Summary
Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.
Abstract
Embryonale nier organotypic culturen, en vooral pluripotente stamcel-afgeleide nier organoïden, zijn uitstekende instrumenten voor het volgen van ontwikkelingsprocessen en modellering nierziekte. De modellen worden echter beperkt door een gebrek aan vascularisatie en functionaliteit. Om dit aan te pakken, werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de methode van xenografting cellen en weefsels aan het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo om vascularisatie en herstel van de bloedstroom te krijgen. De grafts zijn bedekt met op maat gemaakte minireservoirs die de monsters vast te stellen aan de CAM en hen te voorzien van cultuur medium dat de grafts beschermt tegen het drogen. De verbeterde cultuurmethode maakt het mogelijk xenografts tot 9 dagen te laten groeien. Het manuscript beschrijft ook hoe optimale omstandigheden te bieden voor langdurige confocale beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen met behulp van de eerder gepubliceerde Fixed Z-Direction (FiZD) methode. Deze methode comprimeert voorzichtig een embryonaal orgaan of organoïde tussen een glazen afdekking en membraan in een grote hoeveelheid medium en biedt uitstekende omstandigheden voor beeldvorming voor maximaal 12 dagen. Samen maken deze methoden vascularisatie en bloedtoevoer naar nierorganoïden en organotypic nierculturen mogelijk met verbeterde confocale beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn zeer gunstig voor het bestuderen van fundamentele en toegepaste functies van nieren ex vivo. Beide methoden zijn van toepassing op verschillende soorten weefsels en organoïden.
Introduction
Organotypic cultuur van embryonale nieren werd een belangrijk model om nefrogenese decennia geleden te bestuderen1,2,3. Nierorganoïden vertegenwoordigen een geavanceerd modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling van gezonde en zieke nieren4. Het belangrijkste nadeel voor beide methoden is echter dat geen van beide methoden de belangrijkste functie van de nier recapituleert: bloedfiltratie. Nefrons en niervabulatuur ontwikkelen zich in nierorganoïden en organotypic culturen op dezelfde manier als vroege stadium in vivo ontwikkeling; echter, de glomeruli gevormd in vitro blijven avasculaire5. Vascularisatie van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden werd eerder in transplantatie-experimenten alleen onder in vivo omstandigheden aangetoond. Bijvoorbeeld, transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide nier-organoïden onder een muis niercapsule maakt de ontwikkeling van de nefron in de organoïde naar een functionele fase6.
Een tussenbenadering tussen zuiver in vitro culturen en in vivo transplantatiemethoden is xenotransplantatie naar de CAM van vogelembryo's. Vascularisatie van intacte muis nier primordia is eerder aangetoond met behulp van dit systeem7,8. Er werd echter ook aangetoond dat de niervasculatuur in de xenotransplanted murinenier was afgeleid van het gastheerendotheel, niet het transplantaat9. Deze observatie verminderde het potentieel van chimaerige (aviaire zoogdieren) modellen van embryonale nieren aanzienlijk om de ontwikkeling van de niervasculatuur te bestuderen, omdat de experimentele omstandigheden niet tolerant waren voor het overleven van donor-afgeleide endotheelcellen.
Gepresenteerd in het eerste deel van dit protocol is een verbeterde methode voor de teelt van muis embryonale nieren op CAM van vogeleieren, een combinatie van micromilieuomstandigheden van organotypic cultuur en xenotransplantatie. De belangrijkste verbetering ten opzichte van eerdere methoden is dat in plaats van het plaatsen van de muis embryonale nieren en nierorganoïden direct op de CAM, de implantatie gebied is bedekt met doorlatende minireservoirs gevuld met cultuur medium dat de getransplanteerde weefsel te leveren met voedingsstoffen en te beschermen tegen het drogen. Het slagingspercentage van de experimenten neemt aanzienlijk toe en de voorwaarden voor de ontwikkeling van vasculatuur van donoren verbeteren. Toepassing van deze methode op xenotransplant culturen resulteert in de ontwikkeling van glomeraire vasculatuur bestaat uit endogene endotheelcellen uit donornieren.
Gedetailleerde analyse van cellulaire morfogenese is een andere belangrijke toepassing van niercultuur modellen. Eerder gerapporteerde methoden voor time-lapse beeldverwerving van nierculturen zijn alleen voldoende voor analyse van de algehele morfologie en patronen van embryonale nieren, maar niet voor het bijhouden van individuele cellen10. Onlangs werd een nieuwe Fixed Z-Direction (FiZD) methode gericht op hoge resolutie confocale 3D time-lapse beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen beschreven11. Bij deze methode worden de organoïden en embryonale organen voorzichtig samengeperst tussen een glazen afdekkingsslip en een doorlaatbaar membraan van een transwellinsert in een op maat ontworpen plaat totdat de dikte van het monster 70 μm bereikt, wat optimale optische omstandigheden voor beeldvorming biedt. In het tweede deel van de methoden wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de fabricage van een op maat gemaakte plaat en de opstelling van FiZD-experimenten voor organoïde beeldvorming op lange termijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzorging en procedures van dieren waren in overeenstemming met de Finse nationale wetgeving voor het gebruik van proefdieren, het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (ETS 123) en EU-Richtlijn 86/609/EEG.
1. Vervaardiging van minireservoirs voor de teelt van embryonale nieren van muizen en nierorganoïden op kipCAM en het opzetten van xenotransplantatie-experimenten
- Gebruik transwell cel cultuur inserts ontworpen voor 6 goed of 12 goed platen.
LET OP: Afhankelijk van het specifieke experiment kunnen grote of kleine minireservoirs worden gebruikt. Het beste is om kleine minireservoirs te gebruiken voor xenografting tot acht embryonale nieren of wanneer meerdere minireservoirs op hetzelfde kippenembryo worden geplaatst (bijvoorbeeld experiment- en controlemonsters op dezelfde kipCAM). - Snijd de zijkanten van de wisselplaten met behulp van een roterende multitool met een cirkelzaagblad of een handzaag om een 2 mm hoge plastic ring te creëren met een doorlaatbaar membraan eraan bevestigd.
- Poets de randen van deze minireservoirs met een scalpel of een scherp mes.
- Steriliseer de minireservoirs in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.
- Was de minireservoirs in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in een laminaire kap.
- Spoel de minireservoirs af in PBS en kweekmedium (hoogglucose DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine).
- Plaats het reservoir in een petrischaaltje, bovenop een druppel (600 μL/400 μL) van kweekmedium met het membraan naar boven gericht.
- Schik ontleed ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipet of een glazen capillaire buis. Vermijd het verlaten van veel vloeistof rond de nieren.
- Laat de monsters zich hechten aan het membraan voor 2-24 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Tot acht E11.5 embryonale muisnieren of nierorganoïden kunnen op de kleine insert worden gerangschikt. De grote wisselplaat wordt aanbevolen als grotere stukken embryonaal weefsel worden gebruikt voor xenotransplantatie of een celhydrogelmengsel op een groter gebied van de CAM. - Neem 8-dagen oude ex ovo gekweekte embryonale kippen bereid volgens eerder gepubliceerde methoden uit de cel kweek incubator12,13.
- Breng de minireservoirs naar de CAM, zodat de grafts zijn gericht op de CAM, en het membraan overlays hen. Plaats de minireservoirs in de periferie van de CAM, zodat ze het kippenembryo niet bedekken.
LET OP: Bij het gebruik van de kleinere minireservoirs vervaardigd uit transwell inserts voor 12 putplaten, kunnen maximaal drie minireservoirs op één CAM worden geplaatst. - Voeg 500 μL (6 put insert) of 300 μL (12 put insert) van cultuurmedium toe aan de minireservoirs.
- Cultiveren van de monsters op kip CAM voor een maximum van 9 dagen. Vervang dagelijks het kweekmedium in de minireservoirs.
OPMERKING: Vascularisatie van de monsters kan worden waargenomen zodra 24-48 uur na transplantatie.
2. Fabricage van op maat ontworpen platen en het opzetten van FiZD-culturen
- Boor gaten met een diameter van 20 mm in de bodem van een 6-putplaat.
OPMERKING: Gebruik voor FiZD-experimenten 6 putplaten met een diepte van 16 mm (gespecificeerd in Tabel van materialen). - Poets de velgen van de gaten (vooral aan de bovenzijde) met behulp van een elektrische boor met een countersink boor bit, een scalpel, of een scherp mes.
- Steriliseer de platen in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.
- Was de platen in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in steriele omstandigheden.
- Grondig wassen 22 mm x 22 mm glas afdekkingen met 70% ethanol of reinig ze volgens het gepubliceerde protocol van Saarela et al.11.
- Lijm de coverslips aan de bovenkant van de gaten in 6 putplaten met behulp van een niet-toxische weefsellijm. Breng lijm rond het gat en plaats voorzichtig de coverslip om het te bedekken. Laat de lijm drogen.
- Inspecteer de platen onder een stereomicroscoop en verwijder overtollige gedroogde lijm van het oppervlak van de coverslips indien nodig.
LET OP: Controleer of er geen lijm boven de coverslip om zelfs compressie van de monsters te garanderen. - Meng polystyreenkralen (70 μm deeltjesgrootte) met een gelijk volume hydrogel. Een volume van 50-100 μL per put is voldoende.
LET OP: Houd het mengsel van hydrogel en polystyreen kralen op ijs. - Plaats een transwell insert onder een ontleden microscoop met het membraan omhoog.
- Schik de monsters (bijvoorbeeld ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden) gelijkmatig op het membraan.
- Voeg het hydrogel/polystyreenkraalmengsel voorzichtig naast de monsters toe om schade aan breekbare weefsels te voorkomen.
- Draai de transwell insert, zodat het membraan met de monsters gemonteerd op het naar beneden.
- Plaats de insert voorzichtig in een put van de aangepaste 6 putplaat en druk deze voorzichtig naar beneden zodat de monsters op het niveau van de kralen worden samengedrukt.
LET OP: Volg de voortgang van de compressie met behulp van een microscoop. - Houd de insert lichtjes met één hand op de put gedrukt en bevestig deze aan de plaat door plastic te smelten met een soldeerbout op drie punten aan de rand van de wisselplaat.
- Wanneer de wisselplaat aan de plaat is bevestigd, voegt u 2 mL kweekmedium (DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine) toe aan de put en blijft u de resterende putten in de plaat op dezelfde manier monteren.
- Breng de afgewerkte plaat over naar een incubator op het podium van een omgekeerde microscoop voor time-lapse imaging.
- Voer time-lapse beeldvorming van de monsters uit met behulp van geschikte experimentele instellingen.
OPMERKING: Het veranderen van het kweekmedium in de putten van de plaat tijdens time-lapse experimenten is niet nodig, maar kan gemakkelijk worden gedaan door de gaten aan de zijkanten van de wisselplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde CAM-cultuurprotocol maakte een zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk als gevolg van xenotransplantatie op kip CAM(figuur 1, film 1). Minireservoirs met kweekmedium leverden voedingsstoffen aan donorweefsel en beschermden het tegen het drogen gedurende de periode voorafgaand aan de juiste vascularisatie. Deze methode voorzag in tolerante voorwaarden voor donor-afgeleide endotheelcellen om te groeien. Daarom werd de niervabulatuur in de getransplanteerde nieren en organoïden meestal, zij het niet uitsluitend, vertegenwoordigd door donorspecifieke cellen (Figuur 2B,C,F). Meer volwassen glomeraire vasculatuur werd verkregen in nieren en nierorganoïden getransplanteerd naar CAM dan in nier organotypic culturen (Figuur 2D,E).
Het FiZD-protocol is een methode die is ontworpen voor langdurige time-lapse beeldvorming van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden met behulp van confocale microscopie met hoge resolutie. In het door Trowell14ontworpen klassieke organotypic-cultuurprotocol wordt een monster op een poreus filter geplaatst, ondersteund door een metalen raster, en bewaard op de lucht-vloeistofinterface (figuur 3A). Deze methode is niet optimaal, noch voor een rechtop, noch omgekeerd type microscoop. De hier gepresenteerde methode is speciaal ontworpen om te functioneren met een omgekeerde microscoop voor beeldvorming. Het monster werd geïmmobiliseerd tussen een glazen afdekking van onderen en een poreus membraan van transwell insert (zie hierboven) (Figuur 3B). De optimale afstand tussen het membraan en de afdekkingsslip was ~70 μm. Polystyreen kralen werden gebruikt als afstandhouders om de dikte van het monster in dit bereik (Figuur 3B).
Er zijn geen commercieel beschikbare 6 goed platen waar het glas coverslip is gelegen aan de bovenkant van de bodem van de put. Daarom is een protocol ontwikkeld voor de fabricage van op maat ontworpen platen die deze functie hebben (Figuur 3B). Figuur 4 toont de representatieve morfologie van een embryonale niercultuur (figuur 4A,D–F) en nierorganoïden (figuur 4B,C). Film 2 vertegenwoordigt de resultaten van hoge resolutie time-lapse beeldvorming van endotheelcellen in muis embryonale nier gekweekt in een FiZD setup. Het rechterpaneel in Film 2 laat zien dat zowel de distributie als de migratie van individuele cellen met deze methode kunnen worden waargenomen.
Figuur 1: Murine embryonale nier xenogetransplanteerd naar de kip embryo CAM. Xenotransplantatie van E11.5 embryonale muisnieren in 8-dagen-oude ex ovo kip embryo; een murine embryonale nier werd gedurende 7 dagen gekweekt op CAM. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: Bloedstroom in murine embryonale nier na xenotransplantatie naar kippenembryo CAM. Een murine E11.5 embryonale nier werd xenotransplanted aan cam van een 8-dagen-oude kip embryo en gekweekt voor 7 dagen. De film toont kip bloedstroom in de xenograft op dag 7. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 2: Murine embryonale nierxenotransplantatie op kippenembryo CAM. Murine E11.5 embryonale nieren (m) werden gekweekt als een organotypic cultuur (d.w.z., controle) of xenotransplanted aan een 8-dagen-oude embryonale kip CAM (c) (d.w.z., experiment). Na 5 dagen embryonale nierteelt werden de controle- en experimentele monsters bevestigd en gekleurd voor de endotheliale marker CD31 (rood) (A–E) en kernen (Hoechst; blauw) (D, E). (C) Anastomozes tussen kippen- en muizenbloedvaten (pijlpunten). (D,E) Een enkele confocale plak uit het midden van de nefperis wordt getoond. (F) Xenotransplantatie van murine E11.5 embryonale nier tot transgene GFP-kip CAM gedurende 7 dagen, gekleurd voor CD-31 (rood). Schaalbalken = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vaste Z-richtingscultuurmethode. (A) Traditionele kweekmethode waarbij het monster groeit op een poreus membraan dat door een raster wordt ondersteund en de uitplant op de lucht-vloeistofinterface houdt. (B) In de nieuwe FiZD-opstelling werd het monster voorzichtig samengeperst tussen de glazen afdekking en een transwell poreus membraan. Polyester kralen gecontroleerd de dikte van het monster aangepast in de z-richting. Dit cijfer werd gewijzigd van Saarela et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Embryonale nieren en nierorganoïde ontwikkeling in de nieuwe FiZD-kweekmethode. Embryonale nieren (A, D-F) en nierorganoïden(B–C)werden gekweekt met behulp van de nieuwe FiZD setup. (A) Brightfield beeld van een intacte embryonale muis nier op dag 7 van de FiZD cultuur. (B) Brightfield beeld van een muis nier organoïde op dag 7 van de FiZD cultuur. (C) MtmG (rode) muis nier organoïde werd gedurende 4 dagen gekweekt met behulp van de nieuwe FiZD setup. Momentopname van de time-lapse beeldstack toont Wnt4Cre-geactiveerdeGFP (groene) expressie in de zich ontwikkelende nefrons. (D) Muis embryonale nier werd gedurende 7 dagen gekweekt met behulp van de nieuwe FiZD setup. Zes2 (groen) en Troma-1 (Krt8, red) kleuring toonde nefron precursoren en ureterische knop (UB) bifurcaties, respectievelijk. (E) Muis embryonale nier rudiment werd gekweekt voor 12 dagen met behulp van de nieuwe FiZD setup. Het werd bevlekt met Troma-1 (rood) en Nephrin (groen), en toonde ub bifurcations en podocyten, respectievelijk. (F) Hetzelfde monster als in (E) met een krachtige vergroting van Troma-1 + (rood) UB en de Nephrin (groen) + podocyten. Dit cijfer werd gewijzigd van Saarela et al.11. Schaalbalken = A-D, F 100 μm; E 1.000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 2: Renal edotheelcellen geëtiketteerd met GFP groeien in de nieuwe FiZD setup en kan worden waargenomen met hoge resolutie confocale microscopie. Embryonale nieren van E11.5 mTmG; Tie1Cre muizen werden ontleed en 6 dagen gegroeid met behulp van de nieuwe FiZD setup. De film toont Tie1Cre-geïnduceerdeGFP expressie in endotheel cellen. Een stapel van 20 z-lagen werd genomen met behulp van een 10x/0.45 doelstelling, met beelden verkregen om de 15 min. In de film worden vijf GFP z-lagen en één helder veldbrandvlak samengevoegd. Het paneel aan de rechterkant toont een close-up van een zich ontwikkelende nier. Endotheelcellen die migreren naar de vasculaire gespleten van S-vorm stadium nefron kan worden gezien. In het paneel aan de rechterkant worden GFP z-laag en één helder veldbrandvlak samengevoegd. De snel bewegende cellen zijn waarschijnlijk macrofagen15. GFP signaal werd ook uitgedrukt door sommige bloedcellen. Voxel grootte 0,69 μm x 0,69 μm x 4,13 μm. Deze film is gewijzigd van Saarela et al.11. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er worden twee gedetailleerde protocollen gepresenteerd die de klassieke nierorganotypic-kweekmethode verfijnen en vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en optimale 4D-beeldvorming (d.w.z. 3D-beeld en tijd) van ex vivo embryonale nieren en organoïden mogelijk maken. In deze sectie worden de kritieke stappen in de methoden belicht en worden probleemoplossingbesproken.
Het belangrijke verschil tussen andere CAM-kweekmethoden en deze verbeterde kipCAM-kweekmethode is het gebruik van op maat gemaakte minireservoirs bij het xenograften van embryonale nieren en nierorganoïden aan de CAM. De membraanbodem van de gemodificeerde transwellinsert drukt de monsters tegen de kipCAM en houdt ze op hun plaats. De zijkanten van de insert dienen als een reservoir voor cultuur medium dat de graft beschermt tegen het drogen. Xenografting aan ex ovo gekweekte embryonale kip CAM wordt sterk aanbevolen, omdat deze methode een groter gebied van de CAM blootlegt waar het minireservoir kan worden geplaatst en het gemakkelijk maakt om het vascularisatieproces visueel te volgen12,13.
Een nadeel van de kip CAM cultuur methode is dat het tijdvenster voor het uitvoeren van de xenotransplantatie is beperkt tot de 8-9 dagen wanneer de CAM van de kip embryo functies voordat het begint vernederend. Grafts die een langere tijd nodig hebben om zich te ontwikkelen, moeten daarom door xenotransplantatie worden gevasculariseerd tot een ander weefsel (bijvoorbeeld muisniercapsule)6. Seriële xenotransplantatie van donorweefsel kan een oplossing zijn voor dit lange incubatietijdprobleem. De methode kan worden aangepast voor time-lapse beeldvorming van de vascularisatie en ontwikkeling van het transplantaat, maar eerst moet de eis voor stabilisatie van het minireservoir en CAM voor beeldvorming op lange termijn worden aangepakt. Het belangrijkste voordeel van dit verbeterde nierxenotransplantatieprotocol voor kip CAM is dat de methode voorwaarden biedt voor donor-afgeleide endotheelcellen om te gedijen.
Het FiZD-protocol beschrijft een methode die is ontworpen voor langdurige time-lapse beeldvorming van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden met behulp van confocale microscopie met hoge resolutie. Voor de setup is het van cruciaal belang dat de afmetingen van de put en insert overeenkomen. Wanneer een afdekbriefje op de bodem van een 6-putplaat wordt gelijmd en de wisselplaat op de put wordt geplaatst, moet het membraan van de wisselplaat het glas raken. Dan, wanneer de cultuur wordt opgezet, zullen de spacerparels de positie van het membraan en bijgevolg de dikte van het gekweekte orgaan of organoïde bepalen. Om deze reden is het van cruciaal belang om de overtollige lijm te verwijderen en te controleren of geen enkel materiaal de wisselplaat beperkt om het afdekglas aan te raken. Het is ook belangrijk om niet-toxische weefsellijm te gebruiken om het afdekglas te bevestigen. Houd er rekening mee dat de lijm niet erg sterk hecht, dus het is van cruciaal belang om de platen zorgvuldig te behandelen. De platen kunnen worden hergebruikt, en als het deksel glas loskomt tijdens het wassen stappen, kan het weer worden gelijmd op.
De FiZD imaging methode maakt het mogelijk studie van nefrogenese op een single-cell niveau. De hoge kwaliteit van time-lapse beelden met hoge resolutie maakt het mogelijk om geautomatiseerde celsegmentatie toe te passen om cellulair gedrag in nierorganoïden en nierculturen te bestuderen. Verschillende monsters in verschillende putten van een 6-putplaat kunnen gelijktijdig worden bestudeerd in verschillende kweekomstandigheden. De techniek kan gemakkelijk worden gewijzigd voor verschillende maten en soorten weefsel en organoïden door het veranderen van de grootte van de spacer kralen; dit werd aangetoond met eierstokcellen14. Als een verdere optimalisatie van deze methode, het combineren van de FiZD setup met onlangs gepubliceerde microfluïdische benaderingen16 kan zeer gunstig zijn voor hoge resolutie microscopische analyse van cellulaire morfogenese in latere stadia van de nierontwikkeling.
Een voordeel van de FiZD methode is dat er voldoende cultuurmedium beschikbaar is en het is niet nodig om het te veranderen tijdens de 1 week van beeldvorming. Toch, als een media verandering nodig is, kan het medium gemakkelijk worden veranderd van een opening in de muur van de insert. De FiZD-methode is ook superieur aan andere orgaankweekmethoden, omdat het het monster dichter bij de microscoopdoelstelling brengt. In andere veel gebruikte cultuurmethoden is er een membraan of filter en een glazen plaat bodem tussen de afgebeelde monster en de doelstelling, het verbieden van nauwkeurige hoge resolutie beeldvorming17. Met de FiZD-methode is het mogelijk om hoge resolutie beelden van levende weefsels te verwerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de Suomen Akatemia (Academie van Finland) (206038, 121647, 250900, 260056; Centre of Excellence grant 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finse Kidney and Liver Association, de Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, The Swedish Cultural Foundation in Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (KP7/2007-2013; grant FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) en H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENTRACTALALAL" Project ID 642937. De auteurs danken Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias en Hannele Härkman voor technische bijstand.
Figuren 3, 4 en Film 2 worden herdrukt met toestemming van Development.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L.
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
