Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/61061
Automatic Translation
1, 1, 1
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Summary

نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكاليشن على الخلايا المنوية الكبيرة S4-S5.

Abstract

الخصيتان Drosophila هي نظام نموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية والهندسة المعمارية النووية وداء الميوس وتنمية الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، غالبا ما يرتبط التهيئة المناعية لاختبار Drosophila بأكمله بعدم التوحيد الكبير للتلطيخ بسبب اختراق الأجسام المضادة. المستحضرات المسحقة فقط جزئيا التغلب على المشكلة لأنه يقلل من نوعية 3D من التحليلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول كامل جبل باستخدام NP40 وهبتان أثناء التثبيت جنبا إلى جنب مع وضع التوسيل المناعي في وسائل الإعلام السائلة. فهو يحافظ على الحجم المناسب للتنظير المجهري البؤري جنبا إلى جنب مع وضع العلامات القابلة للاستنساخ والموثوق بها. نعرض أمثلة مختلفة على إعادة تشكيل النواة ثلاثية الأبعاد لنوى الخلايا المنوية من أقسام الكونفوجال. تسمح القابلية للاستنساخ داخل الخصيتين وبينهما بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ومقارنة الفلورسينس بين الخلايا المفردة من الأنماط الجينية المختلفة. استخدمنا مكونات مختلفة من هيكل MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) فضلا عن عنصرين المرتبطة مجمع المسام النووية لتوضيح هذا البروتوكول وتطبيقاته على أكبر خلايا الخصية، وs4-S5 الحيوانات المنوية.

Introduction

إن الخصيتان Drosophila نموذج قيم لدراسة البنية النووية. في الخلايا المنوية ميتوتيك، وتحتل إلى حد كبير الحجم النووي من الكروماتين. تخضع هذه الخلايا لأربع جولات من الانقسام ، مما ينتج كيسا من 16 خلية منوية أولية. على مدى الأيام القليلة القادمة ، تمر الخلايا المنوية عبر 6 مراحل نمو (S1-S6) ، وزيادة كبيرة في الحجم ، تقريبا 20 أضعاف1،2. كما أنها تغير مورفولوجيا النووية الخاصة بهم. الخطوط العريضة للنواة ، التي كشفت عنها صفح Dm0 ، يصبح غير منتظم ويظهر التغلغل العميق1،3. ويرافق ذلك تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني والتعديلات في chromatin المنظمة1،4،5،6،7. الكروموسومات بين المراحل محددة جيدا في المرحلة S4-S5، وتشكيل ثلاثة كتل متميزة المقابلة لautsomes ثنائية التكافؤ الرئيسية 2 والزوج X-Y رست مع النيوكليولوس.

تم عزل Mad1 أصلا كعنصر رئيسي في نقطة التفتيش mitotic (استعرضت في8). في مرحلة ما بين المراحل، ويوصف بأنه يقع في المقام الأول في المغلف النووي ولكن أيضا في النيوكليوبلازم9،10،11. في اختبار Drosophila ، أبلغنا أن Mad1 بارز في النيوكليوبلازم ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية الرئيسية وإلى حد أقل مع الكروماتين XY. لقد حددنا هذا الهيكل المرتبط بالكروماتين على أنه MINT (الإقليم النووي الداخلي المحتوي على Mad1)12. وارتبطت أربعة بروتينات أخرى مع MINTs في الحيوانات المنوية: نوكليوبورين Mtor / Tpr، وS SUMO peptidase Ulp1، وبروتين نقطة تفتيش ميتوتيك Mad2 و وحدة فرعية من مجمع يشبه بوليكومب Raf212.

لإكمال وصف MINTs ، كنا بحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة وواجهنا المشاكل التقنية التي تواجه بشكل عام مع التثبط المناعي في الخصية: نفاذية ضعيفة مما يؤدي إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في عمق الخصية ، خاصة في الخلايا المنوية الكبيرة. Sألغت الاستعدادات زيادة الوصول إلى الأجسام المضادة ولكن أدى إلى صور مضغوطة, تقييد التحليلات 3D, ومنع قياس الفلورية الكمية, بما في ذلك كولوكالينج. ويمكن أيضا معالجة مشكلة اختراق الأجسام المضادة من قبل عوامل permeabilizing مثل 0.3٪ Na deoxycholate13، ولكن هذا الإجراء لم يسفر في أيدينا عن نتائج قابلة للاستنساخ. ولأننا قمنا بالعديد من تجارب وضع العلامات المشتركة، فقد تطلعنا إلى تحسين بروتوكول التهيئة. أدى الجمع بين 1٪ NP40 بالإضافة إلى الهيبتان إلى المزيد من القابلية للاستنساخ ، خاصة في دراسة الخلايا المنوية الكبيرة.

هذا البروتوكول ينفذ التثبيت والتلوي المناعي للخصيات في التعليق، وتحسين جودة العينة، فضلا عن تعزيز استنساخ، وجعلها مناسبة للفحص المجهري confocal. استخدمنا البروتوكول لتحديد أفضل للعلاقات المكانية لبعض بروتينات المغلف النووي مع الهياكل النووية للخلايا المنوية الكبيرة. ستسمح هذه الطريقة بإجراء تحقيقات أفضل للتغيرات المصاحبة لتطور الخلايا المنوية ، على سبيل المثال التغيرات الهيكلية الديناميكية للنواة بما في ذلك الكروماتين والنوكليوبلازم والمسام النووية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مجموعة الخصية دروسوفيلا

ملاحظة: الذكور الصغار (0-15 ساعة بعد انهيار الدماغ) ضرورية لفحص الخلايا الجرثومية ثنائية الديبلويد (أي الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية).

  1. حدد الذباب الصغير قدر الإمكان لتقليل التداخل من تطوير الحيوانات المنوية.
  2. تخدير الذباب عن طريق التعرض القصير لثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى منصة ذبابة14،15.
  3. تحت المجهر تشريح (10x التكبير)، واستخدام ملقط لإزالة الرأس.
  4. نقل 5 إلى 10 الذباب مقطوعة الرأس إلى 100 ميكرولتر من العازلة رينغر (183 MM KCI، 47 mM NaCl، 10 mM تريس-HCI، 1 mM EDTA، مثبط البروتين الكامل، درجة الحموضة 6.8) على شريحة زجاجية مغلفة بالسيليكون على دعم الخلفية السوداء.
  5. مع تشريح المجهر في التكبير 40x، استخدم زوج واحد من ملقط رقم 5 لعقد ذبابة بين الصدر والبطن، ومع ملقط أخرى، وسحب البطن بعيدا عن الصدر. عزل بسرعة الخصيتين والأنسجة المجاورة من جثة ذبابة15 ومكان في قطرة جديدة من العازلة رينغر على نفس الشريحة.
  6. مرة واحدة جميع الخصيتين جاهزة، وتنظيف الخصيتين من الأنسجة المتبقية (الغدة الملحقة والأعضاء التناسلية الخارجية).
  7. إزالة المخزن المؤقت الزائد من الإفلات الذي يحتوي على الخصية تشريح. عادة، استخدم ماصة P200 مع طرف 10 ميكرولتر مزودة على رأس طرف 200 ميكرولتر. وهذا يسمح بإزالة الفائض السائل من خلال فتحة صغيرة. ضع قطرة من 4٪ مثبت بارافورمالديهايد على رأس القطرة التي تحتوي على الخصيتات المشرحة، ثم قم بنقل الخصية بسرعة إلى أنبوب يحتوي على محلول مثبت جديد.

2. تثبيت بارافورمالدهيد

  1. إعداد 2 مل من محلول التثبيت قبل الاستخدام مباشرة: 600 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد مخففة في ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) مع 30 ميكرولتر من NP40 20٪ بالإضافة إلى 1200 ميكرولتر من الهيبتان في أنبوب طرد مركزي ميكروني سيليكون 2 مل. استخدام 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني أعدت في 600 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    تحذير: الهيبتان والبارافورمالديهيد سامان ويجب التعامل معهما في غطاء الدخان. التصرف فيها وفقا للوائح المعهد المضيف.
  2. نقل الخصيتين باستخدام p200 ميكروبايت مع طرف فتحة واسعة إلى حل PFA/NP40/heptane. يهز أنبوب صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية باليد. مواصلة تحديد الخصية على خلاط دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. وقف خلاط دوارة ووضع أنبوب في رف أنبوب للسماح فصل المرحلة والخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. إزالة جميع heptane والحل المثبت وشطف الخصيتان بسرعة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
  5. نقل إلى أنبوب 200 μL الفردية نظيفة. إجراء جميع الحضانات في هذه الأنابيب الصغيرة لتقليل كميات الأجسام المضادة المستخدمة.
  6. إزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر مع كل من P200 وطرف P10 المرفقة. الحرص على عدم تستنشق الخصية.
  7. إبقاء الخصيتين في برنامج تلفزيوني 1x على الجليد حتى جميع العينات جاهزة.

3. تلطيخ الأجسام المضادة في الحل

  1. تجاهل برنامج تلفزيوني وترك الخصيتين في 0.3٪ PBS-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل permeabilize أغشية الخلايا.
  2. قبل الحضانة في نفس العازلة بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.3٪ PBS-T بالإضافة إلى 5٪ NGS(جدول المواد).
  4. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) مع التحريض لطيف على الروك.
  5. غسل 3 مرات في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. السماح للخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:500 من سلسلة DyLight المترافقة.
  7. احتضان الأجسام المضادة الثانوية في غرفة مظلمة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر مع 0.2٪ PBS-T و 0.1٪ PBS-T، في كل مرة لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة لإزالة المنظفات.
  9. إضافة 180 ميكرولتر من حل DAPI في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة. حل الأسهم هو 10 ملغ / مل في H2O. تجنب صنع حل الأسهم في برنامج تلفزيوني، والتي يمكن أن تقلل من إشارة تلطيخ DAPI على الكروماتين المنتشر في الحيوانات المنوية أكبر.
  10. يغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة نظيفة.
  12. يستنشق الخصية ووضعها على الشريحة. قبل الشطف تلميح فتحة واسعة مع 0.1٪ PBS-T يمنع الخصيتين من التمسك تلميح. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة.
  13. إضافة قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من سيتيفلور AF1.
  14. ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الأنسجة، مع الحرص على تجنب محاصرة فقاعات الهواء.
  15. ختم غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
  16. مراقبة الشرائح على المجهر.

4. تحليلات التكلس

  1. الحصول على صور confocal. استخدمنا المجهر زايس LSM 710 confocal (63x خطة الزيت أبوكروماتيك) مع دقة z من 0.5 أو 1 ميكرومتر.
  2. حدد خلايا مختلفة من الخصية المستقلة.
  3. استيراد الصور إلى برامج المعالجة (مثل Imaris).
  4. تعريف النواة عن طريق تجزئة يدوية من أجل استبعاد النوى المجاورة. استخدام برنامج كولوك؛ فإنه يجمع معاملات الارتباط بيرسون (PCCs) داخل وحدة التخزين بأكملها بين 2 الفلوروفور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العقبة الرئيسية للحصول على تلطيخ كافية من الخصيتين Drosophila هو penetrability محدودة من الأجسام المضادة، والتي تم حلها جزئيا باستخدام الاستعدادات سحقت ولكن على حساب الحث على تقييد التحليلات 3D (على سبيل المثال التمثيل 3D أو قياس الكولوكاليد). يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة ويحافظ على حجم كافة خلايا الخصية. هنا ركزنا التوضيح للطريقة على التمثيل ثلاثي الأبعاد لخلايا الحيوانات المنوية S4-S5 ، لأنها أكبر الخلايا وبالتالي أكثر حساسية للتشوه من السحق. استخدمنا علامات نووية مختلفة، بما في ذلك النيوكليوبورينات ووضع العلامات على مجال MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) التي وصفها البروتين ميتوتيك Mad112. وبما أنه يمكن الكشف عن الألغام الدقيقة من خلال عدة أجسام مضادة مختلفة، استخدمناها لاختبار متانة البروتوكول من أجل التكبر الكمي ثلاثي الأبعاد، وهي طريقة تتطلب استبانة مكانية صحيحة.

يسمح البروتوكول المذكور أعلاه بالحصول على صور كونفوكوكال ذات جودة كافية ليتم علاجها بعد ذلك لإعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد. أربعة أقسام تسلسلية متجاورة من مرحلة S5 spermatocyte مصورة في الشكل 1A، تظهر بقعة مناعية تمثيلية من MINT (ماد1 immunolabeling باستخدام معزز GFP باللون الأحمر) جنبا إلى جنب مع DAPI (في سماوي). يتم تنظيم الكروموسومات في المجموعات المميزة 3 الرئيسية المتميزة ويظهر هيكل MINT بالتفصيل الدقيق حول الحمض النووي ، ويرتبط ارتباطا وثيقا مع - ولكن متميزة عن - كتل الكروماتين الذاتية. ويسمح القرار أيضا بالكشف عن وجود ماد 1 في المحيط النووي وكذلك بين الكتل الصبغية الذاتية للكروموسومات 2 و 3. استخدمنا برنامج Imaris للتمثيل ثلاثي الأبعاد. تم تعريف السطح النووي من خلال الوجود المنخفض المستوى ل Mad1 في المغلف النووي (باللون الرمادي) وتم تعريف MINT من خلال تراكم مستوى عال من Mad1 داخل النواة (باللون الأحمر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (باللون الأزرق) (الشكل 1A). يوضح فيلم إعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد حجم وعلاقة Mad1 (في المغلف النووي وفي MINT) جنبا إلى جنب مع الكروموسومات في المرحلة S4-S5 من الحيوانات المنوية.

وقد تم وصف توزيع النيوكليوبورينات بشكل سيئ فقط في هذه الخلايا، وربما يرجع ذلك إلى صعوبة الكشف عنها في هذه النوى المشوهة الكبيرة. تم الإبلاغ عن توزيع Nup154 مرة واحدة فقط في السابق16 ودرس Nup153 و Nup98 فقط في spermatogonia والصغيرة، والحيوانات المنوية في وقت مبكر17. كانت إعادة تشكيل 3D من الخلايا المنوية S5 كبيرة ملطخة Nup62 nucleoporin والاستيراد β (نتاج جين كيتل) ممكنة ويتم تمثيلها في الشكل 1C والشكل 1D، على التوالي. ويبدو أن هذه المكونات النووية المرتبطة بالمسام غير موزعة بشكل موحد على الحافة النووية كنقاط ذات حجم غير منتظم. على سبيل المثال، تجمع β importin حول الكروماتين autosomal على نحو مماثل إلى حيث تم بالفعل وصف شبكة صفح3. وقد وصف هذا النوع من التوزيع مع المناطق الغنية بالمسام والمناطق الكبيرة الخالية من المسام عن طريق المجهر الإلكتروني في الحيوانات المنوية القوارض18. ومن شأن فهم التغيرات في توزيع اللحاء والنوكليوبورين أن يساعد على فهم بنية المغلف النووي في هذه الخلايا G2 قبل إصابة الذكور بالخلايا.

مع الحفاظ على حجم 3D من الخلايا هذا البروتوكول يسمح أيضا الأجسام المضادة لاختراق موحد في عمق كل خلية، مما يسمح التحليل الكمي مثل كولوكالينج. معامل ارتباط بيرسون (PCC) هو مقياس راسخ. يمكن أن تتراوح من +1 (مما يدل على ارتباط إيجابي مثالي) إلى −1 (ارتباط سلبي مثالي)19. لتقييم توطين البروتينات شريك MINT بالنسبة إلى Mad1 في الحيوانات المنوية، ونحن قد قدرت سابقا PCC على قسم واحد من 0.5 ميكرومتر باستخدام ImageJ في S5 spermatocytes12 (الشكل 2A، B). اختبرنا البروتوكول بشكل أعمق باستخدام كولوكالينيس ثلاثي الأبعاد على النوى بأكملها بدلا من مجرد سطح. تم تعريف حجم النوى عن طريق التقسيم اليدوي وتم قياس PCC باستخدام أداة Colocation. قمنا بتحليل ثمانية نواة S5 spermatocyte، من الخصية نفسها أو الخصية المختلفة. ويبين الشكل 2B تمثيلا ثلاثي الأبعاد لنواة عملت على قياس PCC. يظهر الشكل 2D قياس PCC على ثمانية نوى مختلفة S5 spermatocyte من ثلاثة خصيات مختلفة. لا تختلف قيم PCC، وتتراوح بين 0.6 و0.75، مما يشير إلى قيمة عالية للكولوكال. ولا يمكن تمييز هذه الخطوات عن الفريق الحكومي المعني بتغير المناخ المحدد في قسم واحد. وبالتالي، يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة استنساخها ويحافظ على حجم جيد من جميع خلايا الخصية.

ولأن البروتوكول يسمح بقياس موثوق به للكولوكالينج من الخصيتين المستقلتين، فقد سمح بالمقارنة بين التلطيخ من الأنماط الجينية الذبابية المختلفة. وقد تجلى هذا هنا بالمقارنة مع الذباب WT والذباب RNAi استنفدت لمتور (ولدت عن طريق التعبير عن خطوط DSRNA UAS وسائق بام Gal4 التي تحقق استنفاد كبير في أواخر spermatogonia والحيوانات المنوية في وقت مبكر20). وكما هو موضح لتجارب التكبر، تم تشريح الخصيتين المنضبتين من Mtor-RNAi واختبارات الأنواع البرية وإصلاحها معا وتم الحصول على الصور الكونفوجال في ظل إعدادات ثابتة. احترام هذه الشروط، مقارنة الخلايا الفردية يصبح ممكنا. لاحظنا أن ال MINT يتأثر أكثر من المغلف النووي بفقدان Mtor كما هو مبين من قبل الممثل Mtor RNAi المنضب (العلوي) و wt (السفلي) الخلايا(الشكل 3)12.

Figure 1
الشكل 1: توضيح من التلطخ المناعي لنوى الخلايا المنوية Drosophila S4-S5 باستخدام مسابير مختلفة. (أ) صور لمرحلة واحدة 5 نواة الحيوانات المنوية مناعة ملطخة α-GFP الأجسام المضادة (GFP الداعم) الكشف عن هيكل MINT بواسطة Mad1-GFP (أحمر) معا لتلطيخ DAPI (الأزرق). فإنه يظهر بدقة العلاقة بين Mad1 واثنين من الجماهير الكروماتين autosomal (ممثلة كعلامات نجمية). كما يتم الكشف عن Mad1 بشكل ضعيف على هامش النواة. جميع الصور هي المسلسل Z-التوقعات من كومة من 3 (0.5 ميكرومتر) شرائح confocal المتعاقبة. تم الحصول على صور Confocal على المجهر confocal (63x، خطة Apochromatic النفط DIC عدسة الهدف). أشرطة مقياس هي 5 ميكرومتر. (ب) الإطار من تقديم الفيلم من نواة spermatocyte نفسه. تم تعريف السطح النووي من خلال التعبير المنخفض عن Mad1 في المغلف النووي (باللون الرمادي) وتم تعريف MINT من خلال التعبير العالي عن Mad1 داخل النواة (باللون الأحمر). (أ, ب) أعيد طبعها بإذن من الرقم المنشور سابقا (من12). (C) صورة ثلاثية الأبعاد لنواة الحيوانات المنوية في المرحلة الخامسة مع وجود مناعة متزامنة ل Nup62 (أصفر) و MINT (معزز GFP باللون الأحمر). مقياس شريط هو 4 ميكرومتر. (D) صورة 3D من نواة الحيوانات المنوية المرحلة 5 مع في وقت واحد مناعة من importin-β كيتل (الأصفر) جنبا إلى جنب مع الحمض النووي (DAPI باللون الأزرق). أشرطة المقياس هي 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: 2D و 3D قياس الكمية كولوكاليشن من Mad1 جنبا إلى جنب مع Ulp1. (أ) الصور المدمجة من نواة الحيوانات المنوية المرحلة 5 مناعة ملطخة مع الأجسام المضادة الداعمة GFP الكشف عن Mad1 (الأخضر) ومع الأجسام المضادة Ulp1 (الأحمر) ممثلة ككومة سميكة 1 ميكرومتر من نواة الحيوانات المنوية. على اليمين يشار إلى معامل ارتباط شدة بيرسون المحسوب باستخدام المكون الإضافي Coloc-2 ImageJ. وقدرت PCC إلى 0.73 (طبع بإذن من رايش12). (ب) صورة مدمجة من المرحلة 5 نواة الحيوانات المنوية (المقابلة للنواة G في الجدول المجاور) مناعة ملطخة بأجسام مضادة معززة GFP الكشف عن Mad1 (الأخضر) ومع الأجسام المضادة Ulp1 المضادة (الأحمر) ممثلة في الإسقاط 3D. تم تعريف حجم النواة عن طريق التقسيم اليدوي. على اليمين، يسرد الجدول معاملات ارتباط شدة بيرسون المحسوبة على 8 الحيوانات المنوية المختلفة (من A إلى H) من 3 خصيتين مختلفتين (1 إلى 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل المناعة من الخلايا المنوية المعالجة من Mtor RNAi مقارنة بالنوع البري. كانت الخلايا المستنفدة من Mtor باستخدام MtorRNAi (ID 110218) الخلايا (الألواح العليا) والخلايا البرية (الألواح السفلية) ملطخة ببروتينات Mad1 و Raf2 و Mtor. تم إصلاح الخصيتين وتلطخهما معا ، مثبتة على نفس الشريحة والصور المكتسبة بنفس المعلمات. يمكن تمييز خلايا RNAi عن WT من خلال غياب أو وجود Mad1-GFP على التوالي. يمثل هذا الرقم الإسقاطات القصوى لمداخن 4 × 0.5 ميكرومتر. شريط المقياس هو 5 ميكرومتر (أعيد طبعه بإذن من الرقم المنشور سابقا في12). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتكبيل المناعي الناجح لخصيات Drosophila البالغة الكاملة التركيب. كما ورد في إجراءات أخرى يجب استخدام الذكور الصغار (حتى أننا قصرنا العمر إلى أقل من 20 ساعة بعد الانفجار) لتقليل وجود الحيوانات المنوية النامية، مما يهدد بعرقلة الحيوانات المنوية. يجب أن يكون التشريح سريعا ويجب تعديل تمييع الأجسام المضادة لتحسيننسبة الإشارةإلى الضوضاء 21و22و23. لأنه باستخدام بروتوكولات أخرى ، لم نلاحظ تلطيخ في جميع أنحاء عمق الخصية ، طورنا طريقة تثبيت تجمع بين PFA مع NP40 والهبتان. نحن الآن استخدام روتيني 600 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني مع 30 ميكرولتر من 20٪ NP40 بالإضافة إلى مجلدين من الهيبتان. وهذا أمر بالغ الأهمية للسماح بالتأهيل الكافي. يقلل تقليل مقدار NP40 إلى 10 ميكرولتر بشكل واضح من وضع العلامات. تم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في التعليق وأزيل الحاجز الزائد عن طريق السماح للخصيين بالنزول بلطف إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية. للخطوة الأخيرة نقل العينات إلى شريحة، ونحن شطف تلميح في 0.1٪ PBS-T لمنع الخصيتين التمسك مخروط. ووفقا للملاحظات، يعمل بروتوكول تلطيخ المناعة بشكل جيد مع مجموعة متنوعة من البروتينات النووية، بما في ذلك العلامات المستخدمة هنا، فضلا عن مسابير تعديلات الهستون اللاجينية واللحن والنوكليوبورينات. نلاحظ أنه يمكن أيضا استخدام البروتوكول لاختبارات اليرقات ، وفي هذه الحالة يجب حذف الهيبتان ، لأنه يجعل الخصيتين أكثر صعوبة في التعافي سليمة.

تم تصميم البروتوكول بشكل خاص للحفاظ على أكوام غير التالفة من الحيوانات المنوية معا لوضع علامات فعالة وموحدة من الخصية. قمنا بتصوير البروتوكول مع الخلايا المنوية الكبيرة في مرحلة متأخرة ، والتي تجعلها نواتها المشوهة من بين أصعب الخلايا للحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، في هذه الحيوانات المنوية الوسم النووي غالبا ما يصبح مخفف ربما بسبب حجم النوى. على سبيل المثال، لوحظ عادة أن DAPI أو صفح الوسم هو أقوى في الخلايا في قمة الخصية ويصبح أضعف تدريجيا وأكثر تفريق كما تنموالحيواناتالمنوية 3،24. وهذا يمكن أيضا أن يكون واحدا من الأسباب التي تم وصفها فقط توزيع النيوكليوبورينات في خلايا المرحلة المبكرة (spermatogonia والحيوانات المنوية في وقت مبكر)17.

وقد نشرت صور ممتازة من المناعة من Drosophila S5 spermatocytes، لا سيما بالنسبة للبروتيس محددة t-BRD والبروتينات داني25،26 باستخدام إما 0.3٪ بروتوكول ديوكسيشولات الصوديوم أو بعد سحق الأنسجة21،22. في أيدينا ، تؤدي السحقات إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في أعماق الجهاز وكذلك التضحية بالهيكل ثلاثي الأبعاد. حتى لو كان استخدام 0.3٪ من ديوكسيكولات الصوديوم أعطى نتائج أفضل، ونحن لا تزال لاحظت عدم التوحيد. وبالتالي، فإننا نفضل NP40 لإعادة إنتاجه وجودة وضع العلامات. تسمح الصور الكونفوجكال بإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد للبروتينات النووية. على سبيل المثال، لقد نجحنا في تطبيق هذه الطريقة باستخدام العديد من المسابير المختلفة، الموضحة هنا في مجال MINT داخل النواة، المرتبطة ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية وشبكة المسام النووية. توزيع 3D مثيرة للاهتمام من المسام النووية من هذه النواة spermatocyte متاحة الآن لمزيد من الدراسات. تسمح الصور بالتقيم الكمي القابل للاستنساخ للكولوكاليشن من الخلايا المنوية المختلفة من نفس الخصية ومن الخصيتين المختلفتين. على حد علمنا هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها قياس كمي دقيق من قبل معامل ارتباط بيرسون على مثل هذه العينات. أنه يعطي الثقة المطلوبة لمقارنة مستويات البروتين المناعي دقيقة من الخصيتين مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر ب. فيريجزر، ج. يوهانسن ه. ، أوخورا على الأجسام المضادة وألف ديبيك، ومراكز بلومينغتون وفيينا للأسهم للذباب. بفضل جاكسون جيم للاقتراحات وتحفيز المناقشات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi  VDRC ID 110218 Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI  Thermo D1306 Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps  Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips Fisherbrand 11917744 Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube Thermo AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes  Sigma T3531-200EA  Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1 Citifluor AF1
Dakopen  Sigma Z377821-1EA 
Normal Goat Serum (NGS) Sigma NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4% Sigma P6148-500G  Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml 
PBS 1X Thermo 14190094 DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T  PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,  Sigma T8787
Antibodies
GFP booster Chromotek gba488 1/200
Mouse anti-Mtor 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series  Thermo 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Tags

علم الأحياء، العدد 162، Drosophila Melanogaster، الخصيتين، الخلايا المنوية، Immunofluorescence، المجهر Confocal، صورة 3D، كولوكاليس، نيوكليوبورين، الإقليم النووي، مجمع المسام النووية
الالتصنت المناعي من الخصيتين <em>Drosophila</em> جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raich, N., Contremoulins, V.,… More

Raich, N., Contremoulins, V., Karess, R. E. Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes. J. Vis. Exp. (162), e61061, doi:10.3791/61061 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter