Summary
Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.
Abstract
Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die von praktisch allen Zellen freigesetzt und in allen biologischen Flüssigkeiten sezerniert werden. Für die Isolierung dieser Vesikel wurden viele Methoden entwickelt, darunter Ultrazentrifugation, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie. Allerdings eignen sich nicht alle für die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen in großem Maßstab. Hier wird ein Protokoll für die Etablierung von Kulturen primärer Fibroblasten beschrieben, die aus adulten Skelettmuskeln von Mäusen isoliert wurden, gefolgt von der Reinigung und Charakterisierung von Exosomen aus den Kulturmedien dieser Zellen. Die Methode basiert auf der Verwendung von sequentiellen Zentrifugationsschritten, gefolgt von Saccharosedichtegradienten. Die Reinheit der exosomalen Präparate wird dann durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung einer Reihe von kanonischen Markern (d. h. Alix, CD9 und CD81) validiert. Das Protokoll beschreibt, wie bioaktive Exosomen für Elektronenmikroskopie, Massenspektrometrie und Aufnahmeexperimente für funktionelle Studien isoliert und konzentriert werden. Es kann leicht nach oben oder unten skaliert und für die Exosomenisolierung aus verschiedenen Zelltypen, Geweben und biologischen Flüssigkeiten angepasst werden.
Introduction
Exosomen sind heterogene extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von 30 bis 150 nm. Sie sind aufgrund ihrer ubiquitären Verteilung in Geweben und Organen etablierte Schlüsselakteure in physiologischen und pathologischen Prozessen 1,2. Exosomen tragen eine komplexe Fracht von Proteinen, Lipiden, DNA-Typen und RNA-Typen, die je nach Art der Zellen, von denen sie stammen, variieren 1,2,3. Exosomen sind mit Proteinen angereichert, die unterschiedliche Funktionen haben (z. B. Tetraspanine, einschließlich CD9 und CD63), die für Fusionsereignisse verantwortlich sind. Zum Beispiel sind die Hitzeschockproteine HSP70 und HSP90 an der Antigenbindung und -präsentation beteiligt. Darüber hinaus sind Alix, Tsg101 und Flotillin an der Biogenese und Freisetzung von Exosomen beteiligt und werden häufig als Marker dieser Nanovesikel verwendet 2,3,4.
Exosomen enthalten auch eine Vielzahl von RNAs (d. h. microRNAs, lange nicht-kodierende RNAs, ribosomale RNAs), die auf Empfängerzellen übertragen werden können, wo sie die nachgeschaltete Signalübertragung beeinflussen3. Da die Bioaktivität des Exosoms von einer einzigen Membran umschlossen ist, hängt sie nicht nur von der Ladung von Proteinen und Nukleinsäuren ab, sondern auch von den Lipidkomponenten der begrenzenden Membran1. Exosomale Membranen sind mit Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Cholesterin, Sphingomyelin, Arachidonsäure und anderen Fettsäuren angereichert, die alle die Stabilität des Exosoms und die Membrantopologie beeinflussen können 2,3. Als Ergebnis der Ladungs- und Lipidanordnung initiieren Exosomen Signalwege in aufnehmenden Zellen und sind an der Aufrechterhaltung der normalen Gewebephysiologie beteiligt 1,2,4,5. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen (z. B. Neurodegeneration, Fibrose und Krebs) hat sich gezeigt, dass sie pathologische Reize auslösen und verbreiten 4,6,7,8,9,10,11.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Signale an benachbarte oder entfernte Orte weiterzugeben, sind Exosomen zu wertvollen Biomarkern für die Diagnose oder Prognose von Krankheiten geworden. Darüber hinaus wurden Exosomen experimentell als Vehikel therapeutischer Verbindungenverwendet 2,12. Durch die potenzielle Anwendung dieser Nanovesikel in der Klinik wird die Isolierungsmethode immer wichtiger, um maximale Ausbeute, Reinheit und Reproduzierbarkeit zu erreichen. Verschiedene Techniken zur Isolierung von Exosomen wurden entwickelt und implementiert. Im Allgemeinen können Exosomen aus konditionierten Zellkulturmedien oder Körperflüssigkeiten durch Differentialzentrifugation, Größenausschlusschromatographie und Immuneinfang (unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits) isoliert werden. Jeder Ansatz hat einzigartige Vor- und Nachteile, die bereits erörtert wurden 1,2,13,14.
Das skizzierte Protokoll konzentriert sich auf die 1) Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Gastrocnemius-Muskel der Maus und 2) die Reinigung und Charakterisierung von Exosomen, die von diesen Zellen in das Kulturmedium freigesetzt werden. Ein gut etabliertes Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus primären Fibroblasten für funktionelle Studien fehlt derzeit. Primäre Fibroblasten sezernieren keine großen Mengen an Exosomen, was den Isolierungs- und Reinigungsprozess zu einer Herausforderung macht. Dieses Protokoll beschreibt die Aufreinigung großer Mengen reiner Exosomen aus großen Kulturvolumina unter Beibehaltung ihrer morphologischen Integrität und funktionellen Aktivität. Gereinigte Exosomen, die aus konditioniertem Medium gewonnen wurden, wurden erfolgreich in In-vitro-Aufnahmeexperimenten eingesetzt, um spezifische Signalwege in Empfängerzellen zu induzieren. Sie wurden auch für vergleichende proteomische Analysen von exosomalen Ladungen aus mehreren biologischen Proben verwendet4.
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Protocol
Alle Eingriffe an Mäusen wurden nach Tierprotokollen durchgeführt, die vom St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee und den Richtlinien der National Institutes of Health genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Lösungen und Medien
- Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor, indem Sie 15,4 ml PBS mit 2,5 ml 20 mg/ml Kollagenase P (5 mg/ml Endkonzentration), 2 ml 11 U/ml Dispase II (1,2 U/ml Endkonzentration) und 100 μl 1,0 M CaCl2 (5 mM Endkonzentration) mischen.
- Bereiten Sie 500 ml primäres Fibroblastenmedium (DMEM komplett) vor, indem Sie 440 ml DMEM mit 50 ml FBS (10 %), 5,0 ml Pen/Streptokokken (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) und 5,0 ml Glutaminpräparat (2 mM) mischen. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 μm Porengrößen-Vakuumfilter.
- Exosomenfreies Serum durch nächtliche Ultrazentrifugation von FBS in 38,5-ml-Polypropylenröhrchen bei 100.000 x g bei 4 °C herstellen und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen.
- Bereiten Sie 500 ml exosomenfreies Medium vor, indem Sie 440 ml DMEM mit 50 ml exosomenfreiem Serum (10 %), 5 ml Pen/Streptokokken (100 U/ml und 100 μg/ml) und 5 ml Glutaminpräparat (2 mM) mischen. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 μm Porengrößen-Vakuumfilter.
- Bereiten Sie 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) vor, indem Sie 6,057 g Trisbase in 90 mldH2Oauflösen und den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen. Stellen Sie das Volumen mit dH2O auf 100 ml ein.
- Bereiten Sie 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2-Lösung (Saccharose-Arbeitslösung) vor, indem Sie 97,9 mldH2Omit 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) und 100 μl 1 M Mg(Ac)2 mischen. Geben Sie kurz vor Gebrauch Protease-Inhibitoren in die Lösung und lassen Sie die Lösung auf Eis.
- Saccharose-Dichtegradientenlösungen auf Eis gemäß Tabelle 1 herstellen. Diese Lösungen reichen aus, um zwei Saccharose-Gradientenröhrchen herzustellen.
- Bereiten Sie 100% TCA vor, indem Sie 40 ml dH2O zu 100 g TCA-Pulver geben und mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie die Endlautstärke mit dH2O bis 100 ml ein.
- Bereiten Sie 80 % Ethanol vor, indem Sie 20 mldH2Omit 80 ml 100%igem Ethanol mischen.
- Bereiten Sie den Western-Blot-Laufpuffer vor, indem Sie 1,8 ldH2O mit 200 ml 10-fachem Laufpuffer mischen.
- Bereiten Sie den Western-Blot-Transferpuffer vor, indem Sie 1,4 ldH2Omit 200 ml 10-fachem Transferpuffer und 400 ml Methanol mischen. Transferpuffer auf 4 °C vorkühlen.
- Bereiten Sie 20x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 122 g Trisbase und 180 g Natriumchlorid in 850 mldH2O(pH 8,0) auflösen. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit dH2O ein.
- Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor, indem Sie 5 g fettfreie Trockenmilch mit 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS und 94 mldH2Oauflösen.
- Bereiten Sie den Antikörperpuffer vor, indem Sie 3 g BSA mit 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS und 94 mldH2Oauflösen.
- Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 100 ml 20x TBS und 20 ml 10% Tween-20 (10x) mit 1,88 l dH2O mischen.
- Bereiten Sie die Entwicklungslösung vor, indem Sie 1 Volumen Luminol/Enhance mit 1 Volumen stabilen Peroxidpuffers mischen.
2. Dissektion des Musculus gastrocnemius (GA) der Maus15,16
- Bereiten Sie 50-ml-Röhrchen mit 10 ml PBS auf Eis vor.
- Euthanasie der Mäuse in einer CO2 - Kammer, gefolgt von einer Zervixluxation.
- Entfernen Sie den Gastrocnemius-Muskel von beiden Beinen und übertragen Sie ihn in den Schlauch mit PBS auf Eis.
HINWEIS: Entfernen Sie den Musculus soleus aus dem GA-Muskel, bevor Sie den GA-Muskel auf PBS übertragen.
3. Isolierung und Kultur der primären Fibroblasten der Maus
- Wiegen Sie die Muskeln und geben Sie sie in eine 10-cm-Schale unter einer Biosicherheitshaube. Die Muskeln mit Skalpellen zerkleinern, bis eine feine Paste entsteht.
- Die fein gehackte Muskelpaste in ein 50-ml-Röhrchen überführen und 3,5x Volumen/mg Gewebe der Aufschlusslösung in das Röhrchen geben und 45 Minuten bei 37 °C inkubieren. Mischen Sie die Suspension alle 10 Minuten gründlich mit einer 5-ml-Pipette (dies hilft bei der vollständigen Dissoziation).
HINWEIS: Alternativ kann für diesen Schritt ein Gewebedissoziator verwendet werden. - Geben Sie 20 ml DMEM complete in die Zellsuspension, um die Aufschlusslösung zu inaktivieren. In ein 70-μm-Nylonzellsieb geben, das auf ein 50-ml-Röhrchen gelegt wird. Fangen Sie den Durchfluss auf und waschen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 5 ml DMEM complete.
- Die Zellsuspension wird bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT) für 10 min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml DMEM complete und säen Sie die Zellen in eine 10-cm-Schale.
- Die Zellen werden bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2 (Durchgang 0 oder P0) kultiviert.
HINWEIS: 1) Diese Kulturen müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologisch ähnliche Bedingungen zu gewährleisten (O2-Spiegel in der Skelettmuskulatur beträgt etwa 2,5 %)17. 2) Die Durchgangsnummer (z. B. P0) einer Zellkultur ist eine Aufzeichnung der Häufigkeit, mit der die Kultur subkultiviert wurde. 3) Primäre Fibroblasten bei P0 werden routinemäßig bis zu 100% Konfluenz plus 1 Tag (und nur für P0) kultiviert. Dies dient dazu, andere Zelltypen zu reinigen und sicherzustellen, dass die in der Kultur vorhandenen Zellen nur Fibroblasten sind, die auf der Grundlage der mikroskopischen Untersuchung von myogenen Zellen befreit sind. Der Skelettmuskel eines erwachsenen Tieres im Alter von 2 Monaten enthält etwa 2 % myogene Vorläuferzellen4. Darüber hinaus heften sich myogene Vorläuferzellen in der Regel nicht an die unbeschichteten Schalen; Daher gehen sie bei der Subkultivierung verloren18,19,20. Myogene Zellen benötigen ein anderes Medium (F10), das mit 20 % FBS und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt wird18. Bei DMEM complete haben mittlere Fibroblasten eine höhere Proliferationsrate als die myogenen Zellen, was dazu führt, dass diese kontaminierenden Zellen vor der ersten Passage eliminiert werden. - Spülen Sie die P0-Zellen mit PBS, wenn sie zu 100 % flüssig sind, plus 1 Tag. 1 ml Trypsinisierungslösung zugeben und bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2 inkubieren, um die Zellen abzulösen. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie 10 ml DMEM complete verwenden.
- Die Zellen werden bei 300 x g für 10 min bei RT zentrifugiert und das Pellet in 20 ml DMEM complete resuspendiert und in eine 15-cm-Schale (Passage 1 oder P1) gesät. Die Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 80 % bis 90 % gezüchtet und können bis zur Passage 3 expandiert werden.
HINWEIS: Abhängig von den nachgeschalteten Experimenten kann Passage 1, Passage 2 (P2) oder Passage 3 (P3) verwendet werden.
4. Aussaat der Zellen und Entnahme des konditionierten Mediums
- Waschen Sie die Fibroblasten (P1, P2 oder P3) mit 10 ml PBS, geben Sie 2,5 ml Trypsinisierungslösung zu den Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie 10 ml DMEM complete verwenden.
HINWEIS: Nach Passage 4 werden die Primärzellen verworfen und sollten nicht für weitere Experimente verwendet werden, da sie ihre Eigenschaften verändern. - Die Zellen werden gesammelt und bei 300 x g bei RT für 10 Minuten zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml exosomenfreiem Medium und zählen Sie die Zellen.
- Die Zellen werden bei 1,5–2,0 x 106 Zellen pro Schale (15 cm) ausgesät und bei 37 °C, 5 % CO 2, 3 %O2 inkubiert.
- Sammeln Sie das konditionierte Medium zwischen 16 und 24 Stunden in 50-ml-Röhrchen auf Eis.
HINWEIS: Wenn die Zellen nicht zu 80 % konfluent sind, kann nach einem zusätzlichen Zeitraum von 16 bis 24 Stunden wieder frisches exosomalfreies Medium hinzugefügt und gesammelt werden. Die beiden Kollektionen können zur Weiterverarbeitung kombiniert werden.
5. Aufreinigung von Exosomen mittels Differential- und Ultrazentrifugation
HINWEIS: Alle Schritte werden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. Gleichen Sie den Schlauch bei Bedarf mit einem mit Wasser gefüllten Schlauch aus.
- Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 300 x g für 10 Minuten zur Entfernung lebender Zellen und überführen Sie den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen.
- Entfernen Sie abgestorbene Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 10 Minuten und überführen Sie den Überstand in ein 38,5-ml-Polypropylenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 x g für 30 Minuten, um Organellen, apoptotische Körper und Membranfragmente zu entfernen. Den Überstand in ein ultraklares 38,5-ml-Röhrchen überführen.
- Ultrazentrifugieren Sie den Überstand 1,5 h lang bei 100.000 x g , um die Exosomen zu pelletieren.
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, lassen Sie etwa 1 ml konditioniertes Medium übrig und waschen Sie das Exosomenpellet in einem Gesamtvolumen von 30 ml eiskaltem PBS.
- Bei 100.000 x g für 1,5 h zentrifugieren und den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das exosomale Pellet nicht gestört wird.
- Resuspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS (~25 μl pro 15-cm-Schale) und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit und einem Mikroplatten-Reader bei 562 nm.
HINWEIS: Die Proteinkonzentration wird durch eine 1:2-Verdünnung mit 0,1% Triton-X100 indH2Ogemessen. Die Ausbeute an Exosomen aus einer 15-cm-Schale (20 ml konditioniertes Medium) von primären Fibroblasten bei 80%iger Konfluenz beträgt ~3–4 μg.
6. Charakterisierung von Exosomen durch Saccharosedichtegradient
- Laden Sie den Saccharosegradienten in ein ultraklares 13-ml-Röhrchen, indem Sie (von unten nach oben) Folgendes pipettieren: 1,5 ml 2,0 m, 2,5 ml 1,3 m, 2,5 ml 1,16 m, 2,0 ml 0,8 m und 2,0 ml 0,5 M Saccharoselösungen.
- Mischen Sie 30–100 μg Exosomen mit 0,25 M Saccharoselösung und stellen Sie das Volumen auf 1 ml ein.
- Laden Sie die Exosomen vorsichtig auf die Gradienten und zentrifugieren Sie die Proben 2,5 h lang bei 100.000 x g und 4 °C.
- Nehmen Sie die Röhrchen aus der Ultrazentrifuge und legen Sie sie auf Eis und sammeln Sie 1,0 ml Fraktionen beginnend am oberen Ende des Gradienten. Füllen Sie sie in 1,7-ml-Röhrchen auf Eis.
- Geben Sie 110 μl 100% TCA in jedes Röhrchen, mischen Sie es gut und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
- 10 min bei 10.000 x g und RT zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen.
- Das Pellet wird in 500 μl vorgekühltem 80%igem Ethanol resuspendiert und die Proben 10 Minuten lang bei -20 °C gewaschen.
- 10 min bei 10.000 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Trocknen Sie das Pellet für 10–15 Minuten bei RT und resuspendieren Sie das Pellet in PBS für In-vitro-Experimente. Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit oder resuspendieren Sie das Pellet direkt in 14,5 μldH2O, 5 μl 4x Laemmli-Puffer und 0,5 μl 1 M DTT für Western-Blot-Analysen.
7. Detektion von Exosomen durch Western-Blot-Analyse
- Mischen Sie 5–10 μg Exosomen aus Schritt 5.7 mit 5 μl 4x Laemmli-Puffer und 0,5 μl 1 M DTT und stellen Sie dann das Endvolumen mit dH2O auf 20 μl ein. Erhitzen Sie alle Proben, einschließlich der Proben in Schritt 6.9, 5 Minuten lang bei 98 °C.
- Laden Sie die Proben in ein 10% TGX fleckenfreies Gel und laden Sie die Proteinleitern gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz des Gels entsprechend dem Molekulargewicht des interessierenden Proteins. - Lassen Sie das Gel bei 100 V ~1 h im Laufpuffer laufen, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.
HINWEIS: Die Laufzeit kann je nach verwendetem Gerät oder Art und Prozentsatz des Gels variieren. - Stellen Sie sich das Gel vor. Bilder der farbfreien Gele werden als Beladungskontrolle für Immunoblots verwendet.
- Übertragen Sie das Gel mit einer PVDF-Membran für 1,5 h bei 80 V oder über Nacht bei 30 V bei 4 °C.
- Blockieren Sie die Membranen im Blockierungspuffer für 1 h bei RT.
- Die Membranen für spezifische Antikörper (Tabelle 2) werden in Antikörperpuffer über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert.
- Waschen Sie die Membranen in Waschpuffer und inkubieren Sie die Membranen mit den entsprechenden Sekundärantikörpern (Tabelle 2) für 1 h bei RT unter Rühren.
- Waschen Sie die Membranen in einem Waschpuffer und bilden Sie die Membranen mit einer Entwicklungslösung und einem kamerabasierten Imager ab. Alternativ können Sie auch einen Röntgenfilm verwenden, um die Membranen zu entwickeln.
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Representative Results
Dieses Protokoll eignet sich für die kostengünstige Aufreinigung von Exosomen aus großen Mengen konditionierten Mediums. Das Verfahren ist hochgradig reproduzierbar und konsistent. Abbildung 1 zeigt ein Transmissionselektronenmikroskopie-Bild (TEM) von Exosomen, die aus dem Kulturmedium von primären Fibroblasten der Maus gereinigt wurden. Abbildung 2 zeigt das Proteinexpressionsmuster kanonischer exosomaler Marker und die Abwesenheit von zytosolischen (LDH) und ER (Calnexin) Proteinkontaminanten. Abbildung 3 zeigt die Verteilung der kanonischen exosomalen Marker (Alix, CD9 und CD81) nach Saccharose-Dichtegradienten.
Abbildung 1: Repräsentatives TEM-Bild von Exosomen, die aus dem Kulturmedium der primären Fibroblasten der Maus isoliert wurden. Gezeigt sind die relativ einheitlichen Größen dieser Nanovesikel. Quer sind schwarze Linien mit dem Durchmesser der einzelnen Vesikel gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunoblots von Exosomenlysaten, die mit Antikörpern gegen Exosomen-, Zytosol- und ER-Marker untersucht wurden. Alix-, CD81-, CD9-, Flotillin1-, Syndecan1-, Syntenin1- (Exosom), zytosolische (LDH) und ER-Marker (Calnexin). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Exosomen, die durch einen Saccharosedichtegradienten getrennt sind. Einzelne Fraktionen wurden auf einem Western Blot mit Antikörpern gegen Alix, CD9 und CD81 untersucht. Basierend auf dem Fraktionierungsmuster der Marker sedimentieren die Exosomen konsistent in den Fraktionen 3–6, was Dichten von 1,096–1,140 g/ml entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Saccharose (g) | Saccharose-Arbeitslösung (ml) | |
| 2,0 Mio. | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 Mio. | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 Mio. | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 Mio. | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 Mio. | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 Mio. | 0.26 | 3.0 |
Tabelle 1: Saccharose-Dichtegradientenlösungen.
| Antikörper | Gastgeber | Firma | Katalognummer |
| CD9-KARTON | Ratte | BD Biowissenschaften | 553758 |
| CD81-KARTON | Maus | Santa Cruz Biotechnologies | SC-166029-KARTON |
| Alix | Kaninchen | Labor d'Azzo | Alix |
| Flotilin1 | Maus | BD Biowissenschaften | 610820 |
| Syndecan1 | Kaninchen | Life-Technologien | 36-2900 |
| Syntenin1 | Kaninchen | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH | Ziege | Chemicon | AB1222-KARTON |
| Calnexin | Ziege | Santa Cruz Biotechnologies | SC-6465-KARTON |
| Ratten-HRP | Esel | Jackson Imm. Res-Labor | 112-035-003 |
| Maus-HRP | Ziege | Jackson Imm. Res-Labor | 115-035-044 |
| Kaninchen-HRP | Ziege | Jackson Imm. Res-Labor | 111-035-144 |
Tabelle 2: Primäre und sekundäre Antikörper.
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Discussion
Ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus den Nährmedien, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die ordnungsgemäße Etablierung und Aufrechterhaltung von primären Maus-Fibroblastenkulturen aus adulter Skelettmuskulatur. Diese Kulturen müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologisch ähnliche Bedingungen zu gewährleisten (O2-Spiegel in der Skelettmuskulatur beträgt ~2,5 %)15. Primäre Fibroblasten ändern ihre Eigenschaften, wenn sie zu oft in Kultur passieren. Daher ist eine niedrige Durchgangszahl für eine ideale Exosomenausbeute unerlässlich. Gereinigte Exosomen sollten entweder sofort für experimentelle Zwecke verwendet oder bis zur Verwendung in Aliquoten bei -80 °C eingefroren aufbewahrt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist die Verwendung von Saccharoselösungen, die jedes Mal frisch zubereitet werden. Eine Einschränkung der Methode besteht darin, dass sie zeitaufwändig ist, da primäre Fibroblasten im Allgemeinen keine großen Mengen an Exosomen absondern, wie andere sekretorische Zellen. Daher sollten große Kulturen verwendet werden, die dazu führen, dass große Mengen an konditionierten Medien verarbeitet werden müssen.
Der Vorteil der hier verwendeten Differentialzentrifugation besteht darin, dass sie einen skalierbaren Ansatz (bis zu Litern) darstellt und die Methode der Wahl ist, um Exosomen aus primären Fibroblasten zu isolieren. Eine alternative Methode für größere Volumina (bis zu 100 ml pro Säule) ist die Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Methode ist schnell und kann Proteine von Exosomen trennen. Die Säule pelletiert keine Exosomen, so dass weitere Konzentrations- oder Zentrifugationsschritte erforderlich sind. Einer der Nachteile der SEC-Methode ist, dass die Spalte mit der Zeit verstopft und überlastet werden kann. Andere derzeitige Methoden basieren auf der Verwendung kleiner Mengen biologischer Flüssigkeiten (d. h. Urin, Liquor, Serum, Plasma) und kommerziell erhältlichen Kits. Obwohl diese Kits die Reproduzierbarkeit gewährleisten, sind sie kostspielig und produzieren nicht immer eine hohe Ausbeute an reinen Exosomen. Das beschriebene Protokoll für die Exosomenreinigung ist unkompliziert und kann je nach experimentellem Bedarf auf verschiedene Arten von Zellen, ganze Gewebe und Organe oder andere biologische Flüssigkeiten angewendet werden.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo ist Inhaberin des Stiftungslehrstuhls für Genetik und Gentherapie von Jewelers for Children (JFC). Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH-Zuschüsse R01GM104981, RO1DK095169 und CA021764, die Assisi Foundation of Memphis und die American Lebanese Syrian Associated Charities unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
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