superando muchos inconvenientes de ambos métodos (es decir, límites prácticos en la gama de experimentos que se pueden realizar en animales enteros, así como la pérdida de estructura/función y diversidad celular con métodos de cultivo celular in vitro).
Además, PCLS aumenta enormemente la capacidad experimental en comparación con estudios en animales enteros. Como un ratón puede producir más de 48 rodajas de hígado, esto también facilita el uso de grupos de control y tratamiento desde el mismo hígado. Además, la técnica separa físicamente el tejido hepático de otros sistemas de órganos; por lo tanto, elimina los posibles efectos fuera del objetivo que pueden ocurrir en animales enteros al probar los efectos de los estímulos exógenos.
En este protocolo, pclS se generan utilizando un vibratome con una hoja vibratoria lateral. Otros estudios han utilizado con éxito una cortadora de tejido Krumdieck, como se describe en Olinga y Schuppan5. En el vibratome, la vibración lateral de la hoja evita el desgarro del tejido ultrafino causado por la tensión de cizallamiento, ya que la hoja se empuja hacia el tejido. Tanto el vibratomo como la cortadora de tejido Krumdieck funcionan eficazmente sin incrustación estructural de tejido hepático, lo que agiliza el procedimiento de corte. Esta técnica también se puede utilizar para crear PCLS a partir de hígados enfermos, incluidos los de modelos de ratón de fibrosis/cirrosis6 y esteatosis hepática7.
Además de demostrar las técnicas necesarias para la preparación y el cultivo de tejidos de PCLS, este informe también examina la viabilidad de estos tejidos ex vivo midiendo los niveles de trifosfato de adenosina (ATP) y examinando la histología de tejidos para evaluar la necrosis y la fibrosis. Como procedimiento experimental representativo, el PCLS se trata con concentraciones fisiopatológicas de tres ácidos biliares diferentes (ácidos glucódicos, taurocólicos y cólicos) para simular lesiones hepáticas colestásicas. En el contexto de una lesión hepática colestásica, el ácido taurocólico en particular ha demostrado aumentar significativamente tanto en el suero como en la bilis de los niños con enfermedad hepática asociada a la fibrosis quística8.
Las células progenitoras hepáticas también se han tratado in vitro con ácido taurocólico para simular los niveles elevados de ácido taurocólico observados en los pacientes, y este tratamiento causó una mayor proliferación y diferenciación de las células progenitoras hepáticas hacia un fenotipo biliar (cholangiocitos)9. Posteriormente, el PCLS se trató ex vivo con niveles elevados de ácido taurocólico, y se observaron un aumento de los marcadores de colangiocitos. Esto apoya la observación in vitro de que el ácido taurocólico impulsa la proliferación biliar y / o diferenciación en el contexto de la enfermedad hepática asociada a la fibrosis quística pediátrica9.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos en el Instituto de Investigación Médica QIMR Berghofer con la aprobación del comité de ética animal del instituto. Los ratones machocen C57BL/6 (15-20 semanas de edad) fueron obtenidos del Centro de Recursos Animales, WA, Australia.
NOTA: Todas las soluciones, medios, instrumentos, herrajes y tubos que entren en contacto con las muestras deben esterilizarse o desinfectarse a fondo con una solución de etanol del 70% y manipularse utilizando técnicas estériles para minimizar el riesgo de contaminación del cultivo.
1. Configuración del vibratome
- Preparar la solución tamón estéril Krebs-Henseleit con 2 g/L de glucosa(Tabla de materiales). Compruebe que el pH del búfer es 7.4. Si el pH es mayor, saturar el tampón con carboen (95% O2 + 5% CO2) o incubar dentro de una incubadora de cultivo de tejido deCO2 al 5% para corregir el sistema de amortiguación de bicarbonato. Refrigerar la solución tampón estéril sellada a 4 oC.
- Inserte la hoja vibratome en el brazo de corte. Asegúrese de que la hoja esté firmemente fijada al brazo de corte, ya que las vibraciones pueden hacer que la hoja se afloje.
- Desinfectar la cuchilla y el brazo de corte con una solución de etanol al 70%.
ADVERTENCIA: Evite el contacto con la cuchilla. - Desinfectar la bandeja tampón con una solución de etanol al 70% y limpiarla con un tejido estéril.
- Inserte la bandeja tampón en el vibratome y apriete el mecanismo de montaje.
- Ajuste el brazo de corte a la altura máxima disponible.
- Establezca el ángulo de la hoja en 10o por debajo de la horizontal, inclinado hacia abajo a la muestra. Asegúrese de que el ángulo de la hoja esté firmemente fijado.
NOTA: El ángulo óptimo de la hoja puede variar dependiendo del modelo de vibratomo y las características del tejido. - Desinfectar el soporte de la muestra con una solución de etanol al 70%.
- Conecte el agua de refrigeración para el enfriador termoeléctrico Peltier situado debajo de la bandeja de amortiguación.
NOTA: Algunos modelos de vibratome utilizan un baño de hielo para enfriarse. - Fije el tubo de salida de agua a un drenaje y encienda el agua. Ajuste el enfriador a 4 oC. Ejecute el agua de refrigeración a una velocidad de >400 ml/min.
- Llene la bandeja tampón casi hasta la parte superior con un tampón estéril de hielo frío Krebs-Henseleit (con 2 g/L de glucosa). Deje en hielo una solución adicional de tampón Krebs-Henseleit.
2. Eliminación y preparación del hígado
- Esterilice o desinfecte todos los instrumentos quirúrgicos, incluidos fórceps curvos, fórceps de punta cuadrada plana, pinzas, abrazaderas quirúrgicas y tijeras mediante autoclave.
- Antes de la eliminación del hígado, anestesia profundamente los ratones utilizando una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina.
NOTA: Se pueden utilizar otros anestésicos, o los ratones pueden ser eutanasiados por asfixia de CO2/dislocación cervical si el hígado se extrae rápidamente para prevenir daños inducidos por hipoxia.2 - Desinfectar las superficies de la piel en ratones humedeciendo con una solución de etanol al 70%. Asegure ratones en sus espaldas con todas las extremidades ancladas a una placa de diseción.
- Haga una incisión vertical de la línea media en la piel desde la base de la cavidad abdominal hasta justo por encima del diafragma.
NOTA: Se realizan incisiones hacia las extremidades para facilitar la retracción de la piel. - Tire de la piel hacia atrás mientras corta cualquier tejido conectivo entre la piel y la cavidad abdominal. Evitar que el cabello se transfiera a la cavidad abdominal tanto como sea posible. Alfiler o sujetar la piel lejos de la cavidad abdominal.
- Usando fórceps y tijeras limpias, abra la cavidad abdominal y la cavidad torácica inferior.
- Extracción rápida del hígado sin dañar los lóbulos
- Usando herramientas contundentes (por ejemplo, fórceps de punta cuadrada plana), guíe los lóbulos hepáticos superiores hacia abajo hacia el abdomen. Corte el tejido conectivo que rodea los lóbulos hepáticos superiores con tijeras.
- Guiar los lóbulos hepáticos hacia arriba hacia el diafragma. Sostenga el haz vascular central del hígado con fórceps.
NOTA: No afectará al procedimiento si el haz vascular central está dañado. - Tire del haz vascular central lejos del ratón y corte el tejido conectivo restante, los vasos sanguíneos, etc. para extraer el hígado. Tenga cuidado de no 1) dañar los lóbulos hepáticos y 2) cortar en el tracto gastrointestinal, ya que esto puede contaminar el hígado con microorganismos.
- Coloque el hígado removido en un plato estéril de cultivo de tejido de 10 cm medio lleno con solución tampón Krebs-Henseleit helada. Usando un instrumento contundente para guiar los lóbulos, corte el centro del hígado para dividirlo en lóbulos separados.
- Seleccione un lóbulo hepático (utilice el primero más grande) y colóquelo de lado plano en un nuevo plato estéril de 10 cm. Mantener todos los demás lóbulos hepáticos en el plato de la solución tampón Krebs-Henseleit almacenado en hielo para su uso posterior.
- Recorta alrededor del 10% del material del borde más alto del lóbulo hepático mientras estás acostado.
NOTA: El recorte es importante, ya que este borde de tejido se pondrá en contacto primero con la cuchilla de corte; por lo tanto, un borde de tejido que es relativamente perpendicular a la hoja de corte evitará la compresión del tejido que puede ocurrir debido a ángulos poco profundos en los lóbulos hepáticos sin cortar. - Recorte los otros tres bordes de tejido.
NOTA: Esto elimina parte de la cápsula fibrosa de Glisson y facilitará la separación de las rodajas de tejido. - Montaje del lóbulo hepático en el soporte de la muestra
- Coloque una fina capa de pegamento de cianoacrilato (superpegamento o pegamento de cianoacrilato de grado médico/veterinario) en el soporte de la muestra hacia el frente, con un tamaño ligeramente más grande que el lóbulo hepático recortado.
NOTA: Compruebe que el pegamento de cianoacrilato no contiene aditivos que no sean de cianoacrilato. - Recoja suavemente el lóbulo hepático con fórceps estériles usando una esquina lejos del filo de corte, luego seque con palmaditas cualquier tampón residual del lado plano del lóbulo hepático usando material absorbente estéril.
- Coloque el lado plano grande del lóbulo hepático en el parche de pegamento de cianoacrilato con el borde más grande orientado hacia el frente. Dejar que se cure en el aire durante 1 a 2 minutos.
NOTA: Los adhesivos de cianoacrilato se curan rápidamente (2 min) en respuesta a la humedad residual y a las proteínas tisulares, y sujetarán firmemente el tejido al soporte de la muestra.
- Coloque una fina capa de pegamento de cianoacrilato (superpegamento o pegamento de cianoacrilato de grado médico/veterinario) en el soporte de la muestra hacia el frente, con un tamaño ligeramente más grande que el lóbulo hepático recortado.
3. Producción de rodajas de hígado
- Coloque el soporte de la muestra con el lóbulo hepático conectado en la bandeja tampón del vibratome. Asegúrese de que el lóbulo hepático esté completamente cubierto por un tampón.
NOTA: Si es necesario, recabe el nivel de solución tampón Krebs-Henseleit helada. Si el nivel de búfer oscurece el proceso de corte, aumente o disminuya el nivel. - Ajuste la velocidad de corte.
NOTA: Esto puede necesitar ser empíricamente dependiendo del modelo de vibratomo y las características de la hoja. Como guía de inicio, utilice una velocidad de 57 Hz/3,420 rpm. La velocidad del vibratome se puede medir utilizando una aplicación de analizador de espectro de audio en un teléfono inteligente. - Baje la cuchilla de corte hasta que se encuentre justo encima del lóbulo hepático utilizando el dial de altura. Ejecute el brazo de corte vibratorio sobre la muestra.
- Vuelva a devolver la cuchilla con el mango de la biela en sentido inverso. Active las vibraciones mientras devuelve la cuchilla. Después de que la hoja haya regresado y no esté por encima de la muestra, baje la altura de la hoja en 250 m.
- Repita el proceso de corte hasta que se retire la parte superior del tejido. Deseche la primera o dos rebanadas, ya que contendrán la cápsula de Glisson y, por lo tanto, no contendrán mucho tejido hepático funcional en comparación con otras rebanadas.
- Para cortar rodajas de hígado, avance lentamente la hoja vibratoria en el tejido girando el mango. Utilice un pequeño pincel (desinfectado con una solución de etanol al 70%) para guiar suavemente el tejido durante el proceso de corte.
- Usa el pincel para levantar las rodajas de tejido cortado y colocar la rebanada de tejido en un tubo estéril de tampón Krebs-Henseleit helado. Cuando no esté en uso, mantenga este tubo en hielo entre rodajas.
NOTA: A veces, el tejido se desgarra durante el proceso de corte, pero para la mayoría de los propósitos el tejido todavía es utilizable. - Repita el proceso de corte hasta que se alcance la base del lóbulo hepático. Deseche las rodajas de hígado que tengan pegamento curado visible.
NOTA: El pegamento curado es visible como áreas blancas en las rodajas de tejido. Un lóbulo hepático típico sólo tendrá un espesor útil de alrededor de 2 mm. Por lo tanto, sólo alrededor de ocho rebanadas de hígado de 250 m se producen a partir de cada lóbulo. - Cortar las rodajas de tejido hasta que estén cerca del pegamento de cianoacrilato. No cortar en el pegamento.
- Repita todo el proceso con otros lóbulos hepáticos hasta obtener el número requerido de rebanadas de tejido.
- Para limpiar el pegamento y el tejido de cianoacrilato curados del soporte de la muestra, utilice una cuchilla para raspar la mezcla de pegamento/tejido curado, o ablandar y limpiar la mezcla con acetona o dimetilsulfóxido.
4. Cultivo de tejidos
NOTA: Todo el trabajo de cultivo de tejido debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril.
- En una campana de flujo laminar de cultivo de tejido, pipeta 1 ml del medio de William's E que contiene 2,0 g/L de glucosa, 10% de suero bovino fetal (FBS), suplemento de L-glutamina de 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina en 12 placas de cultivo de tejido de pozo.
NOTA: También se pueden añadir otros antibióticos y agentes antifúngicos. Algunos estudios han utilizado aditivos en el medio de incubación de tejidos (es decir, dexametasona e insulina10),pero estos pueden interferir con la señalización celular. - Coloque el tubo que contiene rodajas de hígado del hielo en la capucha del cultivo de tejido. Para eliminar las rodajas de tejido, gire suavemente la mezcla y incline suavemente en un plato estéril de 10 cm mientras se arremolina.
- Usando fórceps estériles de punto afilado y un bisturí, corte las rodajas de tejido en tamaños más o menos uniformes (por ejemplo, 15 mm2).
NOTA: Este paso se realiza para garantizar un área de superficie coherente. Debido a que los lóbulos hepáticos de ratón son significativamente diferentes en tamaño y algunas rebanadas de tejido se desgarrarán, esto producirá una gama de PCLS con diferentes áreas superficiales. Los tamaños finales de superficie del PCLS dependen de la cantidad de material que se necesita en las aplicaciones de análisis posteriores y de cuántas réplicas se necesitan. Cortar PCLS grandes en piezas múltiples más pequeñas del mismo tamaño aproximado permitirá innatamente un mayor número de réplicas experimentales. - Usando fórceps estériles o un pequeño pincel, transfiera las rodajas de tejido cortado a los pocillos de una placa de 12 pocillos que contenga 1 ml de medio.
NOTA: Tenga cuidado de confirmar la consistencia del grosor y la forma de las rodajas de tejido. Las secciones que son más oscuras que el promedio sugieren que el grosor del tejido es mayor y necesitan ser desechados. Las rodajas más ligeras sugieren la presencia de pegamento de cianoacrilato curado y necesitan ser desechados. - Incubar las rodajas de hígado a 37oC y 5%co2 bajo 95% de humedad.
NOTA: Otros grupos han utilizado métodos para mejorar la entrega de oxígeno a PCLS, que parecen prolongar el tiempo de supervivencia del tejido6,10,11,12,13 (ver sección de discusión). - Al día siguiente, cambie el medio de cultivo utilizando una pipeta manual (en lugar de succión) para evitar la pérdida de tejido a través de errores de succión. Posteriormente, cambie el medio en el PCLS diariamente. Los PCLS ya están listos para su uso experimental.
5. Ejemplo de aplicación de PCLS
- A 16 h después de la generación, tratar el PCLS con tres ácidos biliares diferentes: ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y ácido cólico (CA) (como sales de sodio, todo a una concentración de 150 m) durante 2 días.
- Después de 2 días de tratamiento con ácido biliar, extraiga el ARNm colocando rodajas de tejido en el tampón de lisis de ARN helado y homogeneizar rápidamente utilizando perlas con un homogeneizador de perlas (Tabla de materiales).
- Purificar el ARN usando un kit de aislamiento de ARN(Tabla de Materiales)y crear ADNc a partir del ARN purificado.
- Realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa(Tabla de materiales) utilizando imprimaciones específicas (Tabla 1) en el ADNc para examinar la expresión génica.
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Representative Results
Para determinar la viabilidad celular del PCLS a lo largo del tiempo, se midieron los niveles de ATP tisular. Los niveles de ATP suelen ser proporcionales a la viabilidad. LOS PCLS (alrededor de 15 mm2 en área) se cultivaron en el medio normal de William's E con 10% de FBS, luego en momentos específicos, las rodajas de hígado se eliminaron del cultivo tisular y se homogeneizaron con concentraciones de ATP y proteínas (para normalización)quese miden(Figura 1A). Para ensayos bioquímicos como este, la normalización es importante, ya que las rodajas de hígado cortadas no son necesariamente idénticas en dimensiones. Los niveles de ATP (en relación con la proteína) se suprimieron inmediatamente después del aislamiento y después de 1 h(Figura 1A),lo que sugiere estrés metabólico a corto plazo por los procedimientos de enfriamiento y corte. Sin embargo, los niveles de ATP se recuperaron por 3 h. Los niveles de ATP se mantuvieron elevados en hasta 5 días de cultivo de tejido, lo que indica ninguna disminución significativa en la viabilidad. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de las rodajas de hígado sugiere que la necrosis tisular limitada (caracterizada por el pleomorfismo nuclear) se produjo en el cultivo a partir de alrededor de los días 2 y 3. Los niveles de necrosis tisular progresaron a graves para el día 5(Figura 1B). Teniendo en cuenta estos datos morfológicos, tomados junto con los resultados de ATP, se recomienda utilizar este modelo de tejido experimental durante un máximo de 3 días.
PCLS también mostró una acumulación creciente de colágeno en los momentos de cultivo posteriores, como se muestra mediante el engrosamiento de las fibras de colágeno teñidas en rojo Picro-sirius en el día 5(Figura 2). Este engrosamiento de las fibras de colágeno sugiere que los procesos fibrogénicos espontáneos están activos en el PCLS obtenido utilizando este método. Este proceso parece independiente de la metodología de aislamiento PCLS con el engrosamiento de las fibras de colágeno6 y la expresión génica profibrogénica14 que ocurre tanto a partir de cortadoras de tejido vibratome como de Krumdieck, respectivamente, con el tiempo. El desarrollo de estos procesos fibrogénicos espontáneos debe tenerse en cuenta al interpretar la biología PCLS, particularmente con experimentos asociados con procesos fibrosos.
Hemos demostrado previamente la inducción significativa de la proteína connexina 43 del gen específico del colangiocitos(Cx43)y la secreción de glutamila transpeptidasa (Ggt1) por TCA en PCLS9. La expresión de genes específicos de colangiocitos en relación con los controles de limpieza (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa [Gapdh] e hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 [Hprt1]) en PCLS tratados con TCA, GCA o CA fueron examinados por qPCR utilizando imprimaciones específicas. En consonancia con un informe anterior, una inducción significativa en la expresión de genes específicos de colangiocitos cytoqueratina 19 (CK19; Figura 3A) y connexina 43 (Cx43; La Figura 3B)fue observada tanto por GCA como por TCA. La expresión de Ggt1 se incrementó por ambos ácidos biliares; aunque, esto no alcanzó significación estadística, posiblemente debido a la variación experimental(Figura 3C). La expresión de CA no se vio afectada por ningún ácido biliar. La inducción de genes específicos de colangiocitos sugiere que gcA también puede estar involucrado en lesiones hepáticas colestásicas, como se informó anteriormente para TCA8,9.
Figura 1: Viabilidad del tejido de las rodajas de hígado cortadas con precisión (PCLS). (A) los niveles de ATP y proteínas en PCLS se midieron inmediatamente (T + 0) y a 1 h, 3 h, 6 h y 1-5 días después del aislamiento. (B) Para examinar la morfología celular, los PCLS se fijaron, incrustaron en parafina, seccionaron y se teñieron con H&E inmediatamente (día 0) y a los 1, 2 y 5 días después del aislamiento. Se realizó una prueba Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn en relación con T + 0. Todos los datos se representan como media s SEM (n a 2 x 3 ratones) con *p < 0,05. Las barras de escala representan 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la deposición de colágeno en PCLS. PCLS fueron fijos, incrustados en parafina, seccionados y manchados con Picro-Sirius Red para visualizar fibras de colágeno en los días 0, 1, 2 y 5 después del aislamiento. Las barras de escala representan 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los ácidos biliares inducen la expresión génica específica del colangiocito. A las 16 h después del aislamiento, se cambió el medio en el PCLS, y se añadió un nuevo medio junto con ácidos glucocholicos de 150 m (GCA), taurocólicos (TCA) o cólicos (CA) (sales de sodio). El PCLS se cosecharon después de 2 días, y la expresión de citoqueratina 19 (CK19; A), connexina 43 (Cx43; B) y la transpeptidasa de glutamilo 1 (Ggt1; C) se examinó en relación con la media geométrica de Gapdh y Hprt1. La prueba de comparaciones múltiples de Dunnett se realizó en relación con las rodajas de tejido de control no tratadas (n.o 15). Todos los datos se representan como media s DE SEM (n 4 ratones, porciones triplicadas; *p < 0,05, **p < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: imprimaciones qPCR.
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Discussion
El protocolo demuestra la aplicación del aislamiento de PCLS murino y el cultivo de tejidos, y los procedimientos están diseñados para evaluar tanto la viabilidad como la utilidad, así como examinar los impactos de los mediadores exógenos de la patología hepática utilizando ensayos bioquímicos, histología y qPCR. La utilidad experimental del cultivo de tejido PCLS en roedores y humanos se ha demostrado en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo investigaciones experimentales en microARN15/RNA9/expresión de proteína16, metabolismo17, dinámica de infección viral10,18, señalización de infección19, invasión tumoral12, estudios de toxicidad4,13 ,1515,20, daño de ADN, estudios21,biología celular14,y estudios de secreción9.
Mientras que los niveles de ATP indican viabilidad celular en PCLS hasta 5 días en el cultivo, la tinción de H&E sugiere que la necrosis grave estaba ocurriendo por 5 días en el cultivo. El principal factor que parece limitar la viabilidad de PCLS es la disponibilidad de oxígeno6,,11. Varios estudios han incluido una mayor disponibilidad de oxígeno y, en consecuencia, han aumentado el tiempo de viabilidad de PCLS en el cultivo de tejidos. Los métodos utilizados para aumentar la disponibilidad de oxígeno incluyen la incubación de tejido en atmósferas ricas en oxígeno10,11, el uso de la perfluorodecalina portadora de oxígeno12, agitando / enrollando el cultivo durante la incubación6,10,13, y placas de cultivo de tejido diseñado para maximizar la oxigenación6.
Recientemente, un innovador sistema de cultivo de tejido de interfaz aire-líquido ha sido descrito con la utilidad funcional declarada a más de 7 días en el cultivo14. Este protocolo utiliza oxígeno atmosférico ambiental en una incubadora de cultivo de tejido normal. El método permite que PCLS sea accesible a laboratorios que no cuentan con equipos personalizados altamente especializados para mejorar de forma segura la entrega de oxígeno. Sin embargo, Si tales métodos para mejorar la entrega de oxígeno están disponibles, pueden mejorar la viabilidad pclS a largo plazo en el cultivo.
La acumulación de colágeno en PCLS después del día 3 en el cultivo sugiere que los procesos fibrogénicos espontáneos están activos dentro de este modelo. La fibrosis espontánea también se ha observado previamente en PCLS6,,14,22,23,24 y posiblemente está mediada por patrones moleculares asociados al daño (DMI) liberados por el proceso de corte o necrosis tisular. Los DAMP actúan como moléculas de señalización que posteriormente activan las vías de señalización profibrosica25,,26. Además, la fibrosis espontánea en el PCLS podría ser mediada por quimiolinas liberadas de la activación de células estelares y/o células Kupffer (es decir, transformando el factor de crecimiento beta [TGF-o]). En este contexto, un artículo reciente de Bigaeva y otros24 sugiere que la fibrosis espontánea en PCLS está en parte mediada por la señalización TGF,o, como la incubación de PCLS con el inhibidor de TGF-o Galunisertib cambios en la expresión génica inhibida asociados con la fibrosis hepática espontánea. Otro mecanismo posible es que el procedimiento de corte inicialmente induce la proliferación celular de las vías de señalización y la entrada de hepatocitos en el ciclo celular; sin embargo, este mecanismo falla y resulta en detención del ciclo celular a mediados del G1 fase27. La detención del ciclo celular se asocia con fibrosis hepática en lugar de regeneración hepática28.
En el procedimiento experimental representativo, el PCLS se trata con tres ácidos biliares diferentes (GCA, TCA y CA) durante 2 días para simular lesiones hepáticas colestásicas. Dos de los ácidos biliares (GCA y TCA) inducen una expresión significativa de CK19 y Cx43,que son genes asociados con la función de los colangiocitos. Esto sugiere la expansión o diferenciación de las células hacia un linaje de colangiocitos en PCLS tratados con estos ácidos biliares. Esto es consistente con nuestro trabajo anterior mostrando un efecto similar usando TCA9 en PCLS. Además, también es coherente con las observaciones in vivo que muestran la alimentación de taurocholato a ratas aumenta el número de colangiocitosnúmeros 29. El tratamiento de las rodajas de tejido hepático con ácidos biliares simula colestasis hepática, y se especula que el aumento en la expresión de genes asociados con la función de colangiocitos es un intento del tejido hepático de crear conductos biliares adicionales para aumentar la secreción de bilis. Dada la inducción específica de estos genes es producida por los ácidos biliares conjugados (GCA y TCA) pero no la CA no conjugada, se sospecha que estos efectos están mediados por el receptor de esfingosina-1-fosfato 2, un receptor de superficie celular con activación preferencial por ácidos biliares conjugados30.
Una limitación clave de la aplicación de PCLS es la variabilidad de réplica individual. Dado que el hígado no es homogéneo y hay variabilidad en la producción, las rodajas de hígado tienden a tener una variación biológica más grande que la experimentación del cultivo celular. En estudios experimentales con pocas variables, como el procedimiento representativo demostrado anteriormente, esto se supera mediante el uso de un mayor número de réplicas. Sin embargo, esto puede convertirse en un problema para estudios de detección más grandes. En resumen, el protocolo descrito es un método sencillo y confiable para estudiar aspectos de la patología hepática ex vivo, que requiere poco equipo especializado excepto el vibratome.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) de Australia (Grant No. APP1048740 y APP1142394 a G.A.R.; APP1160323 a J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm cuenta con el apoyo de una Beca Senior de Investigación de la NHMRC de Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernández-Rojo contó con el apoyo del programa TALENTO de Madrid, España (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
