Summary
Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.
Abstract
Kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı ve karaciğer kanseri) altında yatan karaciğer hasarı, hepatik fibrozis ve siroz mekanizmalarının anlaşılması, hayvan modelleri ve in vitro hücre kültürleri. Her iki teknik de in vivo manipülasyon için hayvanların çok sayıda gereksinimi gibi sınırlamalar vardır. Ancak in vitro hücre kültürleri çok hücreli hepatik ortamın yapısını ve işlevini yeniden üretmez. Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin kullanımı, deneysel manipülasyon için laboratuvar doku kültüründe tek tip fare karaciğeri dilimlerinin muhafaza edildiği bir tekniktir. Bu teknik, hayvan çalışmaları ve in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında var olan deneysel bir niş kaplar. Sunulan protokol, farelerden hassas kesilmiş karaciğer dilimlerini izole etmek ve kültürü yapmak için basit ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu tekniğin bir uygulaması olarak, ex vivo karaciğer dilimleri kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek ve sonuçta hepatik fibrogenez mekanizmaları değerlendirmek için safra asitleri ile tedavi edilir.
Introduction
En kronik karaciğer hastalıklarının patogenezi (yani, viral hepatit, nonalkolik steatohepatit, kolestatik karaciğer hasarı ve karaciğer kanseri) inflamasyon sürücü birden fazla farklı karaciğer hücre tipleri arasında karmaşık etkileşimler içerir, fibrogenezis, ve kanser gelişimi1,2. Bu kronik karaciğer bazlı hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için, birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimler araştırılmalıdır. Birden fazla hepatik hücre hatları (ve daha yakın zamanda, organoidler) in vitro kültürlü olabilir iken, bu modeller doğru karmaşık yapısı, fonksiyonu taklit etmez, ve hepatik mikroçevre hücresel çeşitlilik3. Ayrıca, kültürlü karaciğer hücreleri (özellikle, dönüştürülmüş hücre hatları) orijinal kaynak biyolojisi sapma olabilir. Hayvan modelleri deneysel olarak birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılır. Ancak, ekstrahepatik organlardaki (örn. potansiyel terapötikleri test ederken) önemli ölçüde hedef dışı etkiler nedeniyle deneysel manipülasyon kapsamı önemli ölçüde azalabilir.
Doku kültüründe hassas kesim karaciğer dilimlerinin (PCLS) kullanımı ilk olarak ilaç metabolizması ve toksisite çalışmalarında kullanılan deneysel bir tekniktir ve uygulanabilir, ultra ince (yaklaşık 100−250 μm kalınlığında) karaciğer dilimlerinin kesilmesini içerir. Bu karaciğer dokusu ex vivo4doğrudan deneysel manipülasyon sağlar. Bu teknik, in vivo hayvan çalışmaları ile in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında deneysel bir uçurum arasında köprü kurarak, her iki yöntemin de birçok dezavantajının üstesinden gelerek (örneğin, tüm hayvanlarda yapIlebilen deneylerin çeşitliliğinin pratik sınırları nın yanı sıra in vitro hücre kültürü yöntemleri ile yapı/fonksiyon ve hücresel çeşitlilik kaybı) arasında deneysel bir boşluk vardır.
Ayrıca, PCLS tüm hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde deneysel kapasitesini artırır. Bir fare 48'den fazla karaciğer dilimleri üretebilir gibi, bu da aynı karaciğer hem kontrol ve tedavi gruplarının kullanımını kolaylaştırır. Buna ek olarak, teknik fiziksel olarak diğer organ sistemlerinden karaciğer dokusu ayırır; bu nedenle, eksojen uyaranların etkilerini test ederken tüm hayvanlarda oluşabilecek potansiyel hedef dışı etkileri ortadan kaldırır.
Bu protokolde, PCLS yanal titreşen bıçak ile bir vibratom kullanılarak oluşturulur. Diğer çalışmalar başarıyla olinga ve Schuppan5açıklandığı gibi, bir Krumdieck doku dilimleyici kullandık. Vibratomda, bıçağın yanal titreşimi, bıçak dokuya itilirken, kesme stresinin neden olduğu ultra ince dokunun yırtılmalarını önler. Hem vibratom hem de Krumdieck doku dilimleyicisi, dilimleme işlemini kolaylaştıran karaciğer dokusunun yapısal olarak gömülmeden etkin bir şekilde çalışır. Bu teknik aynı zamanda fibrozis / siroz6 ve hepatik steatoz7fare modelleri de dahil olmak üzere, hastalıklı karaciğerlerden PCLS oluşturmak için kullanılabilir.
Bu rapor, PCLS'nin hazırlanması ve doku kültürü için gerekli teknikleri göstermenin yanı sıra, adenozin trifosfat (ATP) düzeylerini ölçerek ve nekroz ve fibrozisi değerlendirmek için doku histolojisini inceleyerek bu ek sinol dokuların canlılığını da incelememektedir. Temsili bir deneysel prosedür olarak, PCLS kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek için üç farklı safra asitleri (glikokolik, taurokolik ve kolik asitler) patofizyolojik konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kolestatik karaciğer hasarı bağlamında, özellikle taurokolik asit kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı olan çocukların hem serum hem de safra önemli ölçüde artmış olduğu gösterilmiştir8.
Karaciğer progenitor hücreleri de hastalarda gözlenen yüksek taurokolik asit düzeylerini simüle etmek için taurokolik asit ile in vitro tedavi edilmiştir, ve bu tedavi bir biliyer doğru karaciğer progenitor hücrelerinin artan çoğalma ve farklılaşmasına neden oldu (kolanjiyosit) fenotip9. Daha sonra, PCLS taurokolik asit yüksek düzeyde ex vivo tedavi edildi, ve artmış kolanjiyosit belirteçleri gözlendi. Bu, taurokolik asit in vitro gözlem pediatrik kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı bağlamında safra proliferasyonu ve / veya farklılaşma sürücüler destekler9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, enstitü hayvan etik komitesinin onayı ile QIMR Berghofer Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nde hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için Avustralya koduna uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Erkek C57BL/6 fareler (15−20 haftalık) Hayvan Kaynakları Merkezi, WA, Avustralya'dan elde edildi.
NOT: Numunelere temas eden tüm çözümler, ortamlar, aletler, donanım ve tüpler %70 etanol çözeltisi ile sterilize edilmeli veya iyice dezenfekte edilmeli ve kültür kontaminasyonu riskini en aza indirmek için steril teknikler kullanılarak işlenmelidir.
1. Vibratomun kurulumu
- Steril Krebs-Henseleit tampon çözeltisi 2 g/L glikoz(Malzeme Tablosu)ile hazırlayın. Arabellek pH 7.4 olup olmadığını kontrol edin. PH daha yüksekse, tamponu karbogen (%95 O2 + %5 CO2)ile doygunlayın veya bikarbonat tamponlama sistemini düzeltmek için %5 CO2 doku kültürü kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Mühürlü steril tampon çözeltisini 4 °C'de soğutun.
- Vibratome bıçağını kesme koluna takın. Titreşimler bıçağın gevşemesine neden olabileceğinden, bıçağın kesme koluna sıkıca sabitlenmiş olduğundan emin olun.
- Bıçağı ve kesme kolunu %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin.
DİkKAT: Bıçakla temastan kaçının. - Tampon tepsiyi %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin ve steril bir doku ile silin.
- Tampon tepsiyi vibratome takın ve montaj mekanizmasını sıkın.
- Kesme kolunu mevcut maksimum yüksekliğe ayarlayın.
- Bıçak açısını yatayın 10° altına doğru ayarlayın ve numuneye doğru eğimli bir şekilde ayarlayın. Bıçak açısının sıkıca sabitolduğundan emin olun.
NOT: Optimal bıçak açısı vibratom modeline ve doku özelliklerine bağlı olarak farklılık gösterebilir. - Numune tutucuyu %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin.
- Tampon tepsinin altında bulunan Peltier termoelektrik soğutucuiçin soğutma suyunu bağlayın.
NOT: Bazı vibratom modelleri yerine soğutma için bir buz banyosu kullanın. - Su boruyu bir drenaj için sabitleyin ve su açın. Soğutucuyu 4 °C'ye ayarlayın. Soğutma suyunu >400 mL/dk hızında çalıştırın.
- Tampon tepsiyi neredeyse üst üste steril buz gibi Krebs-Henseleit tampon (2 g/L glikoz ile) ile doldurun. Buz üzerinde ek Krebs-Henseleit tampon çözeltisi bırakın.
2. Karaciğer kaldırma ve hazırlama
- Kavisli forceps, düz kare uçlu forceps, cımbız, cerrahi kelepçeler ve makas otoklavlama kullanarak dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri sterilize veya dezenfekte.
- Karaciğer çıkarmadan önce, 100 mg/kg ketamin ve 12.5 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon uğrama ile fareleri derinlemesine anestezi edin.
NOT: Diğer anestezikler kullanılabilir veya karaciğer hipoksikaynaklı hasarı önlemek için hızlı bir şekilde çıkarılırsa co2 asfiksi/servikal çıkığı ile fareler ötenazi olabilir. - %70 etanol çözeltisi ile ıslatarak farelerdeki cilt yüzeylerini dezenfekte edin. Tüm ekstremiteler bir diseksiyon tahtasına sabitlenmiş olan sırtlarında güvenli fareler.
- Karın boşluğunun tabanından diyaframın hemen üstüne kadar deriye dikey bir orta hat kesisi yapın.
NOT: Ekstremitelere doğru kesiler cildin geri çekilmesini kolaylaştırmak için yapılır. - Cilt ve karın boşluğu arasındaki herhangi bir bağ dokusunu keserken deriyi geri çekin. Saçın mümkün olduğunca karın boşluğuna transfer edilmesini önleyin. Cildi karın boşluğundan sabitle veya kenetle.
- Temiz forceps ve makas kullanarak, karın boşluğu ve alt torasik kavite açın.
- Loblar zarar vermeden hızlı bir şekilde karaciğer çıkarma
- Künt aletler (örn. düz kare uçlu forceps) kullanarak, üst karaciğer loblarını aşağıya doğru karına doğru yönlendirin. Makas kullanarak üst karaciğer lobları çevreleyen bağ dokusunu kesin.
- Karaciğer loblarını diyaframa doğru yukarı doğru yönlendirin. Forceps ile karaciğerin merkezi vasküler demet tutun.
NOT: Merkezi vasküler paket zarar görmüşse işlemi etkilemez. - Fare uzak merkezi vasküler demet çekin ve karaciğer kaldırmak için kalan bağ dokusu, kan damarları, vb kesin. 1) karaciğer lobları zarar ve 2) gastrointestinal sistem içine kesilmiş dikkat edin, Bu mikroorganizmalar ile karaciğer kontamine olabilir gibi.
- Çıkarılan karaciğeri buz gibi Krebs-Henseleit tampon çözeltisi ile yarı dolu steril 10 cm doku kültürü yemeğine yerleştirin. Loblar rehberlik etmek için kör bir alet kullanarak, ayrı loblar içine bölmek için karaciğer merkezi kesti.
- Bir karaciğer lobu seçin (ilk büyük kullanın), ve yeni bir steril 10 cm çanak üzerine düz tarafı aşağı yerleştirin. Sonraki kullanım için buz üzerinde depolanan Krebs-Henseleit tampon çözeltisi çanak tüm diğer karaciğer lobları tutun.
- Düz yatarken karaciğer lobunun en yüksek kenarından malzemenin yaklaşık% 10 kırpma.
NOT: Bu doku kenarı kesme bıçağıilk temas edecek gibi kırpma önemlidir; bu nedenle, kesme bıçağına nispeten dik olan bir doku kenarı, kesilmemiş karaciğer loblarında sığ açılar nedeniyle oluşabilecek doku sıkıştırmasını önleyecektir. - Diğer üç doku kenarını kırpın.
NOT: Bu, lifli Glisson kapsülünün bir kısmını kaldırır ve doku dilimlerinin ayrılmasını kolaylaştırır. - Numune tutucuya karaciğer lobu montajı
- Ön doğru örnek tutucu üzerine siyanoakrilat tutkal ince bir tabaka (superglue veya tıbbi / veteriner sınıf siyanoakrilat tutkal) yerleştirin, kesilmiş karaciğer lob biraz daha büyük.
NOT: Siyanoakrilat tutkalının siyanoakrilat olmayan katkı maddeleri içermediğini kontrol edin. - Yavaşça kesme kenarından bir köşe kullanarak steril forseps ile karaciğer lob almak, sonra steril emici malzeme kullanarak karaciğer lob düz tarafında herhangi bir artık tampon kuru pat.
- En büyük kenarı ön bakan siyanoakrilat tutkal yama üzerinde karaciğer lob büyük düz tarafı yerleştirin. 1−2 dk boyunca havada iyileşsin.
NOT: Siyanoakrilat yapıştırıcılar, artık nem ve doku proteinlerine yanıt olarak hızlı bir şekilde (~2 dk) kürlenir ve bu da dokuyu numune tutucuya sıkıca bağlar.
- Ön doğru örnek tutucu üzerine siyanoakrilat tutkal ince bir tabaka (superglue veya tıbbi / veteriner sınıf siyanoakrilat tutkal) yerleştirin, kesilmiş karaciğer lob biraz daha büyük.
3. Karaciğer dilimlerinin imalatı
- Vibratom tampon tepsisine bağlı karaciğer lobu ile numune tutucu yerleştirin. Karaciğer lobu tamamen tampon ile kaplı olduğundan emin olun.
NOT: Gerekirse, buz gibi Krebs-Henseleit tampon çözeltisi seviyesini yükseltin. Arabellek düzeyi kesme işlemini gizlerse, düzeyi artırın veya azaltın. - Kesme hızını ayarlayın.
NOT: Bu vibratome modeli ve bıçak özelliklerine bağlı olarak ampirik olarak belirlenmelidir. Başlangıç kılavuzu olarak, 57 Hz/3,420 rpm hız kullanın. Vibratom hızı akıllı telefondaki ses spektrum analizörü uygulaması kullanılarak ölçülebilir. - Yükseklik kadranını kullanarak kesme bıçağını karaciğer lobunun hemen üzerinde bulunana kadar indirin. Titreşen kesme kolunu numunenin üzerine çalıştırın.
- Krank tutamacını kullanarak bıçağı geri geri döndürün. Bıçağı döndürerken titreşimleri etkinleştirin. Bıçak geri döndükten ve numunenin üzerinde değilken, bıçak yüksekliğini 250 μm düşürün.
- Doku üst çıkarılınceye kadar kesme işlemini tekrarlayın. Bu Glisson kapsül içerecek ve bu nedenle diğer dilimler ile karşılaştırıldığında çok işlevsel karaciğer dokusu içermez gibi, ilk bir veya iki dilim atın.
- Karaciğer dilimlerini kesmek için, titreşen bıçağı sapı çevirerek yavaşça dokuya doğru ilerletin. Kesme işlemi sırasında dokuyu hafifçe yönlendirmek için küçük bir fırça (%70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edilir) kullanın.
- Kesilmiş doku dilimleri kaldırmak ve buz gibi Krebs-Henseleit tampon steril bir tüp içine doku dilimi yerleştirmek için paintbrush kullanın. Kullanılmadığında, bu tüpü dilimler arasında buz üzerinde tutun.
NOT: Bazen, doku kesme işlemi sırasında gözyaşı yok, ama çoğu amaç için doku hala kullanılabilir. - Karaciğer lobu tabanına ulaşılına kadar kesme işlemini tekrarlayın. Görünür tedavi tutkal olan herhangi bir karaciğer dilimleri atın.
NOT: Kürlenmiş tutkal doku dilimleri üzerinde beyaz alanlar olarak görülebilir. Tipik bir karaciğer lobu sadece yaklaşık 2 mm kullanılabilir bir kalınlığa sahip olacaktır. Bu nedenle her lobdan sadece sekiz adet 250 m karaciğer dilimi üretilmektedir. - Sikoakrilat tutkal yakın kadar doku dilimleri kesin. Tutkal içine kesmeyin.
- Gerekli sayıda doku dilimi elde edilene kadar tüm işlemi diğer karaciğer lobları ile tekrarlayın.
- Tedavi edilmiş siyanoakrilat tutkalını ve dokuyu numune tutucudan temizlemek için, ya kürlenmiş tutkal/doku karışımını kazımak için bir bıçak kullanın ya da karışımı aseton veya dimetil sülfoksitle yumuşatın ve temizleyin.
4. Doku kültürü
NOT: Tüm doku kültürü çalışmaları steril laminar akış başlığı nda yapılmalıdır.
- Bir doku kültürü laminar akış kaputunda, pipet 1 mL William's E orta içeren 2.0 g /L glukoz, 10% fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin takviyesi, 100 U / mL penisilin, ve 100 μg/ mL streptomisin 12 iyi doku kültür plakaları içine.
NOT: Diğer antibiyotikler ve antifungal ajanlar da eklenebilir. Bazı çalışmalarda doku kuluçka ortamı (yani, deksametazon ve insülin10)katkı maddeleri kullanmış, ancak bunlar hücre sinyalini engelleyebilir. - Buzdan karaciğer dilimleri içeren tüpü doku kültürüne yerleştirin. Doku dilimlerini çıkarmak için, yavaşça karışımı girdap ve yavaşça girdap sırasında steril bir 10 cm çanak içine ucu.
- Steril keskin nokta lı forseps ve neşter kullanarak doku dilimlerini kabaca düzgün boyutlarda (örn. 15 mm2)kesin.
NOT: Bu adım tutarlı bir yüzey alanı sağlamak için gerçekleştirilir. Fare karaciğer lobları boyutu önemli ölçüde farklı ve bazı doku dilimleri gözyaşı çünkü, bu değişen yüzey alanları ile PCLS bir dizi üretecektir. PCLS'nin son yüzey alanı boyutları, sonraki analiz uygulamalarında ne kadar malzemeye ihtiyaç duyulduğuna ve kaç çoğaltma gerektiğine bağlıdır. Büyük PCLS'nin aynı boyutta daha küçük birden fazla parçaya dönüştürülmesi doğuştan artan sayıda deneysel kopyaya olanak sağlayacaktır. - Steril çalgılar veya küçük bir fırça kullanarak, kesilmiş doku dilimlerini 1 mL orta içeren 12 kuyuluk plakanın kuyularına aktarın.
NOT: Doku dilimlerinin kalınlığının ve şeklinin kıvamını doğrulamaya özen gösterir. Ortalamadan daha koyu olan kesitler doku kalınlığının daha büyük olduğunu ve atılması gerektiğini düşündürmektedir. Daha hafif dilimler kürlenmiş siyanoakrilat tutkal varlığını öneririz ve atılması gerekir. - Karaciğer dilimlerini 37 °C ve %52 CO 2%95 nem altında kuluçkaya yatırın.
NOT: Diğer gruplar PCLS oksijen iletimini artırmak için yöntemler kullandık, hangi doku sağkalım süresini uzatmak için görünür6,10,11,12,13 (tartışma bölümüne bakın). - Ertesi gün, emme hataları ile doku kaybını önlemek için manuel pipet (emme yerine) kullanarak kültür ortamını değiştirin. Daha sonra, PCLS'deki ortamı günlük olarak değiştirin. PCLS artık deneysel kullanıma hazırdır.
5. PCLS örnek uygulaması
- 16 saat post-jenerasyon, üç farklı safra asitleri ile PCLS tedavi: glikokolik asit (GCA), taurokolik asit (TCA) ve kolik asit (CA) (sodyum tuzları olarak, tüm 150 μM konsantrasyonda) 2 gün boyunca.
- 2 günlük safra asidi tedavisinden sonra, buz gibi RNA lizis tamponuna doku dilimleri yerleştirerek mRNA ayıklayın ve boncuk homogenizer(Malzeme Tablosu)ile boncuklar kullanarak hızlı bir şekilde homojenleştirin.
- RNA izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak RNA'yı arındırın ve saflaştırılmış RNA'dan cDNA oluşturun.
- Gen ekspresyonunu incelemek için cDNA üzerinde spesifik astarlar(Tablo 1)kullanarak nicel polimeraz zincir reaksiyonu(Malzeme Tablosu)gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZAMAN IÇINDE PCLS hücre canlılığını belirlemek için, doku ATP düzeyleri ölçüldü. ATP düzeyleri genellikle canlılık ile orantılıdır. PCLS (yaklaşık 15 mm2 alan) normal William's E orta% 10 FBS ile kültürlü, daha sonra belirli zaman noktalarında, karaciğer dilimleri doku kültüründen çıkarıldı ve hem ATP ve protein ile homojenize (Normalizasyon için) konsantrasyonları(Tablo Malzemeler)ölçülmektedir(Şekil 1A). Bu gibi biyokimyasal tahliller için, normalleştirme önemlidir, kesme karaciğer dilimleri mutlaka boyutları aynı değildir gibi. ATP düzeyleri (proteine göre) hemen izolasyon sonrası ve 1 saat sonra(Şekil 1A)bastırıldı, soğutma ve kesme prosedürlerinden kaynaklanan kısa süreli metabolik stres düşündürdü. Ancak, 3 saat. ATP düzeyleri ile kurtarılan ATP düzeyleri doku kültürünün 5 güne kadar yükselmiş olarak kaldı, canlılık önemli bir azalma gösteren. Karaciğer dilimlerinin hematoksilin ve eozin (H&E) boyanışı, kültürde 2 ve 3. Doku nekrozu düzeyleri gün 5'e kadar ciddi ye doğru ilerlemiştir(Şekil 1B). ATP sonuçları ile birlikte alınan bu morfolojik veriler göz önünde bulundurularak, bu deneysel doku modelinin 3 güne kadar kullanılması tavsiye edilir.
PCLS ayrıca picro-sirius kırmızı lekeli kollajen liflerinin 5.Figure 2 Kollajen liflerin bu kalınlaşma spontan fibrojenik süreçlerin bu yöntem le elde edilen PCLS aktif olduğunu göstermektedir. Bu süreç, kollajen liflerin kalınlaşma sıyrıklılık ile PCLS izolasyon metodolojisi bağımsız görünür6 ve profibrojenik gen ekspresyonu14 hem vibratome ve Krumdieck doku dilimleyicileri meydana, sırasıyla, zaman içinde. PcLS biyolojisi, özellikle fibrotik prosesler ile ilişkili deneyler de yorumlanırken bu spontan fibrojenik süreçlerin gelişimi dikkate alınmalıdır.
Daha önce pcls9'daTCA tarafından kolanjilosite özgü gen connexin 43(Cx43)ve glutamyl transpeptidaz(Ggt1)proteininin salgısını anlamlı indüksiyonu gösterilmiştir. TCA, GCA veya CA ile tedavi edilen PCLS'lerde kolanjilosite özgü genlerin ekspresyonu (gliserindehit 3-fosfat dehidrogenaz [Gapdh] ve hipoksanttin fosforibosiltransferaz 1 [Hprt1]) spesifik astarlar kullanılarak qPCR tarafından incelendi. Bir önceki raporla tutarlı olarak, kolanjiyosite özgü genlerin ekspresyonunda anlamlı bir indüksiyon 19 (CK19; Şekil 3A) ve connexin 43 (Cx43; Şekil 3B) hem GCA hem de TCA tarafından gözlendi. Ggt1 ekspresyonu her iki safra asidi tarafından artırıldı; ancak, bu istatistiksel anlamlılık, muhtemelen deneysel varyasyon nedeniyle ulaşmadı (Şekil 3C). CA ifadesi herhangi bir safra asidi etkilenmedi. Kolanjiyosite özgü genlerin indüksiyonu GCA da kolestatik karaciğer hasarıdahil olabileceğini düşündürmektedir, Daha önce TCA için bildirilen8,9.
Şekil 1: Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin (PCLS) doku canlılığı. PCLS'deki ATP ve protein düzeyleri hemen (T + 0) ve 1 saat, 3 saat, 6 saat ve 1−5 gün sonra izolasyon ölçüldü.A (B) Hücre morfolojisini incelemek için PCLS sabit, parafin gömülü, kesitli ve H&E ile hemen (gün 0) ve 1, 2 ve 5 gün sonra izolasyon ile boyanmıştır. Dunn'ın çoklu karşılaştırma testiile bir Kruskal-Wallis testi T + 0'a göre yapıldı. Tüm veriler ortalama ± SEM (n = 2−3 fareler) ve *p < 0,05 olarak temsil edilir. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PCLS'de kollajen birikiminin değerlendirilmesi. PCLS 0, 1, 2 ve 5 post-izolasyon gün kollajen lifleri görselleştirmek için düzeltilmiş, parafin gömülü, kesitli ve Picro-Sirius Red ile boyanmış. Ölçek çubukları 200 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Safra asitleri kolanjiyosit spesifik gen ekspresyonunu indükler. 16 saat izolasyon sonrası, PCLS üzerinde orta değiştirildi ve yeni orta ile birlikte eklendi 150 μM glikokolik (GCA), taurokolik (TCA), veya kolik (CA) asitler (sodyum tuzları). PCLS 2 gün sonra hasat edildi ve sitokeratin ekspresyonu 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B), ve γ-glutamyl transpeptidaz 1 (Ggt1; C) Gapdh ve Hprt1geometrik ortalamasına göre incelenmiştir. Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi, işlenmemiş kontrol doku dilimlerine göre yapıldı (n = 15). Tüm veriler ortalama ± SEM (n = 4 fare, üçe küçülk dilim; *p < 0,05, **p < 0,01) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: qPCR astarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol, murine PCLS izolasyon ve doku kültürünün uygulanmasını göstermektedir ve prosedürler hem canlılık hem de yarar değerlendirmek ve biyokimyasal tahliller, histoloji ve qPCR kullanarak karaciğer patobiyolojisi eksojen mediatörlerin etkilerini incelemek için tasarlanmıştır. Kemirgenlerde ve insanlarda PCLS doku kültürünün deneysel faydası, mikroRNA15/RNA9/protein ekspresyonu16, metabolizma17, viral enfeksiyon dinamikleri10,18, enfeksiyon sinyalizasyon19, tümör istilası12, toksisite çalışmaları4,13,1515,20, DNA hasarı deneysel araştırmalar da dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi gösterilmiştir çalışmalar21, hücre biyolojisi14, ve salgı çalışmaları9.
ATP düzeyleri PCLS'de 5 güne kadar kültürde hücresel canlılığı gösterirken, H&E boyama, kültürde 5 gün boyunca şiddetli nekroz un meydana geldiğini düşündürmektedir. PCLS canlılığını sınırlamak için görünen ana faktör oksijen durumu6,11. Çeşitli çalışmalar gelişmiş oksijen kullanılabilirliği dahil ve sonuç olarak doku kültüründe PCLS canlılık süresini artırdı. Oksijen kullanılabilirliğini artırmak için kullanılan yöntemler oksijen açısından zengin ortamlarda doku kuluçka dahil10,11, oksijen taşıyıcı perfüzyon perfüzyon perfüzyon kullanımı perfluorodecalin12, sallayarak / kuluçka sırasında kültür haddeleme6,10,13, ve doku kültürü plakaları oksijenasyon maksimize etmek için tasarlanmış6.
Son zamanlarda, yenilikçi bir hava-sıvı arayüzü doku kültür sistemi kültür14daha uzun 7 gün belirtilen fonksiyonel programı ile tanımlanmıştır. Bu protokol, normal doku kültürü kuvözlerinde ortam atmosferik oksijen kullanır. Bu yöntem, PCLS'nin oksijen dağıtımını güvenli bir şekilde geliştirmek için son derece özel, özel ekipmanlara sahip olmayan laboratuvarlara erişebiliyor olmasını sağlar. Ancak, oksijen iletimini artırmak için bu tür yöntemler varsa, onlar kültürde uzun vadeli PCLS canlılığını artırabilir.
Kültürde 3. günden sonra PCLS'de kollajen birikimi bu modelde spontan fibrojenik süreçlerin aktif olduğunu göstermektedir. Spontan fibrozis daha önce PCLS6,14,,22,23,24'te de gözlenmiştir ve muhtemelen kesme işlemi veya doku nekrozu ile salınan hasarla ilişkili moleküler desenler (DAMP) ile aracılık edilir. DAMP'lar daha sonra pro-fibrotik sinyal yollarını aktive sinyal molekülleri olarak hareket25,26. Ayrıca PCLS'de spontan fibrozis, stellat hücrelerinin ve/veya Kupffer hücrelerinin aktivasyonundan salınan kemokinler (yani büyüme faktörü betasını [TGF-β] dönüştürerek aracılık edebilir. Bu bağlamda, Bigaeva ve ark.24 tarafından yapılan yeni bir makalede, PCLS'de spontan fibrozisin kısmen TGF-β sinyalizasyonu ile aracılık ettiği, PCLS'nin TGF-β inhibitörü Galunisertib ile inkübasi gen ekspresyonu değişikliklerinin spontan hepatik fibrozis ile ilişkili olduğu ileri sürilmiştir. Başka bir olası mekanizma dilimleme prosedürü başlangıçta hücre çoğalması sinyal yolları ve hücre döngüsüne hepatositlerin girişini neden olmasıdır; ancak, bu mekanizma başarısız olur ve orta G1 faz27hücre döngüsü arrest sonuçlanır. Hücre döngüsü arrest hepatik rejenerasyon yerine hepatik fibrozis ile ilişkilidir28.
Temsili deneysel prosedürde, PCLS kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek için 2 gün boyunca üç farklı safra asitleri (GCA, TCA ve CA) ile tedavi edilir. İki safra asitleri (GCA ve TCA) CK19 ve Cx43önemli ekspresyonu indükler , kolanjiyosit fonksiyonu ile ilişkili genler. Bu, bu safra asitleri ile tedavi PCLS bir kolanjiyosit soy doğru hücrelerin genişlemesi veya farklılaşması nı göstermektedir. Bu, PCLS'de TCA9 kullanarak benzer bir etki gösteren önceki çalışmamızla tutarlıdır. Ayrıca, sıçanlara taurokolat besleme kolanjiyosit sayısını artırır göstermek in vivo gözlemler ile tutarlıdır29. Safra asitleri ile karaciğer doku dilimlerinin tedavisi hepatik kolestaz simüle, ve kolanjiyosit fonksiyonu ile ilişkili genlerin ekspresyonundaki artış safra salgısını artırmak için ek safra kanalları oluşturmak için karaciğer dokusu tarafından bir girişim olduğu spekülasyonlar. Bu genlerin özel indüksiyon konjuge safra asitleri (GCA ve TCA) tarafından üretilen ancak konjuge OLMAYAN CA, bu etkilerin sfingosin-1-fosfat reseptörü 2, konjuge safra asitleri tarafından tercihli aktivasyon ile bir hücre yüzey reseptörü tarafından aracılık olduğundan şüphelenilir30.
PCLS uygulamasının önemli bir sınırlama bireysel çoğaltma değişkenliğidir. Karaciğer homojen olmadığından ve üretimde değişkenlik olduğundan, karaciğer dilimleri hücre kültürü deneyinden daha büyük biyolojik varyasyona sahip olma eğilimindedir. Yukarıda gösterilen temsili prosedür gibi birkaç değişkeniçeren deneysel çalışmalarda, bu artış sayısı kullanılarak aşılır. Ancak, bu daha büyük tarama çalışmaları için bir sorun haline gelebilir. Özetle, açıklanan protokol, vibratom dışında az özel ekipman gerektiren, karaciğer patobiyolojiex vivo yönlerini incelemek için basit ve güvenilir bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (Grant No) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. APP1048740 ve APP1142394 g.a.r. için; APP1160323 için J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm Avustralya NHMRC kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenir (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo, Madrid, İspanya'nın TALENTO programı (T1-BIO-1854) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
