Summary
Detta protokoll illustrerar 1) isolering och odling av primära fibroblaster från den vuxna musmuskeln gastrocnemius samt 2) rening och karakterisering av exosomer med hjälp av en differentiell ultracentrifugeringsmetod i kombination med sackarosdensitetsgradienter följt av western blot-analyser.
Abstract
Exosomer är små extracellulära vesiklar som frigörs av praktiskt taget alla celler och utsöndras i alla biologiska vätskor. Många metoder har utvecklats för isolering av dessa vesiklar, inklusive ultracentrifugering, ultrafiltrering och storleksuteslutningskromatografi. Alla är dock inte lämpliga för storskalig exosomrening och karakterisering. Här beskrivs ett protokoll för att etablera odlingar av primära fibroblaster isolerade från vuxna musskelettmuskler, följt av rening och karakterisering av exosomer från odlingsmedia i dessa celler. Metoden är baserad på användning av sekventiella centrifugeringssteg följt av sackarosdensitetsgradienter. Renheten hos de exosomala preparaten valideras sedan genom western blot-analyser med hjälp av ett batteri av kanoniska markörer (dvs. Alix, CD9 och CD81). Protokollet beskriver hur man isolerar och koncentrerar bioaktiva exosomer för elektronmikroskopi, masspektrometri och upptagsexperiment för funktionella studier. Den kan enkelt skalas upp eller ner och anpassas för exosomisolering från olika celltyper, vävnader och biologiska vätskor.
Introduction
Exosomer är heterogena extracellulära vesiklar som varierar i storlek från 30–150 nm. De är etablerade nyckelspelare i fysiologiska och patologiska processer, med tanke på deras allestädes närvarande distribution i vävnader och organ 1,2. Exosomer bär en komplex last av proteiner, lipider, DNA-typer och RNA-typer, som varierar beroende på vilken typ av celler de härrör från 1,2,3. Exosomer är anrikade i proteiner som har olika funktioner (dvs. tetraspaniner, inklusive CD9 och CD63) är ansvariga för fusionshändelser. Till exempel är värmechockproteinerna HSP70 och HSP90 involverade i antigenbindning och presentation. Dessutom deltar Alix, Tsg101 och flotillin i exosombiogenes och frisättning och används ofta som markörer för dessa nanovesiklar 2,3,4.
Exosomer innehåller också en mängd olika RNA (dvs. mikroRNA, långa icke-kodande RNA, ribosomala RNA) som kan överföras till mottagarceller, där de påverkar nedströms signalering3. Exosomens bioaktivitet är innesluten av ett enda enhetsmembran och beror inte bara på lasten av proteiner och nukleinsyror, utan också på lipidkomponenterna i det begränsande membranet1. Exosomala membran är berikade med fosfatidylserin, fosfatidinsyra, kolesterol, sfingomyelin, arakidonsyra och andra fettsyror, som alla kan påverka exosomstabilitet och membrantopologi 2,3. Som ett resultat av last- och lipidarrangemanget initierar exosomer signalvägar i mottagande celler och deltar i upprätthållandet av normal vävnadsfysiologi 1,2,4,5. Under vissa patologiska tillstånd (t.ex. neurodegeneration, fibros och cancer) har de visat sig utlösa och sprida patologiska stimuli 4,6,7,8,9,10,11.
På grund av deras förmåga att sprida signaler till närliggande eller avlägsna platser har exosomer blivit värdefulla biomarkörer för diagnos eller prognos av sjukdomstillstånd. Dessutom har exosomer använts experimentellt som bärare av terapeutiska föreningar 2,12. Den potentiella tillämpningen av dessa nanovesiklar i kliniken gör isoleringsmetoden allt viktigare för att uppnå maximalt utbyte, renhet och reproducerbarhet. Olika tekniker för isolering av exosomer har utvecklats och implementerats. I allmänhet kan exosomer isoleras från konditionerade cellodlingsmedier eller kroppsvätskor genom differentiell centrifugering, storleksuteslutningskromatografi och immuninfångning (med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit). Varje tillvägagångssätt har unika fördelar och nackdelar som har diskuterats tidigare 1,2,13,14.
Det skisserade protokollet fokuserar på 1) isolering och odling av primära fibroblaster från vuxna möss gastrocnemiusmuskel och 2) rening och karakterisering av exosomer som frigörs i odlingsmediet av dessa celler. Ett väletablerat protokoll för isolering av exosomer från primära fibroblaster för funktionella studier saknas för närvarande. Primära fibroblaster utsöndrar inte stora mängder exosomer, vilket gör isolerings- och reningsprocessen utmanande. Detta protokoll beskriver rening av stora mängder rena exosomer från stora odlingsvolymer samtidigt som deras morfologiska integritet och funktionella aktivitet bibehålls. Renade exosomer erhållna från konditionerat medium har använts framgångsrikt i in vitro-upptagsexperiment för att inducera specifika signalvägar i mottagarceller. De har också använts för jämförande proteomikanalyser av exosomala laster från flera biologiska prover4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer på möss utfördes enligt djurprotokoll som godkänts av St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee och National Institutes of Healths riktlinjer.
1. Beredning av lösningar och medier
- Bered uppslutningslösningen genom att blanda 15,4 ml PBS med 2,5 ml 20 mg/ml kollagenas P (5 mg/ml slutlig koncentration), 2 ml 11 E/ml dispase II (1,2 E/ml slutlig koncentration) och 100 μl 1,0 M CaCl2 (5 mM slutlig koncentration).
- Bered 500 ml primärt fibroblastmedium (DMEM komplett) genom att blanda 440 ml DMEM med 50 ml FBS (10 %), 5,0 ml penna/streptokocker (100 E/ml respektive 100 μg/ml) och 5,0 ml glutamintillskott (2 mM). Filtersterilisera mediet med ett vakuumfilter med en porstorlek på 0.22 μm.
- Bered exosomfritt serum genom ultracentrifugering av FBS över natten i 38,5 ml polypropenrör vid 100 000 x g vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt rör.
- Bered 500 ml exosomfritt medium genom att blanda 440 ml DMEM med 50 ml exosomfritt serum (10 %), 5 ml penna/streptokocker (100 E/ml och 100 μg/ml) och 5 ml glutamintillskott (2 mM). Filtersterilisera mediet med ett vakuumfilter med en porstorlek på 0.22 μm.
- Förbered 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) genom att lösa upp 6,057 g Tris-bas i 90 ml dH 2 O och justera pH till 7,4 med HCl. Justera volymen till 100 ml med dH2O.
- Bered 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2-lösning (sackarosarbetslösning) genom att blanda 97,9 mldH2O med 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) och 100 μl 1 M Mg(Ac)2. Tillsätt proteashämmare till lösningen strax före användning och förvara lösningen på is.
- Bered sackarosdensitetsgradientlösningar på is enligt tabell 1. Dessa lösningar är tillräckliga för att bereda två sackarosgradientrör.
- Förbered 100 % TCA genom att tillsätta 40 ml dH2O till 100 g TCA-pulver och blanda tills det är helt upplöst. Justera den slutliga volymen med dH2O till 100 ml.
- Bered 80 % etanol genom att blanda 20 mldH2O med 80 ml 100 % etanol.
- Förbered western blot-löpbufferten genom att blanda 1,8 l dH2O med 200 ml 10x löpbufferten.
- Bered western blot-överföringsbufferten genom att blanda 1,4 l dH2O med 200 ml 10x överföringsbuffert och 400 ml metanol. Förkyl överföringsbufferten till 4 °C.
- Bered 20x Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) genom att lösa upp 122 g Tris-bas och 180 g natriumklorid i 850 ml dH2O (pH 8,0). Justera volymen till 1 L med dH2O.
- Förbered blockeringsbufferten genom att lösa upp 5 g fettfri torrmjölk med 1 ml 10 % Tween-20, 5 ml 20x TBS och 94 ml dH2O.
- Bered antikroppsbuffert genom att lösa upp 3 g BSA med 1 ml 10 % Tween-20, 5 ml 20x TBS och 94 ml dH2O.
- Förbered tvättbufferten genom att blanda 100 ml 20x TBS och 20 ml 10 % Tween-20 (10x) med 1,88 l dH2O.
- Bered framkallningslösningen genom att blanda 1 volym luminol/enhance med 1 volym stabil peroxidbuffert.
2. Dissektion av gastrocnemius (GA) musmuskel15,16
- Förbered 50 ml rör som innehåller 10 ml PBS på is.
- Avliva mössen i en CO2 - kammare följt av cervikal luxation.
- Ta bort gastrocnemius-muskeln från båda benen och överför dem till röret med PBS på is.
OBS: Ta bort soleusmuskeln från GA-muskeln innan du överför GA-muskeln till PBS.
3. Isolering och odling av primära fibroblaster hos möss
- Väg musklerna och överför dem till en 10 cm skål under en biosäkerhetshuva. Finhacka musklerna med skalpeller tills det blir en fin pasta.
- Överför den finhackade muskelpastan till ett 50 ml rör och tillsätt 3,5 volym/mg vävnad av digestionslösningen till röret och inkubera i 45 minuter vid 37 °C. Blanda suspensionen noggrant med en 5 ml pipett var 10:e minut (detta kommer att hjälpa till med fullständig dissociation).
OBS: Alternativt kan en vävnadsdissociator användas för detta steg. - Tillsätt 20 ml komplett DMEM till cellsuspensionen för att inaktivera uppslutningslösningen. Överför till en 70 μm nyloncellsil placerad på ett 50 ml rör. Samla upp genomströmningen och tvätta cellsilen med ytterligare 5 ml DMEM komplett.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g vid rumstemperatur (RT) i 10 minuter och avlägsna försiktigt supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 10 ml DMEM komplett och frö cellerna i en 10 cm skål.
- Odla cellerna vid 37 °C, 5 % CO 2 , 3 % O2 (passage 0 eller P0).
OBS: 1) Dessa kulturer måste hållas på en låg syrenivå för att säkerställa fysiologiska förhållanden (O2-nivån i skelettmuskulaturen är cirka 2,5 %)17. 2) Passagenumret (t.ex. P0) för en cellkultur är ett register över antalet gånger kulturen har subodlats. 3) Primära fibroblaster vid P0 odlas rutinmässigt till 100 % sammanflöde plus 1 dag (och endast för P0). Detta för att rensa ut andra typer av celler och säkerställa att cellerna som finns i kulturen endast är fibroblaster, utarmade på myogena celler baserat på mikroskopundersökning. Skelettmuskulaturen från ett vuxet djur vid 2 månaders ålder innehåller ca 2 % myogena stamceller4. Dessutom fäster myogena förfäder vanligtvis inte på de obelagda rätterna; Därför går de förlorade under subkulturation18,19,20. Myogena celler kräver ett annat medium (F10) kompletterat med 20 % FBS och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF)18. I DMEM complete har medelstora fibroblaster en högre proliferationshastighet än de myogena cellerna, vilket resulterar i eliminering av dessa kontaminerande celler före den första passagen. - Skölj P0-cellerna med PBS när de är 100 % sammanflytande plus 1 dag. Tillsätt 1 ml trypsiniseringslösning och inkubera vid 37 °C, 5 % CO 2 och 3 % O2 för att lossna cellerna. Stoppa den enzymatiska aktiviteten genom att använda 10 ml DMEM complete.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 minuter vid RT och återsuspendera pelleten i 20 ml DMEM komplett och frö till en 15 cm skål (passage 1 eller P1). Cellerna odlas till 80–90 % sammanflöde och kan expanderas fram till passage 3.
OBS: Beroende på nedströmsexperimenten kan passage 1, passage 2 (P2) eller passage 3 (P3) användas.
4. Sådd av celler och uppsamling av konditionerat medium
- Tvätta fibroblasterna (P1, P2 eller P3) med 10 ml PBS, tillsätt 2,5 ml trypsiniseringslösning till cellerna och inkubera vid 37 °C, 5 % CO 2 , 3 % O2 . Stoppa enzymatisk aktivitet genom att använda 10 ml DMEM complete.
OBS: Efter passage 4 kasseras primära celler och bör inte användas för ytterligare experiment, eftersom de ändrar egenskaper. - Samla ihop cellerna och centrifugera vid 300 x g vid RT i 10 minuter.
- Återsuspenderade cellpelleten i 10 ml exosomfritt medium och räkna cellerna.
- Frö cellerna vid 1,5–2,0 x 106 celler per maträtt (15 cm) och inkubera vid 37 °C, 5 % CO 2 , 3 % O2 .
- Samla upp det konditionerade mediet mellan 16–24 timmar i 50 ml rör på is.
OBS: Om cellerna inte är 80 % sammanflytande kan färskt exosomalt fritt medium tillsättas igen och samlas in efter ytterligare 16–24 timmar. De två samlingarna kan kombineras för vidare bearbetning.
5. Rening av exosomer med differentiell centrifugering och ultracentrifugering
OBS: Alla steg utförs vid 4 °C eller på is. Balansera röret med ett rör fyllt med vatten vid behov.
- Centrifugera det konditionerade mediet vid 300 x g i 10 minuter för avlägsnande av levande celler och överför supernatanten till ett nytt 50 ml rör.
- Ta bort döda celler genom centrifugering vid 2 000 x g i 10 minuter och överför supernatanten till ett 38,5 ml polypropenrör.
- Centrifugera supernatanten vid 10 000 x g i 30 minuter för avlägsnande av organeller, apoptotiska kroppar och membranfragment. Överför supernatanten till ett 38,5 ml ultraklart rör.
- Ultracentrifugera supernatanten vid 100 000 x g i 1,5 timme för att pelletera exosomerna.
- Kassera försiktigt supernatanten, lämna cirka 1 ml konditionerat medium, och tvätta exosompelleten i en total volym på 30 ml iskall PBS.
- Centrifugera vid 100 000 x g i 1,5 timme och kassera försiktigt supernatanten genom pipettering, var noga med att inte störa den exosomala pelleten.
- Återsuspendera pelleten i iskall PBS (~25 μL per 15 cm skål) och mät proteinkoncentrationen med hjälp av BCA-proteinanalyssatsen och en mikroplattläsare vid 562 nm.
OBS: Proteinkoncentrationen mäts genom en 1:2 utspädning med 0,1 % Triton-X100 i dH2O. Utbytet av exosomer från en 15 cm skål (20 ml konditionerat medium) av primära fibroblaster vid 80 % sammanflöde är ~3–4 μg.
6. Karakterisering av exosomer med sackarosdensitetsgradient
- Ladda sackarosgradienten i ett 13 ml ultraklart rör genom att pipettera (nerifrån och upp) följande: 1,5 ml 2,0 M, 2,5 ml 1,3 M, 2,5 ml 1,16 M, 2,0 ml 0,8 M och 2,0 ml 0,5 M sackaroslösningar.
- Blanda 30–100 μg exosomer med 0,25 M sackaroslösning och justera volymen till 1 ml.
- Häll försiktigt exosomerna ovanpå gradienterna och ultracentrifugera proverna i 2,5 timmar vid 100 000 x g och 4 °C.
- Ta bort rören från ultracentrifugen och placera dem på is och samla upp 1.0 ml fraktioner med början från toppen av gradienten. Överför dem till 1,7 ml rör på is.
- Tillsätt 110 μL 100 % TCA till varje rör, blanda väl och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Centrifugera i 10 minuter vid 10 000 x g och RT och kassera försiktigt supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 500 μl förkyld 80 % etanol och låt proverna tvättas i 10 minuter vid -20 °C.
- Centrifugera i 10 minuter vid 10 000 x g och 4 °C och kassera supernatanten.
- Torka pelleten i 10–15 minuter vid RT och återsuspendera pelleten i PBS för in vitro-experiment. Mät proteinkoncentrationen med BCA-proteinanalyskit eller återsuspendera pelleten direkt i 14,5 μL av dH2O, 5 μL av 4x Laemmli-buffert och 0,5 μL av 1 M DTT för western blot-analyser.
7. Exosomdetektion genom western blot-analys
- Blanda 5–10 μg exosomer från steg 5.7 med 5 μL 4x Laemmli-buffert och 0.5 μL 1 M DTT och justera sedan den slutliga volymen till 20 μL med dH2O. Värm alla prover, inklusive de i steg 6.9, i 5 minuter vid 98 °C.
- Ladda proverna i en 10% TGX-fläckfri gel och ladda proteinstegarna enligt tillverkarens rekommendationer.
OBS: Välj procentandelen av gelen enligt molekylvikten för proteinet av intresse. - Kör gelen vid 100 V i ~1 timme i löpande buffert tills laddningsfärgen är i botten av gelen.
OBS: Körtiden kan variera beroende på vilken utrustning som används eller typ och procenttage av gel. - Föreställ dig gelen. Bilder av de fläckfria gelerna används som laddningskontroll för immunfläckar.
- Överför gelen med hjälp av ett PVDF-membran i 1,5 timmar vid 80 V eller över natten vid 30 V vid 4 °C.
- Blockera membranen i blockerande buffert i 1 timme vid RT.
- Inkubera membranen för specifika antikroppar (tabell 2) i antikroppsbuffert över natten vid 4 °C med omrörning.
- Tvätta membranen i tvättbuffert och inkubera membranen med lämpliga sekundära antikroppar (tabell 2) i 1 timme vid RT med omrörning.
- Tvätta membranen i tvättbuffert och avbilda membranen med hjälp av framkallningslösning och en kamerabaserad kamera. Alternativt kan du använda en röntgenfilm för att framkalla membranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll är lämpligt för rening av exosomer från stora volymer konditionerat medium på ett kostnadseffektivt sätt. Förfarandet är mycket reproducerbart och konsekvent. Figur 1 visar transmissionselektronmikroskopi (TEM) bild av exosomer renade från odlingsmediet i primära fibroblaster hos möss. Figur 2 visar proteinuttrycksmönstret för kanoniska exosomala markörer och frånvaron av cytosoliska (LDH) och ER (calnexin) proteinföroreningar. Figur 3 visar fördelningen av kanoniska exosomala markörer (Alix, CD9 och CD81) efter sackarosdensitetsgradienter.
Figur 1: Representativ TEM-bild av exosomer isolerade från odlingsmedium av primära fibroblaster hos möss. Bilden visar de relativt enhetliga storlekarna på dessa nanovesiklar. Tvärs över svarta linjer anges diametern på de enskilda vesiklarna. Skalstapel = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunoplumts av exosomlysat undersökta med antikroppar mot exosom-, cytosol- och östrogenmarkörer. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (exosom), cytosoliska (LDH) och ER (kalnexin) markörer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exosomer separerade av en sackarosdensitetsgradient. Enskilda fraktioner undersöktes på en western blot med antikroppar mot Alix, CD9 och CD81. Baserat på markörernas fraktioneringsmönster sedimenterar exosomer konsekvent i fraktionerna 3–6, vilket motsvarar densiteter på 1,096–1,140 g/ml. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Sackaros (g) | Arbetslösning för sackaros (ml) | |
| 2,0 miljoner | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 miljoner | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 M | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 M | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 m | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 m | 0.26 | 3.0 |
Tabell 1: Gradientlösningar för sackarosdensitet.
| Antikropp | Värd | Företag | Katalognummer |
| CD9 | Råtta | BD Biovetenskaper | 553758 |
| CD81 | Mus | Santa Cruz Bioteknik | SC-166029 |
| Alix | Kanin | d'Azzo lab | Alix |
| Flotilin1 | Mus | BD Biovetenskaper | 610820 |
| Syndecan1 | Kanin | Teknik för liv | 36-2900 |
| Syntenin1 | Kanin | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH | Get | Chemicon (Kemi) | AB1222 |
| Kalnexin | Get | Santa Cruz Bioteknik | SC-6465 |
| råtta-HRP | Åsna | Jackson Imm. Res Lab | 112-035-003 |
| Mus-HRP | Get | Jackson Imm. Res Lab | 115-035-044 |
| Kanin-HRP | Get | Jackson Imm. Res Lab | 111-035-144 |
Tabell 2: Primära och sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg för en framgångsrik isolering av exosomer från odlingsmedia, som beskrivs i detta protokoll, är korrekt etablering och underhåll av primära musfibroblastkulturer från vuxen skelettmuskulatur. Dessa kulturer måste hållas vid en låg syrenivå för att säkerställa fysiologiskt liknande förhållanden (O2-nivån i skelettmuskulaturen är ~2,5 %)15. Primära fibroblaster kommer att ändra egenskaper när de passerar i odling för många gånger. Därför är ett lågt passagetal absolut nödvändigt för idealiskt exosomutbyte. Renade exosomer bör antingen användas omedelbart för försöksändamål eller förvaras frysta i alikvoter vid -80 °C tills de behövs. Ett annat viktigt steg i protokollet är användningen av sackaroslösningar som tillagas färska varje gång. En begränsning med metoden är att den är tidskrävande, eftersom primära fibroblaster i allmänhet inte utsöndrar stora mängder exosomer, som andra sekretoriska celler. Därför bör stora kulturer användas, vilket resulterar i att stora volymer konditionerade medier bearbetas.
Fördelen med differentiell centrifugering som används här är att den representerar ett skalbart tillvägagångssätt (upp till liter) och är den metod som valts för att isolera exosomer från primära fibroblaster. En alternativ metod för större volymer (upp till 100 ml per kolonn) är storleksuteslutningskromatografi (SEC). Denna metod är snabb och kan separera proteiner från exosomer. Kolonnen pelleterar inte exosomer, så ytterligare koncentrations- eller centrifugeringssteg krävs. En av nackdelarna med SEC-metoden är att kolonnen kan täppas till med tiden och överbelastas. Andra nuvarande metoder är baserade på användning av små volymer biologiska vätskor (t.ex. urin, CSF, serum, plasma) och kommersiellt tillgängliga kit. Även om dessa kit säkerställer reproducerbarhet är de dyra och ger inte alltid ett högt utbyte av rena exosomer. Det beskrivna protokollet för exosomrening är enkelt och kan tillämpas på olika typer av celler, hela vävnader och organ eller andra biologiska vätskor beroende på det experimentella behovet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo innehar Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair i genetik och genterapi. Detta arbete stöddes delvis av NIH-anslag R01GM104981, RO1DK095169 och CA021764, Assisi Foundation of Memphis och American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
