Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Forberedelse af akut humane hippocampale skiver til elektrofysiologiske optagelser

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61085
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

Den præsenterede protokol beskriver transport og forberedelse af resected humant hippocampal væv med det ultimative mål at bruge vitale hjerne skiver som en præklinisk evaluering værktøj til potentielle antiepileptika stoffer.

Abstract

Epilepsi påvirker omkring 1% af verdens befolkning og fører til et alvorligt fald i livskvaliteten på grund af igangværende anfald samt høj risiko for pludselig død. På trods af en overflod af tilgængelige behandlingsmuligheder, omkring 30% af patienterne er resistente. Flere nye terapier er blevet udviklet ved hjælp af dyremodeller, selv om antallet af resistente patienter forbliver uændret. En af de sandsynlige årsager er den manglende oversættelse mellem gnavere modeller og mennesker, såsom en svag repræsentation af humane lægemiddelsendance i dyremodeller. Resected human hjernevæv som en præklinisk evaluering værktøj har den fordel at bygge bro over denne translationelle hul. Beskrevet her er en metode til høj kvalitet forberedelse af menneskelige hippocampal hjerne skiver og efterfølgende stabil induktion af epileptiform aktivitet. Protokollen beskriver induktion af burst aktivitet under anvendelse af 8 mM KCl og 4-aminopyridin. Denne aktivitet er følsom over for etablerede AED-lacosamid eller nye antiepileptiske kandidater, såsom dimethylethanolamin (DMEA). Desuden beskriver metoden induktion af beslaglæggelse-lignende hændelser i CA1 af menneskelige hippocampal hjerne skiver ved reduktion af ekstracellulære Mg2 + og anvendelse af bicucullin, en GABAEn receptor blokker. Den eksperimentelle set-up kan bruges til at screene potentielle antiepileptiske stoffer for deres virkninger på epileptiform aktivitet. Desuden kan virkningsmekanismer, der postuleres for specifikke forbindelser, valideres ved hjælp af denne fremgangsmåde i humant væv (f.eks. ved hjælp af patch-clamp-optagelser). Afslutningsvis vil undersøgelse af vitale humane hjernevæv ex vivo (her, resected hippocampus fra patienter, der lider af tidsmæssig lap epilepsi) forbedre den nuværende viden om fysiologiske og patologiske mekanismer i den menneskelige hjerne.

Introduction

Epilepsi er en af de mest almindelige neurologiske lidelser, der påvirker 1% af verdens befolkning, og er forbundet med øget sygelighed og dødelighed1,,2. Desværre, en tredjedel af patienter, der lider af epilepsi er resistente, på trods af en overflod af tilgængelige behandlingsmuligheder, herunder mere end 20 godkendte antiepileptika (AED' er)3. Manglende oversættelse af resultater fra præklinisk dyreforsøg til kliniske forsøg er en af grundene til, at lovende behandlingsstrategier ikke er effektive hos mange patienter4. For nylig, neuropeptid Y (NPY) og galanin har vist sig at have antiepileptiske virkninger i dyremodeller; men, når testet i resected humant hjernevæv, kun NPY var effektiv5.

De fleste af de eksisterende viden om grundlæggende neurologiske mekanismer og sygdomsterapi tilgange stammer fra dyremodeller og cellekultur eksperimenter. Selv om disse modeller er informative, repræsenterer de kun enkelte aspekter af komplekse sygdomme hos mennesker og det voksne menneskes hjernenetværk. Alternativt har humant hjernevæv potentiale til at bygge bro over den translationelle kløft, men er sjældent tilgængelig for funktionelle undersøgelser. For eksempel, post mortem hjernevæv har været et værdifuldt redskab i at undersøge protein udtryk, hjerne morfologi, eller anatomiske forbindelser, selvom neuronal aktivitet er ofte kompromittereter dettevæv6,7,,8,,9,,10,11.

I modsætning hertil er levende resected human hjernevæv blevet undersøgt vedrørende prækliniske stof evaluering, grundlæggende neuronale funktioner og genekspression mønstre12,13,14,15,16,17. En stor fordel ved menneskelige hjerne skiver i forhold til gnaver skiver er den lange levedygtighed af neuronal væv efter resektion og forberedelse. Sammenlignet med gnavere hjerne skiver, som typisk kan registreres i op til 8 timer efter præparat, menneskelige hjerne skiver viser stabil neuronal aktivitet i op til 72 timer, muliggør grundig undersøgelse af disse sjældne og værdifulde prøver12,18.

Flere undersøgelser har undersøgt egenskaber af epileptiform aktivitet i forskellige områder af resected kortikale og hippocampal humant væv og brugt forskellige metoder til induktion af epileptiform aktivitet. I gnavere skiver, epileptiform aktivitet kan induceres ved flere metoder: elektrisk stimulation af DG hilar celler, stigning i ekstracellulære K+ (8-12 mM KCl), blokering af GABAA receptorer ved bicuculline (BIC), blokering af kalium kanaler ved 4-aminopyridin (4-AP), og fjernelse eller reduktion Mg2 + i ekstracellulær opløsning19. Induktion af epileptiform aktivitet i humant væv kræver imidlertid en kombination af mindst to af ovennævnte metoder20,21,22.

Præsenteret her er en metode til fremstilling af menneskelige hippocampal hjerne skiver, som er levedygtige for op til 20 h og vise induktion af epileptiform aktivitet ved anvendelse af høj K+ (8 mM) og 4-AP eller lav Mg2 + og BIC.

Protocol

Patienterne skal give informeret skriftlig tilladelse forud for operationen, og nødvendige etiske aftaler skal være på plads forud for forsøget. Med hensyn til de repræsentative resultater blev alle undersøgelser, der omfattede deltagere hos mennesker, gennemgået og godkendt af Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA2/111/14).

1. Udarbejdelse af 10x løsninger

BEMÆRK: På grund af vanskeligheder med at planlægge adgang til humant hjernevæv anbefales det at forberede 10x løsninger som beskrevet her. Alternativt kan de endelige 1x-opløsninger fremstilles frisk ved at tilsætte enkelte stoffer i slutkoncentration til dobbeltdestilleret vand (ddH2O).

  1. For individuelle 10x-opløsninger tilsættes stoffer til ddH2O i henhold til tabel 1, og der omrøres, indtil de er opløst.
  2. Brug 10x opløsninger op til 1 måned efter tilberedningen (op til 1 år for frossen 10x cholin aCSF).
  3. For 10x cholin aCSF tilberedes 50 ml aliquots på 10x 1,1 cholin aCSF (tabel 1) og fryses ved -20 °C eller -80 °C indtil videre brug.
    BEMÆRK: Tilsæt ikke glukose og CaCl2 til 10x 1.1 cholin aCSF for at forhindre forurening med bakterier og udfældning af calciumcarbonat.
  4. 10x løsning 2 kan bruges til alle 1x endelige løsninger, mens 10x løsninger 1.1–1.4 er tilpasset og navngivet i overensstemmelse hermed (Tabel 1).

2. Udarbejdelse af 1x endelige løsninger

BEMÆRK: De endelige 1x-opløsninger skal tilberedes friske eller tidligst som muligt dagen før brug. Alle slutopløsninger skal carbogeneres med 5% CO2 og 95% O2 ved hjælp af en glasgassprisker til at berige opløsninger med ilt, og justere pH til 7,4 (max = 7,4 ± 0,2).

  1. Cholin aCSF til transport og tilberedning
    1. For den endelige 500 ml opløsning optøes en 50 ml aliquot af 10x opløsningen 1,1 aliquot for cholin aCSF i 37 °C vandbad.
    2. Den optøede 50 ml aliquot af 10x opløsningen 1.1 og 50 ml 10x opløsning 2 til ca. 300 ml ddH2O.
    3. Der tilsættes endelige koncentrationer af glucose og CaCl2, hvorrøres, indtil de er opløst ( tabel1, opløsning 1.1).
    4. DdH2O til et endeligt volumen på 500 ml og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    5. Du kan også bruge et filter til at sterilisere opløsningen (se diskussionen om forlænget skivens levedygtighed under sterile forhold).
    6. Fyld en separat flaske med ca. 100 ml 1x cholin aCSF til transport fra operationsrummet til laboratoriet.
    7. Valgfrit: Afhængigt af transporttiden fra operationsstuen til laboratoriet skal du overveje at bruge gastætte flaskehætter for at sikre stabil pH-pH i ACSF i længere transportperioder.
    8. Den endelige opløsning opbevares ved 4-8°C indtil videre brug.
    9. På operationsdagen skal 1x cholin aCSF på is og carbogen i mindst 10-15 min. køles ved hjælp af en glasgassprisker, der er tilsluttet carbogen-gas (5% CO2,95% O2).
      BEMÆRK: Overvej at holde en gasflaske tilgængelig for operationsrummet i tilfælde af længere ventetider, hvilket vil kræve re-carbogening af transportløsningen. Men vi har transporteret hippocampal væv uden re-carbogenation før lange og korte transporttider (15 min vs. 60 min) og observerede ikke forskelle i induktion af epileptiform aktivitet.
  2. aCSF til opbevaring og optagelse
    1. For en endelig 2 L-opløsning tilsættes 200 ml 10x opløsning 1,2 (aCSF) og 200 ml 10x opløsning 2 og glucose (tabel 1) til ~1500 ml ddH2O.
      BEMÆRK: Mængden af de endelige løsninger afhænger af de anvendte eksperimenter og den type kammer, der anvendes til opbevaring og registrering.
    2. DdH2O til et endeligt volumen på 2 L og mål osmolaritet (300 mOsm ±10 mOsm).
    3. Forvarm opløsningen til 35 °C og carbogenate i mindst 10-15 min før brug.
  3. HighK++4-AP ACSF til induktion af burst aktivitet
    1. For en endelig 1 L-opløsning tilsættes 100 ml 10x opløsning 1,3 (highK++4-AP aCSF) og 100 ml 10x opløsning 2 til ~ 700 ml ddH2O.
    2. Der tilsættes glucose og 4-AP (slutkoncentration = 100 μM) i henhold til tabel 1.
    3. DdH2O til slutvolumen på 1 L og mål osmolaritet (300 mOsm ±10 mOsm).
    4. Forvarm opløsningen til 35 °C og carbogenate i mindst 10-15 min før brug.
  4. LowMg2++BIC aCSF til induktion af anfaldslignende hændelser (SLEs)
    1. For en endelig 1 L-opløsning tilsættes 100 ml 10x opløsning 1,4 (lowMg2++BIC aCSF) og 100 ml 10x opløsning 2 til ~700 ml ddH2O.
    2. Der tilsættes glucose og BIC (slutkoncentration = 10 μM) i henhold til tabel 1.
    3. DdH2O til slutvolumen på 1 L og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Forvarm opløsningen til 35 °C og carbogenate i mindst 10-15 min før brug.

3. Forberedelse af grænsefladekammer

  1. I et grænsefladekammer hviler udsnit på tre lag filterpapir for at sikre tilstrækkelig mængde opløsning under skiven. For at gøre dette, skæres to ~ 4 cm x ~ 2 cm stykker filterpapir for hver skive-bedrift rum (den beskrevne interface kammer består af to rum) og placere dem oven på hinanden.
  2. Placer tynde bomuldsstrenge omkring de 4 cm x 2 cm filterpapirer inde i rummene for at bryde spændingen ved opløsningen. Sørg for jævn strøm (her, sort nylon strømpebukser skåret til tynde-cut strenge ~ 10 cm i længden anvendes; for placering, se figur 1).
  3. Placer små stykker filterpapir oven på de større filterpapirer i de små dele. Små filtervæv stykker bør være omtrent på størrelse med en hjerne skive (~ 1,5 cm x ~ 1,0 cm) og vil muliggøre yderligere håndtering af de enkelte skiver. Placer tre til fire små filterpapirstykker i hvert rum.
  4. Sørg for en aCSF strømningshastighed på 1,8 ml/min. med en peristaltisk pumpe.
  5. Carbogenate og prewarm grænsefladen kammer til ~ 35 °C (sluttemperaturen af skiven skal være ~ 32 °C).

4. Opsætning af forberedelsesområde

BEMÆRK: Præparatet kan udføres under sterile forhold for at undgå kontaminering og forlænge snittets overlevelse. Det er dog ikke alle vibratomer, der passer ind under en steril hætte, og der kræves andre foranstaltninger for at reducere kontaminering under tilberedningen. I dette afsnit beskrives nogle af disse foranstaltninger.

  1. Tør forberedelsesområdet af med 70% EtOH og anstænke enten aluminiumsfolie eller sterile dæksler oven på området.
  2. Forbered super lim, to skarpe pincet, en spatel, en skalpel med knive, og en klinge til grov skæring af hjernevævet. Værktøj kan steriliseres før proceduren for at reducere forurening.
  3. Tør pufferbakken og prøvepladen af vibratomen af med 70% EtOH. Når bufferbakken er helt tør, dækkes den med aluminiumsfolie og sættes bakken i isbadet. Isbadet fyldes med knust is og opbevares ved -20 °C, indtil det forberedes.
  4. Tør vibratome og barberbladet af med 70% EtOH, og kalibrer vibratomen for at minimere lodrette vibrationer og vævsskader under udskæringen.

5. Vævsslicing og opbevaring

  1. Umiddelbart efter resektion skal vævet straks i koldt, carbogenated cholin aCSF og transportere hurtigt til laboratoriet.
    FORSIGTIG: Brug handsker og en ansigtsmaske på alle tidspunkter under forberedelse, da humant hjernevæv kan indeholde potentielle patogener. Desuden, iført en ansigtsmaske, når de ikke arbejder under en steril hætte i høj grad reducere forurening af opløsninger og hjernevæv.
  2. Fjern væv fra cholin aCSF og skæres væk eventuelle brændte dele af væv.
  3. Skær en jævn overflade til lim væv stykke på prøven plade, mens overvejer skærevinkel og væv lag. Ideelt set indeholder en hippocampal skive DG, CA1-4 og (hvis det er muligt) subiculum.
  4. Skær hjernevævet i 400 μm tykke skiver og juster amplituden og hastigheden under opskæring. På grund af mulige resterende pia mater, human hjernevæv viser mere modstand og kan kræve langsommere skæring.
    BEMÆRK: Skivetykkelse påvirker i høj grad enten det tilgængelige netværk (flere neuroner i tykkere skiver) eller skivens levedygtighed (indtrængning af opløsningen i skiven). Vi har brugt 500 μm skiver til at øge det potentielt tilgængelige mikronetværk, og kunne ikke observere forskelle i induktion af epileptiform aktivitet. 300 μm skiver er almindeligt anvendt til patch-clamp eksperimenter, selv om induktion af epileptiform aktivitet i disse skiver endnu ikke er blevet testet her. Vi bruger 400 μm som en standard skive tykkelse, selvom 300-500 μm skiver kan være tilstrækkelig.
  5. Før indsamling, bruge en skalpel til at reducere størrelsen af hjernen skiver til at passe ind i optagekammeret. For brug af membrankammeret (se afsnit 6) skal skiverne maksimalt være 1,5 cm x 1 cm. Samtidig med at de specifikke lag og forbindelser, der skal være nødvendige for optagelse (f.eks. til optagelse i CA1 og GD, skal subiculum og omgivende hvidt væv skæres væk).
  6. Brug en spatel og små kraftvipper, omhyggeligt placere skiver i grænsefladen kammer på små filterpapirer og lad dem hvile i ~ 1 time i aCSF indtil optagelse.
  7. Skiver kan registreres i op til 20 timer (endnu længere, når under sterile forhold).

6. Registrering af epileptiform aktivitet

  1. I membrankammeret (neddykket type optagelse kammer), placere hjernen skive på en gennemsigtig semipermeable membran, som er limet til en plastik ring24. Til dette skal du bruge super lim til at fastgøre plastringen til membranen i en cellekulturindsats.
  2. Brug en skalpel til at fjerne enhver membran på ydersiden af plastringen. Sørg for, at membranen er jævn og helt fastgjort til ringen, før membranen anbringes i kammeret.
    BEMÆRK: Membranen kan opbevares i ddH2O ved 4-8 °C og genbruges i op til 1 måned. Hold membranen våd hele tiden.
  3. Både ind- og udstrømningen af membrankammeret er forbundet med rør til løsningsforsyning. Anlæg rørene i en peristaltisk pumpe, så ind- og udstrømningen bevæger sig i modsatte retninger.
  4. Anlæste ind- og udstrømningsrøret i carbogeneret, forvarmet aCSF, indtil alle rør og kammeret er fyldt med opløsning. Juster hastigheden på den peristaltiske pumpe for at opnå en jævn strømningshastighed på 10-13 ml/min.
    BEMÆRK: Det membrankammer, der anvendes her, er et højt strømningshastighedssindvandret24optagelseskammer, der muliggør en opløsningsstrøm på op til 14 ml/min. I tilfælde af brug af et andet neddykket typeregistreringskammer skal strømningshastighederne justeres. Men for induktion af epileptiform aktivitet, anbefales det stærkt at bruge membrankammeret.
  5. Brug et varmeelement, der er forbundet til indstrømningen i umiddelbar nærhed af membrankammeret, for at sikre en stabil temperatur på 32 °C.
  6. Forbered 1-2 MΩ glaspipetter ved hjælp af en lodret puller. Fyld pipetter med 154 mM NaCl opløsning og læg dem i en elektrodeholder.
  7. Brug en pincet og en spatel, fjerne en hippocampal skive fra grænsefladen kammer ved at tage skiven med det lille filter papir og placere både i en petriskål fyldt med carbogenated aCSF. Fjern det lille filterpapir fra hippocampalsk skiven, og påfør (om nødvendigt) en vis kraft ved hjælp af en pipette til at adskille skiven fra filterpapiret. Pas på ikke at vende skiven.
  8. Placer udsnittet i optagekammeret, og hold det på plads ved hjælp af udsnitsmaske.
    BEMÆRK: På grund af Bernoulli's princip, i den anvendte neddykket type membran kammer, skiver er normalt stabile uden brug af en ekstra skive mesh.
  9. Placer elektroder i regionen og lag af interesse (her, CA1) og begynde optagelse.
  10. Optag feltpotentiale aktivitet i den aktuelle klemmetilstand med en samplinghastighed på 10-20 kHz og low-pass filtreret ved 2 kHz.
  11. Optag basal aktivitet i aCSF i op til 5 min.
  12. Skift indstrømningsrørene fra aCSF til highK++4AP eller lowMg2++BIC aCSF og udstrømningsrøret til en affaldsbeholder for at forhindre blanding af opløsninger. Efter 2 min, anstænkes udstrømningsrøret i samme opløsning som indstrømningen for at spare opløsning.
  13. Burst aktivitet induceret af highK++4-AP skal være synlig 2-5 min efter vask i. Induktion af SLEs ved lowMg2++BIC kan dog tage op til 30 min. Hvis det er nødvendigt, ændre placeringen af elektroder omhyggeligt for at opnå optimale resultater.
  14. Når baselineaktiviteten er i den endelige position, skal du registrere baseline-aktiviteten i mindst 20 min. Hvis du optager SLE'er, skal du overveje længere startoptag på grund af lav frekvens af SLE'er.
  15. I tilfælde af, at baseline aktivitet er stabil (plateau af begivenhed frekvens), vask i det ønskede lægemiddel. Bemærk, at på grund af den høje flowhastighed vask i narkotika tager kun 2-5 min, giver mulighed for hurtig løsning udveksling.
  16. Optag aktivitet under anvendelse af lægemidlet på mindst 20 min, efter udvaskning. Aktiviteten skal være stabil i mindst 60-90 min. hvilket giver mulighed for længere optagelser.

7. Analyse

  1. Analyse af frekvens og amplitude kan udføres med enhver tilgængelig software. Indtil videre har vi ikke været i stand til at etablere en pålidelig automatisk analyse af SLEs eller burst aktivitet, og i stedet brugt en semi-automatiseret analyse med visuel bekræftelse af identificeret aktivitet.
  2. Burst-aktivitet er karakteriseret ved bifasisk, positiv og negativ afbøjning og en varighed på ≥100 ms. Alle hændelser, der visuelt identificeres som burst-aktivitet (f.eks. halvautomatisk ved tærskelanalyse), skal angives manuelt til yderligere analyse af hændelsesfrekvensen (inter-event interval, IEI), amplitude og det samlede antal hændelser i den analyserede tidsramme.
    BEMÆRK: På grund af den høje frekvens af burst aktivitet, de sidste 5 min af hver ansøgning fase er typisk analyseret20.
  3. SlEs kan analyseres som beskrevet i Heuzeroth et al. Identificerede SLEs kan analyseres yderligere for varighed, amplitude, spike frekvens, og varigheden af tonic (høj frekvens spiking) vs clonic (lav frekvens spiking) fase varighed. SlEs, der er <10 s i varighed, bør udelukkes fra analysen.
    BEMÆRK: Til præklinisk vurdering af mulige antiepileptika stoffer undersøges virkningerne på burst-aktiviteten (induceret af highK++4AP) på grund af etableret induktion i resected hippocampal væv. Foreløbige resultater af induktion af små og små og små og småogsmå og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små ogsmåog små og

Representative Results

Epileptiform aktivitet er blevet registreret med succes i resected humant hippocampal væv fra op til 15 patienter. Etablering af stabile transport- og tilberedningsprocedurer er afgørende for vellykket induktion af epileptiform aktivitet i humant hjernevæv. Nyligt offentliggjorte resultater har vist 1) stabil induktion af epileptiform aktivitet i resected væv af forskellige patienter samt 2) brugen af resected human hjernevæv som et præklinisk værktøj til evaluering af nye antiepileptiske mekanismer14,20.

Anvendelse af highK++4-AP induceret epileptiform aktivitet i form af burst aktivitet inden for et par minutter(Figur 2A,B, C, D). På grund af lav neuronal fordeling i humant hippocampalvæv eller højt neuronal celletab på grund af temporal lap epilepsi (TLE), placering af elektroder kan justeres i begyndelsen af optagelsen. I tilfælde, hvor burst aktivitet af skiver ikke er synlig i CA1 området efter 10 min (uafhængig af elektrode placering), skive levedygtighed kan blive kompromitteret, og skiven skal udskiftes.

SlEs, med en varighed på >10 s, kan induceres med anvendelse af lowMg2 ++BIC (Figur 2E,F). Figur 2E viser stabil induktion af SLE'er efter et par minutter og stabil frekvens under hele optagelsen. Her blev SLE-aktiviteten med succes induceret i to af fire skiver fra den undersøgte patient. En skive viste kun burst aktivitet efter 15 min af SLE aktivitet, mens den anden skive ikke viser SLEs selv efter 40 min.

Til præklinisk vurdering af stofvirkninger blev der undersøgt en potentiel antiepileptisk effekt på burst-aktivitet forårsaget af highK++4-AP. Kendte og potentielle antiepileptikade stoffer (lacosamid, DMEA, dynorphin14) blev testet, og her vises eksempler for det konventionelle AED-lacosamid (en natriumkanalblokker) samt DMEA (et nyt potentielt antiepilepttisk stof)20. Antallet af hændelser og inter-event interval (IEI) af burst begivenheder faldt både under anvendelsen af lacosamid og DMEA (Figur 3C), selv amplituder var for det meste upåvirket (Figur 3D). I en delmængde af skiver, selv om induktion af burst begivenheder blev opnået i de første par minutter, hyppigheden af aktiviteten ikke inddrive under vask ud af påførte AED'er (data ikke vist her, se Kraus et al.20). Her blev de anvendte lægemidler anset for at fremkalde virkninger; fald i burst-aktivitet kan dog være blevet påvirket af den gradvise forfald i aktiviteten under lange optagelser. Resultaterne skal således fortolkes omhyggeligt.

Figure 1
Figur 1: Grænsefladekammer. Til opbevaring af menneskelige hippocampal hjerne skiver, en grænseflade kammer med to hjerne skive bedrift rum anvendes (A); specifikt et grænsefladekammer af Typen Haas23. Her hviler hippocampale hjerneskiver på (d) tre lag filterpapir, (e) mindre stykker, der gør det muligt at håndtere individuelle hjerneskiver, og(f)større filterpapirstykker for at sikre et tilstrækkeligt lag opløsning under skiven. (c) En bomuldsstreng omkring hjerneskiverne, oven på filterpapirerne, sikrer, at jævn opløsning flyder fra indløbene i (a)toppen af rummet. bb) Et dæklåg dirigerer ilt fra underrummet til skiven. (B) Øverste visning af et skivesebæltrum. (C) Sidevisning for at illustrere lagene af filterpapir. g)Bunden af kammeret. hh) Rør til opløsningstilstrømning, som er forbundet til en peristaltisk pumpe (blå pile markerer opløsningsflowets retning). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Epileptiform aktivitet i menneskelige hippocampal skiver induceret af highK++4-AP og lowMg2 ++BIC. CA1 eksempel optagelser og uddrag af anvendelsen af highK+ (8 mM)+4-AP (100 μM) (A,B,C,D) og lowMg2++BIC (10 μM) (E,F). (A) Bad anvendelse af highK++4-AP inducerer epileptiform aktivitet inden for et par minutter, og aktiviteten er stabil i mindst 60 min. Detaljer (A) kan ses i (B). Der induceres to forskellige typer aktiviteter i CA1-området af humane hippocampale skiver: interictal-lignende pigge (C, detaljer om [B]) og burst aktivitet (D, detaljer om [B]). Burst aktivitet viste sig at være følsomme over for antiepileptika og derfor analyseret for effekten af potentielle antiepileptika stoffer (Figur 3). (E,F) Anvendelse af lowMg2++BIC inducerer SLE'er i en varighed af >10 s (F) i CA1 inden for få minutter. Induktion af SLEs kan dog tage op til 30 min i andre skiver. Skalastænger = 0,2 mV, 2 min (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 min (E) og 2 s (F). Dette tal er blevet tilpasset fra Kraus et al.20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fald i epileptisk burst aktivitet af menneskelige skiver under anvendelse af lacosamid eller DMEA. Burst aktivitet faldt under anvendelse af (A) lacosamid og(B)DMEA, en potentiel ny antiepileptisk molekyle. (A) og (B) viser eksemplariske optagelser af CA1-området med uddrag af regioner, der anvendes til analyse i (C) og (D). Burst aktivitet faldt under lacosamid (100 μM) og DMEA (10 mM) ansøgning, som det ses af midterste uddrag og stiger igen under udvaskning. (C,D) Antal og amplitude burst-aktivitet blev analyseret i de sidste 5 minutter af hver applikationsfase (baseline, lacosamid/DMEA, udvasket) og vist som opsummerede resultater for alle patienter (antal hændelser, C; amplitude, D) som middel ± SD. Hver prik angiver én patient. Stjerneter markerer betydelige forskelle som vurderet ved enten Friedman test og post-hoc med Dunnetts multiple sammenligning af grupper til analyse af lacosamid ansøgning (* p < 0,05, n = 4) eller ved gentagen måling ANOVA og post-hoc med Tukey's sammenligning for analyse af DMEA ansøgning (**p < 0,01, n = 10). Skalabarer = 0,2 mV, 2 min (fuld optagelse, A), 5 s (uddrag, A), 3 min (fuld optagelse, B) og 1 s (uddrag, B). Dette tal er blevet tilpasset fra Kraus et al.20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Løsning 1,1 cholin aCSF
Stof 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Bemærk
cholin Cl 1100 110
(+)-Na L-ascorbate 116 11.6
MgCl2x6H2O 70 7
Na pyruvat 31 3.1
KCl 25 2.5
NaH2PO4 12.5 1.25
NaHCO3 260 26
CaCl2 - 0.5 føje til den endelige løsning
Glukose - 10 føje til den endelige løsning
Løsning 1,2 aCSF
Stof 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Bemærk
Nacl 1290 129
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 30 3
MgSO4 18 1.8
Glukose - 10 føje til den endelige løsning
Løsning 1,3 highK++4-AP aCSF
Stof 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Bemærk
Nacl 1240 124
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 80 8
MgSO4 18 1.8
Glukose - 10 føje til den endelige løsning
4-AP - 0.1 føje til den endelige løsning
Løsning 1,4 lowMg2++BIC aCSF
Stof 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Bemærk
Nacl 1300 130
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 30 3
Glukose - 10 føje til den endelige løsning
Bic - 0.01 føje til den endelige løsning
Løsning 2
Stof 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Bemærk
NaHCO3 210 21

Tabel 1: Klargøring af 10x og endelige 1x-opløsninger til transport, klargøring og optagelse.

Discussion

Levende resected human hjernevæv er et meget værdifuldt redskab i præklinisk evaluering af AED'er, da det korrekt repræsenterer en intakt menneskelige hjerne mikro-netværk. Den præsenterede protokol beskriver en metode til vævstransport og -forberedelse, som sikrer flodheste i høj kvalitet samt en stabil induktionsmetode til epileptiform aktivitet, der er kritisk for AED-evaluering.

Andre grupper17,20,21 ,22har tidligere påvist undersøgelser af epileptiform aktivitetsamtmetoder til kemisk ellerelektriskinduktion i menneskehjernens skiver . Denne protokol beskriver induktion af stabil burst aktivitet i skiver fra forskellige patienter via anvendelse af høj K++4-AP samt induktion af SLEs i CA1 område via anvendelse af lav Mg2 ++BIC. Det blev konstateret, at induktionen af burst aktivitet er mere konsekvent (80% af testede skiver i 15 patienter) end induktion af små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og brug (50% af testede skiver hos en patient). Indtil videre er induktionen af SLE'er imidlertid kun blevet testet hos én patient. Ikke desto mindre anbefales induktion af små og små og mellemstore enheder ved lav Mg2++BIC, da sles endnu ikke har været i stand til at blive induceret ved hjælp af høj K++4-AP.

Flere undersøgelser har indført metoder til transport og forberedelse af humant hjernevæv og fremhæver ofte tre faktorer, der er afgørende for neuronal overlevelse: transporttid, brugte transportløsninger og opbevaring af betingelser.

For optimal skive levedygtighed, nogle grupper tyder på, at transport af resected hjernevæv være så kort som muligt. Men operationsrum og laboratorier er sjældent i umiddelbar nærhed, hvilket betyder, at skivekvaliteten kan blive kompromitteret på grund af lang transport. Nogle grupper har overvundet denne hindring ved at anvende konstant O2 på løsningen under transport12. Vi har transporteret hjernevæv i korte (max = 15 min) og lange (op til 1 h) perioder uden konstant yderligere O2 forsyning under transport, svarende til andregrupper 18,,25. I disse tilfælde blev der ikke observeret forskelle i vævskvalitet under epileptiform-optagelser. I kommunikation med andre grupper på vores institut, skive kvalitet ikke ændre sig for patch-clamp eksperimenter, enten. I modsætning hertil, varians i vævskvalitet muligvis skyldes skader under operationer, langvarig resektion, og udskæring procedure.

Med hensyn til transport- og skæreopløsning udelader alle offentliggjorte metoder NaCl fra opløsninger til at reducere cellehævelse på grund af osmotisk tryk, svarende til standardproceduren for forsøg med gnaverespatch-clamp. Der er dog indtil videre indført flere erstatninger (dvs. saccharosebaseret aCSF13,22, NMDG-baseret aCSF12,26og cholinbaseret aCSF27). Ting og kolleger introducerede NMDG-baserede aCSF til slice forberedelse i 201426 og senere tilføjet en genopretning protokol, som langsomt genindfører NaCl til skiver28. Men, som beskrevet af Ting et al., neuroner af hjernevæv fremstillet i NMDG-baserede aCSF viser højere membranresistens, hvilket påvirker hele celle forsegling under patch-clamp eksperimenter26. Derfor har vi skiftet fra NMDG-baserede aCSF til brugen af cholin-baserede aCSF20, som giver høj kvalitet skiver til både feltpotentiale og patch-clamp optagelser.

Med hensyn til opbevaring af skiver er det almindeligt accepteret, at grænsefladebetingelser giver optimal iltning, der er afgørende for overlevelsen af langeskiver 18. Men andre grupper viser skive overlevelse i op til 72 timer under neddykkede forhold12. I modsætning til tidligere hypotese, menneskelige hjerne skiver synes at være mere modstandsdygtige over for lav iltning eller oxidativstress i forhold til gnaver skiver. Primært, interface kamre har tidligere været brugt til opbevaring af menneskelige hippocampal skiver, selvom neddykkede betingelser anbefales til vedligeholdelse af menneskelige hjerne skiver i patch-clamp eksperimenter.

Som diskuteret af andre grupper, en yderligere kritisk skridt for lange skive overlevelse (interface for <48 h18, nedsænket for <72 h12)er forebyggelse af bakteriel forurening. Gnavere hjerne skiver bruges typisk i elektrofysiologiske optagelser i op til 8 timer, og bakteriel forurening anses ikke for at påvirke skivens levedygtighed i denne periode. Stort antal skiver fremstillet af en resektion og den ualmindelige tilgængelighed af humant hjernevæv fremhæver behovet for at forlænge levedygtigheden af menneskelige hjerne skiver. Denne metode med succes beskriver udarbejdelsen af levende menneskelige hippocampal hjerne skiver, som let kan tilpasses sterile forhold. Men for de optagelser, der udføres her, skive overlevelse strækker sig 20 h var ikke en prioritet.

Registrering i grænsefladekamre har også vist sig at være afgørende for induktion af epileptiform aktivitet såsom SLEs22. Neddykkede forhold, på grund af lav iltning, bruges sjældent til registrering af sles; selv om, de er nødvendige for optisk høj opløsning er nødvendige for patch-clamp eksperimenter. Brugen af en optimeret neddykket type optagelse kammer gør det muligt at optage epileptiform aktivitet (ekstracellulær felt eller enkelt neuron) i menneskelige hjerne skiver, på grund af høj iltning og hurtig lægemiddelapplikation29. Her beskrives metoder og resultater for feltpotentialeoptagelser, men det skal understreges, at patch-clamp-optagelser er blevet udført med succes i muse- og hjerneskiver ved hjælp af dette modificerede optagelseskammer (data ikke vist).

Resected human hjernevæv har en højere translationel værdi i forhold til gnavere modeller. Det repræsenterer et voksent, syge neuronalt netværk, der ikke kan gengives af iPSCs. Men som i ethvert in vitro-system, menneskelige hjerne skiver repræsenterer ikke en intakt menneskelige hjerne. Derudover kan de registrerede neuronale netværk af resected hjernevæv gennemgå betydelige molekylære og funktionelle ændringer på grund af skader under drift eller forberedelse. Udskæringsprocedurer har vist sig at påvirke GABAergic funktion og kan påvirke induktion af epileptiform aktivitet30. Disse begrænsninger bør overvejes, samtidig med at der formuleres en hypotese. Ved test af potentielle antiepileptika bør brugen af forskellige hjerneområder overvejes, da narkotikamål muligvis ikke udtrykkes i alle menneskelige hjerneregioner eller alle patienter. Især hippocampi af TLE patienter viser ofte tegn på hippocampal sklerose ledsaget af svær neuronal celletab. Det anbefales at indhente patientoplysninger om patologiske ændringer og sygdomshistorie, såsom potentiel ildfast mod medicin, og overveje dette under datafortolkning.

Afslutningsvis beskriver denne metode med succes forberedelsen af levende menneskelige hippocampal hjerne skiver og induktion teknikker til registrering af to forskellige typer af epileptiform aktivitet. Da tilgængeligheden af levende humant hjernevæv er sjældent, bør der anvendes optimerede transport- og registreringsforhold for at sikre maksimal effekt fra eksperimenter, der bruger menneskehjernskiver. Det foreslås, at resected human hjernevæv kan bruges som en præklinisk validering værktøj ud over gnaver modeller og cellekultur eksperimenter.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) for fremragende teknisk bistand. P.F. blev finansieret af den tyske forskningsfond (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) under Tysklands Excellence Strategy-EXC-2049-390688087. Dette arbejde er blevet støttet af QUEST Center for Transforming Biomedical Research ved Berlin Institute of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made - see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made - see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818 (2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Tags

Neurovidenskab elektrofysiologi epilepsi udvikling af lægemidler human hippocampus ex vivo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 07/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

Forberedelse af akut humane hippocampale skiver til elektrofysiologiske optagelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U.… More

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter