Целью анализа реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты является оценка окислительного стресса в биологических образцах путем измерения производства продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малониальдегида, с использованием спектрофотометрии видимой длины волны при 532 нм. Описанный здесь способ может быть применен к сыворотке крови человека, клеточным лизатам и липопротеинам низкой плотности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на свою ограниченную аналитическую специфичность и прочность, анализ реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS) широко используется в качестве общей метрики перекисного окисления липидов в биологических жидкостях. Он часто считается хорошим показателем уровня окислительного стресса в биологическом образце при условии, что образец был правильно обработан и сохранен. Анализ включает реакцию продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малондиальдегида (MDA), с тиобарбитуровой кислотой (TBA), что приводит к образованию аддуктов MDA-TBA2, называемых TBARS. TBARS дает красно-розовый цвет, который можно измерить спектрофотометрически при 532 нм. Анализ TBARS проводится в кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C. Чистый MDA нестабилен, но эти условия позволяют высвобождать MDA из MDA bis (диметилацетал), который используется в качестве аналитического стандарта в этом методе. Анализ TBARS является простым методом, который может быть завершен примерно за 2 часа. Подготовка пробирных реагентов подробно описана здесь. Экономные исследователи могут использовать эти реагенты для нескольких экспериментов по низкой цене, а не покупать дорогой набор для анализа TBARS, который позволяет строить только одну стандартную кривую (и, следовательно, может быть использован только для одного эксперимента). Применимость этого анализа TBARS показана в сыворотке крови человека, липопротеинах низкой плотности и клеточных лизатах. Анализ является последовательным и воспроизводимым, и могут быть достигнуты пределы обнаружения 1,1 мкМ. Приведены рекомендации по использованию и интерпретации спектрофотометрического анализа TBARS.
Введение
Перекисное окисление липидов - это процесс, в котором свободные радикалы, такие как активные формы кислорода и активные формы азота, атакуют двойные связи углерод-углерод в липидах, процесс, который включает в себя абстрагирование водорода из углерода и вставку молекулы кислорода. Этот процесс приводит к смешиванию сложных продуктов, включая липидные пероксиловые радикалы и гидропероксиды в качестве первичных продуктов, а также малониальдегид (MDA) и 4-гидроксиноненал в качестве преобладающих вторичных продуктов1.
MDA широко используется в биомедицинских исследованиях в качестве маркера перекисного окисления липидов ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Образцы сыворотки крови человека были получены от добровольцев по согласию с одобрения IRB и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Образцы кодировались и деидентифицировались перед передачей в аналитическую лабораторию.
1. Пробоподготовка
- Лизаты клеток HepG2
- Посейте около 10 х 106 клеток HepG2 на колбу в 16 колбах T75 с 14 мл среды EMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), и выращивайте клетки в течение 2 дней.
- Подготовьте буфер RIPA: в пробирке объемом 50 мл добавьте 1,5 мл 5 M NaCl, 2,5 мл 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 мкл реагента NP-40, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C малониальдегид (MDA) бис (диметилацеталь) дает MDA23. MDA и тесно связанные с ним химические конгенеры реагируют с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты (TBA) с образованием соединений, называемых реакционноспособными веществами тиобарбитуровой кислоты (TBARS), которые придают красно-розовый цвет и имеют поглощение λmax при 532 нм (Рисунок 1, Рисунок 2). Используя MDA bis (диметилацетал.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на свои ограничения1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 и недостаточную пригодность для сравнения между лабораториями, анализ TBARS является одним из
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов для раскрытия.
Благодарности
Исследование, представленное здесь, было частично поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером премии. R33 CA217702 и программа «Инициатива по максимальному развитию студентов» (IMSD). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x Стерильный PBS pH 7,4 1 л | vwr, PA | --262 | реагент для лизиса клеток |
| 50 мл самостоятельная центрифужная пробирка | Corning, NY | CLS430897 | Общий материал |
| 96 луночный планшет, необработанный, прозрачный, с крышкой, нестерильный | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | Для измерения абсорбции |
| Amicon Ultra-0,5 100 kD центробежный спиновой фильтр устройство | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | для очистки ЛПНП |
| для стеклянных пробирок | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | для анализа TBARS |
| Хлорид меди II | SIGMA, MO | 222011-250G | для индуцирования окисления |
| Культуральные пробирки, одноразовые, с завинчивающейся крышкой, боросиликатное стекло (13 x 100 мм) | VWR, PA | 53283-800 | для анализа TBARS |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)) | ATCC, VA | HB-8065 | Клеточная среда HepG2 |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 мл | Eppendorf, Нью-Йорк | 22363204 | Общий материал |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 мл | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | Общий материал |
| Фетальная бычья сыворотка US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | для клеточной культуры |
| Ледяная уксусная кислота | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Реагент |
| Halt Коктейль ингибиторов протеазы (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | реагент для лизиса клеток |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | ЛПНП растворитель |
| HepG2 Клетки | ATCC, VA | HB-8065 | Прототип биологической матрицы |
| Гидрохлорная кислота (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | реагент |
| для лизиса клетокЦентрифуга Legend Micro 17 | Thermo Scientific, MA | 75002431 | Общий материал |
| Липопротеины низкой плотности, плазма человека | Афины Исследования и Технология, GA | 12-16-120412 | Прототип биологической матрицы |
| Магнитные мешалки Бары, восьмиугольник 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | Общий материал |
| Malondialdehyde bis (диметилацеталь) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Стандартный |
| микропланшетный спектрофотометр Multiskan Go | Fisher Scientific, NH | 51119200 | Для измерения поглощения |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | реагент для лизиса клеток |
| Хлорид натрия | SIGMA, MO | S7653-1KG | реагент для лизиса клеток |
| додецилсульфат натрия (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Реагент |
| гидроксид натрия | SIGMA, MO | 367176-2,5KG | TBARS |
| Реагент SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | для концентрирующие клеточные лизаты |
| T-75 Flask, обработанные тканевой культурой, 250 мл, с фильтрующим колпачком | США Scientific, FL | 658175 | клеточной культурой |
| Тиобарбитуровая кислота | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Реагент |
| TRIS основание | Fluka, GA | 93362 | реагент для лизиса клеток |
| Трипсин (1x) | VWR, PA | 16777-166 | Для отделения клеток HepG2 |
Ссылки
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
