هنا هو بروتوكول لاكتشاف جينات السائق المفرطة في التعبير عن الحفاظ على الخلايا الجذعية السرطان المنشأة المستمدة من خلايا HT29 القولون والمستقيم. تم تنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للتحقيق وفحص شبكات التعبير الجيني لتوضيح آلية محتملة تشارك في بقاء الخلايا السرطانية المستهدفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اكتشاف جينات السائق في الخلايا القولونية HT29 المشتقة من السرطان الجذعية مثل الأورام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا حيويًا ضد العلاجات السريرية، مما يساهم في انتكاس الورم. هناك العديد من الأونكوجينات المشاركة في ورمريجنيسيس وبدء خصائص الجذعية السرطان. وبما أن التعبير الجيني في تكوين أورام الخلايا القولونية المشتقة من سرطان القولون والمستقيم غير واضح، فإن اكتشاف الآليات التي تعمل على جين واحد في كل مرة يستغرق وقتاً. توضح هذه الدراسة طريقة لاكتشاف جينات السائق المشاركة في بقاء الخلايا الجذعية الشبيهة بسرطان القولون والمستقيم في المختبر. تم اختيار الخلايا السرطانية HT29 القولون والمستقيم التي تعبر عن LGR5 عندما مثقف كما spheroids ومرافقة زيادة علامات الجذعية CD133 واستخدامها في هذه الدراسة. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرط في تشكيل HT29 مستقيم مشتقة من الأورام الجذعية مثل. ويمكن للمنهجية أن تفحص تكتشف بسرعة جينات السائق المحتمل في نماذج أمراض أخرى.
المقدمة
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي للوفاة مع ارتفاع معدل انتشار ووفيات في جميع أنحاء العالم1,2. بسبب الطفرات الجينية والتضخيم، تنمو الخلايا السرطانية دون السيطرة التكاثرية، مما يساهم في بقاء الخلايا3، المضادة لتخثر الدم4، والسرطان stemness5،6،7. داخل نسيج الورم، يسمح عدم تجانس الورم للخلايا السرطانية بالتكيف والبقاء على قيد الحياة أثناء العلاجات العلاجية8. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs), مع معدل أعلى من التجديد الذاتي و تعدد القدرات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلية ثقافة وأورام تشكيل
- ثقافة HT29 الخلايا في طبق 10 سم تحتوي على متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين المضادات الحيوية (P/ S).
- تنمو الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة 95٪ في ظل الظروف المتعفنة، حتى تصل إلى 80٪ التقاء.
- تريبسينيز HT29 الخلايا مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية وبالتالي تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
- عد خلايا HT29 باستخدام مقياس الهيموسيت.
- إضافة 2000 خلية / جيدا إلى انخفاض المرفقة 6 لوحات جيدا مع 2 مل من DMEM خالية من المصل مع 1٪ P / S وتكملها مع 0.2٪ B27، 20 نانوغرام....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإنشاء نموذج للتحقيق في آلية في الخلايا الجذعية السرطانية، استخدمت خلايا HT29 القولون والمستقيم لثقافة الأورام السرطانية مثل الجذعية في المختبر في لوحة منخفضة المرفق تحتوي على B27، EGF، bFGF، HGF، وIL6. تشكلت أورام الفيرات > 100 ميكرومتر في القطر في 7 أيام (الشكل 1A). تم تبسينيف الفرُق لخلايا واحدة وتحليلها باستخدام تدفق الخلايا للكشف عن التعبير LGR5 و CD133. LGR5 زيادة في أورام HT29-يقودها من 1.1% إلى 11.4% وتم الكشف عن الخلايا باستخدام عملية استئصال الخلايا تدفق(الش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم استخدام أورام مثل السرطان مثل السرطان المستزرع كنموذج في تحليل بيانات RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة. لنموذج المرض، تم استخدام أورام مشتقة من HT29. لأن الأورام لديها مقاومة للأدوية ضد علاجات الورم، يمكن استخدام النموذج المنشأة للتحقيق في الآليات التفصيلية للمقاومة من خلال التحقيق في الاختلافات في التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، فإن تكنولوجيا الجينوم التي تستخدم RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة توفر فهماً سريعاً لنموذج الدراسة بحيث يمكن التحقق من صحة الجينات المحتملة مع الثقة. أيضا، يمكن تحد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يملك أصحاب البلاغ إقرارات مالية ذات صلة.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون المختبر الأساسي لمختبرات البيولوجيا الإشعاعية التابع لمعهد البحوث الإشعاعية، مستشفى تشانغ جونج التذكاري، على الدعم التقني. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح من مستشفى تشانغ جونج التذكاري (CMRPD1J0321), مستشفى تشنغ هسين العام (هرمون النمو 106-06), ومستشفى ماكاي التذكاري (MMH-CT-10605 وMMH-106-61). ولم يكن لهيئات التمويل أي تأثير في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نظام التصوير الرقمي للخلايا iRiS | Logos Biosystems، Inc | I10999 | لمراقبة تكوين الأورام |
| قياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACSCalibur | للكشف عن LGR5 و CD133 في الأورام |
| المضادة ل LGR5-PE | Biolegend | 373803 | كاشف الكشف عن LGR5 |
| المضاد ل CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 الكاشف |
| EGF | GenScript | Z00333 | لزراعة الكريات السرطانية |
| bFGF | GenScript | Z03116 | لزراعة الأورام |
| HGF | GenScript | Z03229 | لزراعة الأورام |
| IL6 | GenScript | Z03034 | لزراعة الأورام |
| طقم استخراج الحمض النووي الريبي PureLink | Invitrogen | 12183025 | عزل إجمالي الحمض النووي الريبي لتحليل RNAseq |
| أداء RNAseq | الأدوات الحيوية ، يتم إجراء | تحليل RNA التايواني بشكل تجاري بواسطة Biotools ، Ttaiwan | |
| Networkمعهد المحلل | لعلم الطفيليات ، جامعة ماكجيل ، مونتريال ، كيبيك ، كندا | <قوي >http://www.networkanalyst.ca/< / قوي> | |
| برنامج Prism | GraphPad | برنامج تحليل إحصائي |
المراجع
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
