Summary
Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.
Abstract
Eksozomlar, hemen hemen tüm hücreler tarafından salınan ve tüm biyolojik sıvılarda salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir. Bu veziküllerin izolasyonu için ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi dahil olmak üzere birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hepsi büyük ölçekli eksozom saflaştırması ve karakterizasyonu için uygun değildir. Burada özetlenen, yetişkin fare iskelet kaslarından izole edilen primer fibroblast kültürlerinin oluşturulması için bir protokoldür, ardından bu hücrelerin kültür ortamından eksozomların saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılır. Yöntem, sıralı santrifüjleme adımlarının ve ardından sakaroz yoğunluk gradyanlarının kullanımına dayanmaktadır. Ekzozomal preparatların saflığı daha sonra bir dizi kanonik belirteç (yani, Alix, CD9 ve CD81) kullanılarak western blot analizleri ile doğrulanır. Protokol, elektron mikroskobu, kütle spektrometrisi ve fonksiyonel çalışmalar için alım deneyleri için biyoaktif eksozomların nasıl izole edileceğini ve konsantre edileceğini açıklar. Kolayca büyütülebilir veya küçültülebilir ve farklı hücre tiplerinden, dokulardan ve biyolojik sıvılardan eksozom izolasyonu için uyarlanabilir.
Introduction
Eksozomlar, boyutları 30-150 nm arasında değişen heterojen hücre dışı veziküllerdir. Doku ve organlardaher yerde dağılımları göz önüne alındığında, fizyolojik ve patolojik süreçlerde kilit oyunculardır 1,2. Eksozomlar, türetildikleri hücrelerin tipine göre değişen karmaşık bir protein, lipit, DNA tipi ve RNA tipi kargosu taşırlar 1,2,3. Eksozomlar, farklı işlevlere sahip proteinlerle zenginleştirilmiştir (yani, CD9 ve CD63 dahil tetraspaninler) füzyon olaylarından sorumludur. Örneğin, ısı şoku proteinleri HSP70 ve HSP90, antijen bağlanması ve sunumunda rol oynar. Ek olarak, Alix, Tsg101 ve flotilin, eksozom biyogenezi ve salınımına katılır ve bu nanoveziküllerin 2,3,4 belirteçleri olarak yaygın olarak kullanılır.
Eksozomlar ayrıca, aşağı akış sinyalinietkiledikleri alıcı hücrelere aktarılabilen çeşitli RNA'lar (yani mikroRNA'lar, uzun kodlamayan RNA'lar, ribozomal RNA'lar) içerir 3. Tek bir birim zarla çevrili olan eksozom biyoaktivitesi, yalnızca proteinlerin ve nükleik asitlerin kargosuna değil, aynı zamanda sınırlayıcı zarın1 lipit bileşenlerine de bağlıdır. Ekzozomal membranlar, fosfatidilserin, fosfatidik asit, kolesterol, sfingomyelin, araşidonik asit ve diğer yağ asitleri açısından zenginleştirilmiştir ve bunların tümü eksozom stabilitesini ve membran topolojisinietkileyebilir 2,3. Kargo ve lipid düzenlemesinin bir sonucu olarak, eksozomlar alıcı hücrelerde sinyal yollarını başlatır ve normal doku fizyolojisininkorunmasına katılır 1,2,4,5. Belirli patolojik koşullar altında (ör., nörodejenerasyon, fibroz ve kanser), patolojik uyaranları tetikledikleri ve yaydıkları gösterilmiştir 4,6,7,8,9,10,11.
Sinyalleri komşu veya uzak bölgelere yayma yetenekleri nedeniyle, eksozomlar, hastalık durumlarının teşhisi veya prognozu için değerli biyobelirteçler haline gelmiştir. Ek olarak, eksozomlar deneysel olarak terapötik bileşiklerin araçları olarak kullanılmıştır 2,12. Bu nanoveziküllerin klinikte potansiyel uygulaması, maksimum verim, saflık ve tekrarlanabilirlik elde etmek için izolasyon yöntemini giderek daha önemli hale getirmektedir. Eksozomların izolasyonu için farklı teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Genel olarak, eksozomlar, diferansiyel santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve bağışıklık yakalama (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak) ile şartlandırılmış hücre kültürü ortamından veya vücut sıvılarından izole edilebilir. Her yaklaşımın daha önce tartışılan benzersiz avantajları ve dezavantajları vardır 1,2,13,14.
Ana hatlarıyla belirtilen protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonu ve kültürüne ve 2) bu hücreler tarafından kültür ortamına salınan eksozomların saflaştırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmaktadır. Fonksiyonel çalışmalar için eksozomların primer fibroblastlardan izolasyonu için iyi kurulmuş bir protokol şu anda eksiktir. Primer fibroblastlar büyük miktarlarda eksozom salgılamaz, bu da izolasyon ve saflaştırma sürecini zorlaştırır. Bu protokol, morfolojik bütünlüklerini ve fonksiyonel aktivitelerini korurken büyük kültür hacimlerinden büyük miktarlarda saf eksozomların saflaştırılmasını açıklar. Şartlandırılmış ortamdan elde edilen saflaştırılmış eksozomlar, alıcı hücrelerde spesifik sinyal yollarını indüklemek için in vitro alım deneylerinde başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, birden fazla biyolojik örnekten alınan ekzozomal kargoların karşılaştırmalı proteomik analizleri için de kullanılmıştır4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerdeki tüm prosedürler, St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları tarafından onaylanan hayvan protokollerine göre gerçekleştirildi.
1. Çözümlerin ve ortamın hazırlanması
- 15.4 mL PBS'yi 2.5 mL 20 mg/mL kollajenaz P (5 mg/mL nihai konsantrasyon), 2 mL 11 U/mL dispas II (1.2 U/mL nihai konsantrasyon) ve 100 μL 1.0 MCaCl2 (5 mM nihai konsantrasyon) ile karıştırarak sindirim solüsyonu hazırlayın.
- 440 mL DMEM'i 50 mL FBS (% 10), 5.0 mL kalem / strep (sırasıyla 100 U / mL ve 100 μg / mL) ve 5.0 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL primer fibroblast ortamı (DMEM tamamlandı) hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.
- FBS'nin 4 ° C'de 100.000 x g'de 38.5 mL polipropilen tüplerde gece boyunca ultrasantrifüj edilmesiyle eksozom içermeyen serum hazırlayın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
- 440 mL DMEM'i 50 mL eksozomsuz serum (%10), 5 mL kalem/strep (100 U/mL ve 100 μg/mL) ve 5 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL eksozomsuz ortam hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.
- 6.057 g Tris bazını 90 mLdH2Oiçinde çözerek ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayarak 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) hazırlayın.
- 97.9 mLdH2Oile 2 mL 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ve 100 μL 1 M Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) karıştırarak 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) hazırlayın. Kullanmadan hemen önce çözeltiye proteaz inhibitörleri ekleyin ve çözeltiyi buz üzerinde tutun.
- Tablo 1'e göre buz üzerinde sakaroz yoğunluk gradyan çözeltileri hazırlayın. Bu çözeltiler iki sükroz gradyan tüpü hazırlamak için yeterlidir.
- 100 g TCA tozuna 40 mL dH2O ekleyerek %100 TCA hazırlayın ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Son ses seviyesini dH2O ile 100 mL'ye ayarlayın.
- 20 mL dH2O ile 80 mL %100 etanolü karıştırarak% 80 etanol hazırlayın.
- 1.8 L dH2O ile 200 mL 10x çalışma tamponunu karıştırarak western blot çalışma tamponunu hazırlayın.
- 1.4 L dH2O ile 200 mL 10x transfer tamponu ve 400 mL metanol karıştırarak western blot transfer tamponu hazırlayın. Transfer tamponunu 4 °C'ye önceden soğutun.
- 122 g Tris bazı ve 180 g sodyum klorürü 850 mLdH2O(pH 8.0) içinde çözerek 20x Tris tamponlu salin (TBS) hazırlayın. Ses seviyesini dH2O ile 1 L'ye ayarlayın.
- 5 g yağsız kuru sütü 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek bloke edici tampon hazırlayın.
- 3 g BSA'yı 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek antikor tamponu hazırlayın.
- 100 mL 20x TBS ve 20 mL %10 Tween-20 (10x) ile 1.88 LdH2O karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın.
- 1 hacim luminol/geliştir ile 1 hacim stabil peroksit tamponunu karıştırarak geliştirme solüsyonu hazırlayın.
2. Gastroknemius (GA) fare kası diseksiyonu15,16
- Buz üzerinde 10 mL PBS içeren 50 mL'lik tüpler hazırlayın.
- Fareleri bir CO2 odasında ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
- Gastroknemius kasını her iki bacaktan çıkarın ve buz üzerinde PBS ile tüpe aktarın.
NOT: GA kasını PBS'ye aktarmadan önce soleus kasını GA kasından çıkarın.
3. Fare primer fibroblast izolasyonu ve kültürü
- Kasları tartın ve biyogüvenlik başlığı altında 10 cm'lik bir tabağa aktarın. İnce bir macun haline gelene kadar kasları neşterle kıyın.
- İnce kıyılmış kas macununu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpe 3.5x hacim/mg doku sindirim solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Süspansiyonu her 10 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın (bu, tamamen ayrışmaya yardımcı olacaktır).
NOT: Alternatif olarak, bu adım için bir doku ayrıştırıcı kullanılabilir. - Sindirim solüsyonunu etkisiz hale getirmek için hücre süspansiyonuna 20 mL DMEM ekleyin. 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecine aktarın. Akışı toplayın ve hücre süzgecini ek 5 mL DMEM ile yıkayın.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Peletleri 10 mL DMEM complete'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 cm'lik bir tabağa tohumlayın.
- Hücreleri 37 °C, %5 CO2, %3O2 (geçiş 0 veyaP0 ) ile kültürleyin.
NOT: 1) Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındaO2 seviyesi yaklaşık% 2.5'tir)17. 2) Bir hücre kültürünün geçiş numarası (örneğin, P0), kültürün kaç kez alt kültürlendiğinin bir kaydıdır. 3) P0'daki primer fibroblastlar, %100 birleşme artı 1 güne kadar (ve sadece P0 için) rutin olarak kültürlenir. Bu, diğer hücre tiplerini temizlemek ve kültürde bulunan hücrelerin, mikroskop incelemesine dayalı olarak miyojenik hücrelerden tükenmiş sadece fibroblastlar olduğundan emin olmak içindir. 2 aylıkken yetişkin bir hayvandan alınan iskelet kası yaklaşık% 2 miyojenik progenitöriçerir 4. Ek olarak, miyojenik progenitörler genellikle kaplanmamış bulaşıklara yapışmaz; bu nedenle, 18,19,20 alt kültürleme sırasında kaybolurlar. Miyojenik hücreler, %20 FBS ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF)18 ile desteklenmiş farklı bir ortam (F10) gerektirir. DMEM complete'de, orta fibroblastlar, miyojenik hücrelerden daha yüksek bir proliferasyon hızına sahiptir, bu da bu kirletici hücrelerin ilk geçişten önce ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır. - P0 hücrelerini% 100 birleştiğinde artı 1 gün PBS ile durulayın. 1 mL tripsinizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C, %5CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun.
- Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 20 mL DMEM içinde yeniden süspanse edin ve 15 cm'lik bir tabağa tohumlayın (pasaj 1 veya P1). Hücreler %80-90 birleşene kadar büyütülür ve 3. geçişe kadar genişletilebilir.
NOT: Aşağı akış deneylerine bağlı olarak geçit 1, geçit 2 (P2) veya geçit 3 (P3) kullanılabilir.
4. Hücrelerin tohumlanması ve şartlandırılmış ortamın toplanması
- Fibroblastları (P1, P2 veya P3) 10 mL PBS ile yıkayın, hücrelere 2.5 mL tripsinizasyon solüsyonu ekleyin ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun.
NOT: 4. geçişten sonra, birincil hücreler atılır ve özelliklerini değiştirdikleri için daha fazla deney için kullanılmamalıdır. - Hücreleri toplayın ve 10 dakika boyunca RT'de 300 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 10 mL eksozomsuz ortamda yeniden süspanse etti ve hücreleri saydı.
- Hücreleri tabak başına 1.5–2.0 x 106 hücrede (15 cm) tohumlayın ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin.
- Şartlandırılmış ortamı 16-24 saat arasında 50 mL'lik tüplerde buz üzerinde toplayın.
NOT: Hücreler %80 birleşik değilse, taze ekzozomal serbest ortam tekrar eklenebilir ve 16-24 saatlik ek bir süre sonra toplanabilir. İki koleksiyon daha sonraki işlemler için birleştirilebilir.
5. Diferansiyel ve ultra santrifüjleme kullanılarak eksozomların saflaştırılması
NOT: Tüm adımlar 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilir. Gerektiğinde tüpü suyla dolu bir tüp ile dengeleyin.
- Canlı hücrelerin çıkarılması için şartlandırılmış ortamı 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
- Ölü hücreleri 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek çıkarın ve süpernatanı 38.5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
- Organellerin, apoptotik cisimlerin ve membran parçalarının çıkarılması için süpernatanı 10.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 38.5 mL ultra berrak bir tüpe aktarın.
- Eksozomları peletlemek için süpernatanı 1.5 saat boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice atın, yaklaşık 1 mL şartlandırılmış ortam bırakın ve eksozom peletini toplam 30 mL buz gibi soğuk PBS hacminde yıkayın.
- 1,5 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin ve ekzozomal peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın.
- Peletleri buz gibi soğuk PBS'de (15 cm'lik çanak başına ~ 25 μL) yeniden süspanse edin ve BCA protein test kiti ve 562 nm'de bir mikroplaka okuyucu kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
NOT: Protein konsantrasyonu, dH2O'da %0.1 Triton-X100 ile 1:2seyreltme ile ölçülür. % 80 birleşmede 15 cm'lik bir tabaktan (20 mL şartlandırılmış ortam) primer fibroblastlardan eksozom verimi ~ 3-4 μg'dir.
6. Eksozomların sükroz yoğunluk gradyanı ile karakterizasyonu
- Aşağıdakileri pipetleyerek (aşağıdan yukarıya) sakaroz gradyanını 13 mL ultra berrak bir tüpe yükleyin: 1.5 mL 2.0 M, 2.5 mL 1.3 M, 2.5 mL 1.16 M, 2.0 mL 0.8 M ve 2.0 mL 0.5 M sükroz çözeltileri.
- 30-100 μg eksozomları 0.25 M sükroz çözeltisi ile karıştırın ve hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
- Eksozomları gradyanların üzerine dikkatlice yükleyin ve numuneleri 100.000 x g ve 4 °C'de 2,5 saat boyunca ultra santrifüjleyin.
- Tüpleri ultra santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin ve gradyanın tepesinden başlayarak 1.0 mL'lik fraksiyonları toplayın. Bunları buz üzerinde 1.7 mL'lik tüplere aktarın.
- Her tüpe 110 μL %100 TCA ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
- 10.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın.
- Peleti 500 μL önceden soğutulmuş %80 etanol içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri -20 °C'de 10 dakika yıkamaya bırakın.
- 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Peletleri RT'de 10-15 dakika kurutun ve in vitro deneyler için peleti PBS'de yeniden süspanse edin. BCA protein test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün veya peleti doğrudan 14.5 μL dH2O, 5 μL 4x Laemmli tamponu ve western blot analizleri için 0.5 μL 1 M DTT içinde yeniden süspanse edin.
7. Batı leke analizi ile eksozom tespiti
- Adım 5.7'den 5-10 μg eksozomları 5 μL 4x Laemmli tamponu ve 0.5 μL 1 M DTT ile karıştırın, ardından son hacmi dH2O ile 20 μL'ye ayarlayın. Adım 6.9'dakiler de dahil olmak üzere tüm numuneleri 98 °C'de 5 dakika ısıtın.
- Numuneleri %10 TGX lekesiz bir jele yükleyin ve protein merdivenlerini üreticinin tavsiyelerine göre yükleyin.
NOT: İlgilenilen proteinin moleküler ağırlığına göre jelin yüzdesini seçin. - Jeli, yükleme boyası jelin dibine gelene kadar ~ 1 saat boyunca çalışan tamponda 100 V'ta çalıştırın.
NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve yüzdesine göre değişebilir. - Jeli görüntüleyin. Leke tutmayan jellerin görüntüleri, immünoblotlar için yükleme kontrolü olarak kullanılır.
- Jeli bir PVDF membranı kullanarak 80 V'ta 1,5 saat veya gece boyunca 4 °C'de 30 V'ta aktarın.
- Membranları RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda bloke edin.
- Spesifik antikorlar için membranları (Tablo 2) antikor tamponunda gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.
- Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla (Tablo 2) RT'de 1 saat çalkalama ile inkübe edin.
- Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları geliştirme solüsyonu ve kamera tabanlı bir görüntüleyici kullanarak görüntüleyin. Alternatif olarak, membranları geliştirmek için bir X-ışını filmi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, eksozomların büyük hacimlerde şartlandırılmış ortamdan uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılması için uygundur. Prosedür son derece tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1 , fare primer fibroblastlarının kültür ortamından saflaştırılan eksozomların transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüsünü göstermektedir. Şekil 2 , kanonik ekzozomal belirteçlerin protein ekspresyon modelini ve sitozolik (LDH) ve ER (kalneksin) protein kontaminantlarının yokluğunu göstermektedir. Şekil 3 , sakaroz yoğunluk gradyanlarından sonra kanonik ekzozomal belirteçlerin (Alix, CD9 ve CD81) dağılımını göstermektedir.
Şekil 1: Fare primer fibroblastlarının kültür ortamından izole edilen eksozomların temsili TEM görüntüsü. Gösterilen, bu nanoveziküllerin nispeten tekdüze boyutlarıdır. Siyah çizgiler boyunca tek tek veziküllerin çapını gösterir. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Eksozom, sitozolik ve ER belirteçlerine karşı antikorlarla incelenen eksozom lizatlarının immünoblotları. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (eksozom), sitozolik (LDH) ve ER (calnexin) belirteçleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sükroz yoğunluk gradyanı ile ayrılmış eksozomlar. Bireysel fraksiyonlar, Alix, CD9 ve CD81'e karşı antikorlarla batı lekesi üzerinde incelendi. İşaretleyicilerin fraksiyonlama modeline bağlı olarak, eksozomlar, 1.096-1.140 g/mL yoğunluklara karşılık gelen 3-6 fraksiyonlarında sürekli olarak çökelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sükroz (g) | Sükroz çalışma solüsyonu (mL) | |
| 2,0 milyon | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 milyon | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 milyon | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 milyon | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 milyon | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 milyon | 0.26 | 3.0 |
Tablo 1: Sükroz yoğunluk gradyan çözümleri.
| Antikor | Ev sahibi | Şirket | Katalog numarası |
| CD9 (İngilizce) | Sıçan | BD Biyolojik Bilimler | 553758 |
| CD81 Serisi | Fare | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-166029 Serisi |
| Alix (Alix) | Tavşan | d'Azzo laboratuvarı | Alix (Alix) |
| Filo1 | Fare | BD Biyolojik Bilimler | 610820 |
| Syndecan1 | Tavşan | Yaşam Teknolojileri | 36-2900 |
| Syntenin1 | Tavşan | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH (LDH) | Keçi | Kimya | AB1222 Serisi |
| Calnexin (Calnexin) | Keçi | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-6465 Serisi |
| sıçan-HRP | Eşek | Jackson Imm. Res Laboratuvarı | 112-035-003 |
| Fare-HRP | Keçi | Jackson Imm. Res Laboratuvarı | 115-035-044 |
| Tavşan-HRP | Keçi | Jackson Imm. Res Laboratuvarı | 111-035-144 |
Tablo 2: Birincil ve ikincil antikorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde belirtildiği gibi, eksozomların kültür ortamından başarılı bir şekilde izole edilmesi için kritik bir adım, yetişkin iskelet kasından birincil fare fibroblast kültürlerinin uygun şekilde kurulması ve sürdürülmesidir. Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındakiO2 seviyesi ~%2.5'tir)15. Primer fibroblastlar kültürde çok fazla geçtiğinde özellik değiştirecektir. Bu nedenle, ideal eksozom verimi için düşük bir geçiş sayısı zorunludur. Saflaştırılmış eksozomlar ya deney amaçlı hemen kullanılmalı ya da ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de dondurularak saklanmalıdır. Protokoldeki bir diğer önemli adım, her seferinde taze olarak hazırlanan sakkaroz solüsyonlarının kullanılmasıdır. Yöntemin bir sınırlaması, zaman alıcı olmasıdır, çünkü primer fibroblastlar genellikle diğer salgı hücreleri gibi yüksek miktarda eksozom salgılamaz. Bu nedenle, büyük kültürler kullanılmalıdır, bu da büyük hacimlerde şartlandırılmış ortamın işlenmesine neden olur.
Burada kullanılan diferansiyel santrifüjlemenin avantajı, ölçeklenebilir bir yaklaşımı (litreye kadar) temsil etmesi ve eksozomları birincil fibroblastlardan izole etmek için tercih edilen yöntem olmasıdır. Daha büyük hacimler için alternatif bir yöntem (kolon başına 100 mL'ye kadar) boyut dışlama kromatografisidir (SEC). Bu yöntem hızlıdır ve proteinleri eksozomlardan ayırabilir. Kolon eksozomları topaklamaz, bu nedenle daha fazla konsantrasyon veya santrifüjleme adımı gereklidir. SEC yönteminin dezavantajlarından biri, kolonun zamanla tıkanabilmesi ve aşırı yüklenebilmesidir. Diğer mevcut yöntemler, küçük hacimli biyolojik sıvıların (yani idrar, BOS, serum, plazma) ve ticari olarak temin edilebilen kitlerin kullanımına dayanmaktadır. Bu kitler tekrarlanabilirliği sağlasa da, maliyetlidir ve her zaman yüksek miktarda saf eksozom üretmezler. Eksozom saflaştırması için ana hatlarıyla belirtilen protokol basittir ve deneysel ihtiyaca bağlı olarak farklı hücre türlerine, tüm dokulara ve organlara veya diğer biyolojik sıvılara uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo, Genetik ve Gen Terapisinde Çocuklar için Kuyumcular (JFC) Bağış Kürsüsüne sahiptir. Bu çalışma kısmen NIH hibeleri R01GM104981, RO1DK095169 ve CA021764, Memphis Assisi Vakfı ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Hayır Kurumları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
