Summary
Denne protokol illustrerer 1) isolering og dyrkning af primære fibroblaster fra den voksne muses gastrocnemiusmuskel samt 2) oprensning og karakterisering af exosomer ved hjælp af en differentiel ultracentrifugeringsmetode kombineret med saccharosedensitetsgradienter efterfulgt af western blot-analyser.
Abstract
Exosomer er små ekstracellulære vesikler frigivet af stort set alle celler og udskilles i alle biologiske væsker. Mange metoder er blevet udviklet til isolering af disse vesikler, herunder ultracentrifugering, ultrafiltrering og størrelseseksklusionskromatografi. Imidlertid er ikke alle egnede til storskala eksosomrensning og karakterisering. Skitseret her er en protokol til etablering af kulturer af primære fibroblaster isoleret fra voksne museskeletmuskler, efterfulgt af oprensning og karakterisering af exosomer fra disse cellers kulturmedier. Metoden er baseret på anvendelse af sekventielle centrifugeringstrin efterfulgt af saccharosedensitetsgradienter. Renheden af de exosomale præparater valideres derefter ved western blot-analyser ved hjælp af et batteri af kanoniske markører (dvs. Alix, CD9 og CD81). Protokollen beskriver, hvordan man isolerer og koncentrerer bioaktive exosomer til elektronmikroskopi, massespektrometri og optagelsesforsøg til funktionelle studier. Det kan let skaleres op eller ned og tilpasses til exosomisolering fra forskellige celletyper, væv og biologiske væsker.
Introduction
Exosomer er heterogene ekstracellulære vesikler, der varierer i størrelse fra 30-150 nm. De er etablerede nøgleaktører i fysiologiske og patologiske processer på grund af deres allestedsnærværende fordeling i væv og organer 1,2. Exosomer bærer en kompleks last af proteiner, lipider, DNA-typer og RNA-typer, som varierer alt efter den type celler, hvorfra de stammer 1,2,3. Exosomer er beriget med proteiner, der har forskellige funktioner (dvs. tetraspaniner, herunder CD9 og CD63) er ansvarlige for fusionsbegivenheder. For eksempel er varmechokproteiner HSP70 og HSP90 involveret i antigenbinding og præsentation. Derudover deltager Alix, Tsg101 og flotillin i exosombiogenese og frigivelse og bruges i vid udstrækning som markører for disse nanovesikler 2,3,4.
Exosomer indeholder også en række RNA'er (dvs. mikroRNA'er, lange ikke-kodende RNA'er, ribosomale RNA'er), der kan overføres til modtagerceller, hvor de påvirker nedstrøms signalering3. At være omgivet af en enkelt enhedsmembran afhænger exosombioaktivitet ikke kun af lasten af proteiner og nukleinsyrer, men også på lipidkomponenter i den begrænsende membran1. Exosomale membraner er beriget med phosphatidylserin, phosphatidsyre, kolesterol, sphingomyelin, arachidonsyre og andre fedtsyrer, som alle kan påvirke exosomstabilitet og membrantopologi 2,3. Som et resultat af last- og lipidarrangementet initierer eksosomer signalveje i modtagende celler og deltager i vedligeholdelsen af normal vævsfysiologi 1,2,4,5. Under visse patologiske tilstande (dvs. neurodegeneration, fibrose og kræft) har de vist sig at udløse og udbrede patologiske stimuli 4,6,7,8,9,10,11.
På grund af deres evne til at sprede signaler til nærliggende eller fjerne steder er exosomer blevet værdifulde biomarkører til diagnosticering eller prognose af sygdomstilstande. Derudover er exosomer blevet anvendt eksperimentelt som bærere af terapeutiske forbindelser 2,12. Den potentielle anvendelse af disse nanovesikler i klinikken gør isolationsmetoden stadig vigtigere for at opnå maksimalt udbytte, renhed og reproducerbarhed. Forskellige teknikker til isolering af exosomer er blevet udviklet og implementeret. Generelt kan exosomer isoleres fra konditionerede cellekulturmedier eller kropsvæsker ved differentiel centrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi og immunindfangning (ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits). Hver tilgang har unikke fordele og ulemper, der tidligere er blevet diskuteret 1,2,13,14.
Den skitserede protokol fokuserer på 1) isolering og dyrkning af primære fibroblaster fra voksne mus gastrocnemius muskel og 2) oprensning og karakterisering af exosomer frigivet i kulturmediet af disse celler. En veletableret protokol til isolering af exosomer fra primære fibroblaster til funktionelle undersøgelser mangler i øjeblikket. Primære fibroblaster udskiller ikke store mængder exosomer, hvilket gør isolerings- og rensningsprocessen udfordrende. Denne protokol beskriver oprensningen af store mængder rene exosomer fra store kulturvolumener, samtidig med at deres morfologiske integritet og funktionelle aktivitet opretholdes. Oprensede exosomer opnået fra konditioneret medium er blevet anvendt med succes i in vitro-optagelsesforsøg for at inducere specifikke signalveje i modtagerceller. De er også blevet brugt til komparative proteomiske analyser af exosomale laster fra flere biologiske prøver4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i mus blev udført i henhold til dyreprotokoller godkendt af St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee og National Institutes of Health retningslinjer.
1. Fremstilling af opløsninger og medier
- Forbered fordøjelsesopløsningen ved at blande 15,4 ml PBS med 2,5 ml 20 mg/ml collagenase P (5 mg/ml slutkoncentration), 2 ml 11 E/ml dispase II (1,2 E/ml slutkoncentration) og 100 μL 1,0 MCaCl2 (5 mM slutkoncentration).
- Forbered 500 ml primære fibroblaster medium (DMEM komplet) ved at blande 440 ml DMEM med 50 ml FBS (10%), 5,0 ml pen / strep (henholdsvis 100 U / ml og 100 μg / ml) og 5,0 ml glutamin supplement (2 mM). Filtersteriliser mediet med et vakuumfilter på 0,22 μm porestørrelse.
- Der fremstilles exosomfrit serum ved ultracentrifugering natten over af FBS i 38,5 ml polypropylenrør ved 100.000 x g ved 4 °C, og supernatanten overføres til et nyt glas.
- Forbered 500 ml exosomfrit medium ved at blande 440 ml DMEM med 50 ml exosomfrit serum (10%), 5 ml pen / strep (100 U / ml og 100 μg / ml) og 5 ml glutamintilskud (2 mM). Filtersteriliser mediet med et vakuumfilter på 0,22 μm porestørrelse.
- Forbered 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) ved at opløse 6,057 g Tris-base i 90 ml dH 2 O og justere pH til 7,4 med HCI. Juster lydstyrken til 100 ml med dH2O.
- Der fremstilles 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2-opløsning (saccharosearbejdsopløsning) ved at blande 97,9 mldH2Omed 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) og 100 μL 1 M Mg(Ac)2. Tilsæt proteasehæmmere til opløsningen lige før brug, og opbevar opløsningen på is.
- Der fremstilles saccharosedensitetsgradientopløsninger på is i overensstemmelse med tabel 1. Disse opløsninger er tilstrækkelige til at fremstille to saccharosegradientrør.
- Forbered 100% TCA ved at tilsætte 40 ml dH2O til 100 g TCA pulver og bland, indtil det er helt opløst. Juster det endelige volumen med dH2O til 100 ml.
- Forbered 80% ethanol ved at blande 20 ml dH2O med 80 ml 100% ethanol.
- Forbered western blot løbebuffer ved at blande 1,8 L dH2O med 200 ml 10x løbende buffer.
- Forbered western blot-overførselsbuffer ved at blande 1,4 L dH2O med 200 ml 10x overførselsbuffer og 400 ml methanol. Forafkøl overførselsbufferen til 4 °C.
- Forbered 20x Tris-bufret saltvand (TBS) ved at opløse 122 g Tris-base og 180 g natriumchlorid i 850 mldH2O(pH 8,0). Indstil lydstyrken til 1 L med dH2O.
- Forbered blokerende buffer ved at opløse 5 g fedtfri tør mælk med 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS og 94 ml dH2O.
- Forbered antistofbuffer ved at opløse 3 g BSA med 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS og 94 ml dH2O.
- Forbered vaskebuffer ved at blande 100 ml 20x TBS og 20 ml 10% Tween-20 (10x) med 1,88 L dH2O.
- Forbered udviklingsopløsning ved at blande 1 volumen luminol/enhance med 1 volumen stabil peroxidbuffer.
2. Dissektion af gastrocnemius (GA) musemuskel15,16
- Forbered 50 ml rør indeholdende 10 ml PBS på is.
- Aflive musene i et CO2 kammer efterfulgt af cervikal dislokation.
- Fjern gastrocnemius muskel fra begge ben og overfør dem til røret med PBS på is.
BEMÆRK: Fjern soleus-musklen fra GA-musklen, før du overfører GA-musklen til PBS.
3. Musens primære fibroblastisolering og kultur
- Vej musklerne og overfør dem til en 10 cm skål under en biosikkerhedshætte. Hak musklerne med skalpeller, indtil det bliver en fin pasta.
- Den finthakkede muskelpasta overføres til et 50 ml glas og tilsættes 3,5x volumen/mg væv af fordøjelsesopløsningen til røret og inkuberes i 45 minutter ved 37 °C. Bland suspensionen grundigt med en 5 ml pipet hvert 10. minut (dette vil hjælpe med fuldstændig dissociation).
BEMÆRK: Alternativt kan en vævsdissociator bruges til dette trin. - Der tilsættes 20 ml DMEM komplet til cellesuspensionen for at inaktivere fordøjelsesopløsningen. Overfør til en 70 μm nyloncelle sil placeret på et 50 ml rør. Opsaml gennemstrømningen, og vask cellesien med yderligere 5 ml DMEM komplet.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 300 x g ved stuetemperatur (RT) i 10 min. og supernatanten fjernes forsigtigt.
- Resuspender pellet i 10 ml DMEM komplet og frø cellerne i en 10 cm skål.
- Dyrk cellerne ved 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 (passage 0 eller P0).
BEMÆRK: 1) Disse kulturer skal opretholdes på et lavt iltniveau for at sikre fysiologisk-lignende forhold (O2-niveauet i skeletmuskulatur er omkring 2,5%)17. 2) Passagenummeret (f.eks. P0) for en cellekultur er en registrering af antallet af gange, kulturen er blevet subkultureret. 3) Primære fibroblaster ved P0 dyrkes rutinemæssigt indtil 100% sammenløb plus 1 dag (og kun for P0). Dette er for at rense andre typer celler og sikre, at cellerne til stede i kulturen kun er fibroblaster, udtømt for myogene celler baseret på mikroskopundersøgelse. Skeletmuskulaturen fra et voksent dyr ved 2 måneders alder indeholder ca. 2% myogene forfædre4. Derudover fastgøres myogene forfædre normalt ikke til de ubelagte retter; Derfor går de tabt under subkulturering18,19,20. Myogene celler kræver et andet medium (F10) suppleret med 20% FBS og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF)18. I DMEM komplet har mellemstore fibroblaster en højere spredningshastighed end de myogene celler, hvilket resulterer i eliminering af disse forurenende celler før den første passage. - Skyl P0-cellerne med PBS, når de er 100% sammenflydende plus 1 dag. Tilsæt 1 ml trypsiniseringsopløsning og inkuber ved 37 °C, 5% CO2, 3%O2 for at løsne cellerne. Stop den enzymatiske aktivitet ved at bruge 10 ml DMEM komplet.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 10 minutter ved RT og resuspender pellet i 20 ml DMEM komplet og frø i en 15 cm skål (passage 1 eller P1). Cellerne dyrkes indtil 80%-90% sammenløb og kan udvides indtil passage 3.
BEMÆRK: Afhængigt af nedstrømsforsøgene kan passage 1, passage 2 (P2) eller passage 3 (P3) anvendes.
4. Såning af celler og opsamling af konditioneret medium
- Vask fibroblasterne (P1, P2 eller P3) med 10 ml PBS, tilsæt 2,5 ml trypsiniseringsopløsning til cellerne og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2. Stop enzymatisk aktivitet ved at bruge 10 ml DMEM komplet.
BEMÆRK: Efter passage 4 kasseres primære celler og bør ikke bruges til yderligere forsøg, da de ændrer egenskaber. - Opsaml cellerne og centrifuger ved 300 x g ved RT i 10 minutter.
- Resuspenderet cellepellet i 10 ml exosomfrit medium og tæl cellerne.
- Frø cellerne ved 1,5-2,0 x 106 celler pr. Skål (15 cm) og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2.
- Det konditionerede medium mellem 16-24 timer samles i 50 ml rør på is.
BEMÆRK: Hvis cellerne ikke er 80% sammenflydende, kan frisk exosomale frie medium tilsættes igen og opsamles efter en yderligere periode på 16-24 timer. De to kollektioner kan kombineres til videre bearbejdning.
5. Oprensning af exosomer ved anvendelse af differentiel og ultracentrifugering
BEMÆRK: Alle trin udføres ved 4 °C eller på is. Balancer røret med et rør fyldt med vand, når det er nødvendigt.
- Det konditionerede substrat centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter for at fjerne levende celler, og supernatanten overføres til et nyt 50 ml glas.
- Døde celler fjernes ved centrifugering ved 2.000 x g i 10 minutter og overfør supernatanten til et 38,5 ml polypropylenglas.
- Supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter for at fjerne organeller, apoptotiske legemer og membranfragmenter. Supernatanten overføres til et 38,5 ml ultraklart glas.
- Supernatanten ultracentrifugeres ved 100.000 x g i 1,5 timer for at pelletere exosomerne.
- Supernatanten kasseres forsigtigt, så der efterlades ca. 1 ml konditioneret substrat, og exosompillen vaskes i et samlet volumen på 30 ml iskold PBS.
- Der centrifugeres ved 100.000 x g i 1,5 timer, og supernatanten kasseres forsigtigt ved pipettering, idet man passer på ikke at forstyrre exosomillpelletten.
- Resuspender pellet i iskold PBS (~ 25 μL pr. 15 cm skål) og mål proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-proteinanalysesættet og en mikropladelæser ved 562 nm.
BEMÆRK: Proteinkoncentrationen måles ved en 1:2 fortynding med 0,1% Triton-X100 i dH2O. Udbyttet af exosomer fra en 15 cm skål (20 ml konditioneret medium) af primære fibroblaster ved 80% sammenløb er ~ 3-4 μg.
6. Karakterisering af exosomer ved saccharosedensitetsgradient
- Saccharosegradienten fyldes i et 13 ml ultraklart rør ved pipettering (nedefra og op) af følgende: 1,5 ml 2,0 M, 2,5 ml 1,3 M, 2,5 ml 1,16 M, 2,0 ml 0,8 M og 2,0 ml 0,5 M saccharoseopløsninger.
- Bland 30-100 μg exosomer med 0,25 M saccharoseopløsning og juster lydstyrken til 1 ml.
- Exosomerne lægges forsigtigt oven på gradienterne, og prøverne ultracentrifugeres i 2,5 timer ved 100.000 x g og 4 °C.
- Fjern rørene fra ultracentrifugen og læg dem på is og saml 1,0 ml fraktioner startende fra toppen af gradienten. Overfør dem til 1,7 ml rør på is.
- Tilsæt 110 μL 100% TCA til hvert glas, bland godt og inkuber i 10 minutter ved RT.
- Der centrifugeres i 10 minutter ved 10.000 x g og RT, og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Pellet resuspenderes i 500 μL forkølet 80% ethanol og lades vaske i 10 minutter ved -20 °C.
- Der centrifugeres i 10 minutter ved 10.000 x g og 4 °C, og supernatanten kasseres.
- Tør pelleten i 10-15 minutter ved RT og resuspender pellet i PBS til in vitro-forsøg. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-proteinanalysesæt, eller resuspender pelleten direkte i 14,5 μL dH2O, 5 μL 4x Laemmli buffer og 0,5 μL 1 M DTT til western blot-analyser.
7. Exosomdetektion ved western blot-analyse
- Bland 5-10 μg exosomer fra trin 5.7 med 5 μL 4x Laemmli buffer og 0,5 μL 1 M DTT, og juster derefter det endelige volumen til 20 μL med dH2O. Alle prøver, inklusive dem i trin 6.9, opvarmes i 5 minutter ved 98 °C.
- Læg prøverne i en 10% TGX pletfri gel og læg proteinstigerne i henhold til producentens anbefalinger.
BEMÆRK: Vælg procentdelen af gelen i henhold til molekylvægten af proteinet af interesse. - Kør gelen ved 100 V i ~ 1 time i løbende buffer, indtil påfyldningsfarvestoffet er i bunden af gelen.
BEMÆRK: Driftstiden kan variere afhængigt af det anvendte udstyr eller type og procentdel af gel. - Forestil dig gelen. Billeder af de pletfri geler bruges som belastningskontrol for immunoblots.
- Overfør gelen ved hjælp af en PVDF-membran i 1,5 timer ved 80 V eller natten over ved 30 V ved 4 °C.
- Bloker membranerne i blokerende buffer i 1 time ved RT.
- Membranerne inkuberes for specifikke antistoffer (tabel 2) i antistofbuffer natten over ved 4 °C med omrystning.
- Membranerne vaskes i vaskebuffer og inkuberes membranerne med passende sekundære antistoffer (tabel 2) i 1 time ved RT under omrystning.
- Vask membranerne i vaskebuffer og afbild membranerne ved hjælp af udviklingsopløsning og et kamerabaseret kamera. Alternativt kan du bruge en røntgenfilm til at udvikle membranerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er egnet til rensning af exosomer fra store mængder konditioneret medium på en omkostningseffektiv måde. Proceduren er meget reproducerbar og konsekvent. Figur 1 viser transmissionselektronmikroskopi (TEM) billede af exosomer renset fra dyrkningsmediet af musens primære fibroblaster. Figur 2 viser proteinekspressionsmønsteret for kanoniske exosomale markører og fraværet af cytosoliske (LDH) og ER (calnexin) proteinforurenende stoffer. Figur 3 viser fordelingen af kanoniske exosomale markører (Alix, CD9 og CD81) efter saccharosedensitetsgradienter.
Figur 1: Repræsentativt TEM-billede af exosomer isoleret fra dyrkningsmedium af musens primære fibroblaster. Vist er de relativt ensartede størrelser af disse nanovesikler. På tværs af sorte linjer angiver diameteren af de enkelte vesikler. Skala bar = 100 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunoblots af exosomlysater undersøgt med antistoffer mod exosom-, cytosoliske og ER-markører. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (exosom), cytosoliske (LDH) og ER (calnexin) markører. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Exosomer adskilt af en saccharosedensitetsgradient. Individuelle fraktioner blev undersøgt på en western blot med antistoffer mod Alix, CD9 og CD81. Baseret på markørernes fraktioneringsmønster sedimenterer exosomer konsekvent i fraktioner 3-6, hvilket svarer til densiteter på 1.096-1.140 g / ml. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Saccharose (g) | Saccharose arbejdsløsning (ml) | |
| 2,0 m | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 m | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 m | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 m | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 m | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 m | 0.26 | 3.0 |
Tabel 1: Opløsninger af saccharosedensitetsgradient.
| Antistof | Vært | Firma | Katalognummer |
| CD9 | Rotte | BD Biovidenskab | 553758 |
| CD81 | Mus | Santa Cruz Bioteknologi | SC-166029 |
| Alix | Kanin | d'Azzo laboratorium | Alix |
| Flotilin1 | Mus | BD Biovidenskab | 610820 |
| Syndecan1 | Kanin | Life Teknologier | 36-2900 |
| Syntenin1 | Kanin | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH | Ged | Chemicon | AB1222 |
| Calnexin | Ged | Santa Cruz Bioteknologi | SC-6465 |
| rotte-HRP | Æsel | Jackson Imm. Res Lab | 112-035-003 |
| Mus-HRP | Ged | Jackson Imm. Res Lab | 115-035-044 |
| Kanin-HRP | Ged | Jackson Imm. Res Lab | 111-035-144 |
Tabel 2: Primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skridt for en vellykket isolering af exosomer fra kulturmedierne, som skitseret i denne protokol, er korrekt etablering og vedligeholdelse af primære musefibroblastkulturer fra voksne skeletmuskler. Disse kulturer skal opretholdes på et lavt iltniveau for at sikre fysiologisk-lignende forhold (O2-niveau i skeletmuskulatur er ~ 2,5%)15. Primære fibroblaster vil ændre egenskaber, når de overføres i kultur for mange gange. Derfor er et lavt passagetal afgørende for ideelt eksosomudbytte. Renset exosomer bør enten anvendes straks til forsøgsformål eller opbevares frosset i alikvoter ved -80 °C, indtil det er nødvendigt. Et andet vigtigt skridt i protokollen er brugen af saccharoseopløsninger, der tilberedes friske hver gang. En begrænsning af metoden er, at den er tidskrævende, fordi primære fibroblaster generelt ikke udskiller store mængder exosomer, ligesom andre sekretoriske celler. Derfor bør der anvendes store kulturer, hvilket resulterer i store mængder konditionerede medier, der skal behandles.
Fordelen ved differentiel centrifugering, der anvendes her, er, at den repræsenterer en skalerbar tilgang (op til liter) og er den valgte metode til at isolere exosomer fra primære fibroblaster. En alternativ metode til større mængder (op til 100 ml pr. kolonne) er størrelsesekskluderingskromatografi (SEC). Denne metode er hurtig og kan adskille proteiner fra exosomer. Søjlen pelleterer ikke exosomer, så yderligere koncentrations- eller centrifugeringstrin er påkrævet. En af ulemperne ved SEC-metoden er, at søjlen kan tilstoppes over tid og overbelastes. Andre nuværende metoder er baseret på anvendelse af små mængder biologiske væsker (dvs. urin, CSF, serum, plasma) og kommercielt tilgængelige kits. Selvom disse sæt sikrer reproducerbarhed, er de dyre og producerer ikke altid et højt udbytte af rene exosomer. Den skitserede protokol for exosomrensning er ligetil og kan anvendes på forskellige typer celler, hele væv og organer eller andre biologiske væsker afhængigt af det eksperimentelle behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo har Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair i genetik og genterapi. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH-tilskud R01GM104981, RO1DK095169 og CA021764, Assisi Foundation of Memphis og American Libanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
