Summary
Desenvolver e testar dispositivos endovasculares para tratamento de aneurisma intracraniano ainda é de grande importância. A maioria dos modelos de aneurisma usados hoje sentem falta das características importantes de uma parede arterial degenerada ou da hemodinâmica de uma verdadeira bifurcação. Por isso, buscamos projetar um novo modelo de bifurcação de bolsa arterial em coelhos.
Abstract
O tratamento endovascular para aneurismas intracranianos ganhou importância nas últimas décadas, consequentemente há uma necessidade crescente de testar dispositivos endovasculares. Modelos animais respeitando as condições reológicas, hemodinâmicas e aneurismas são altamente justificados. Por isso, o objetivo do presente estudo foi projetar uma nova técnica cirúrgica padronizada e reprodutível para criar aneurismas de bifurcação de bolsa arterial autóloga com condições de parede não modificadas e modificadas em coelhos.
Os aneurismas de bifurcação foram criados por anastomose de ponta a ponta da direita na artéria carótida comum esquerda, ambas servindo como artérias parentais para a bolsa arterial, que foi microsurgicamente costurada. Os enxertos foram retirados da artéria carótida comum proximal direita, seja para o controle (n = 7, reimplicação autóloga imediata) ou modificada (n = 7, incubada com 100 unidades internacionais elastase por 20 minutos antes da re-implantação autóloga). A malote e a patência da artéria dos pais foram controladas pela angiografia da fluorescência imediatamente após a criação. No seguimento (28 dias), todos os coelhos foram submetidos à angiografia de ressonância magnética e angiografia de fluorescência, seguida de colheita de aneurisma, avaliação macroscópica e histológica.
Um total de 16 coelhos brancos da Nova Zelândia foram operados. Dois animais morreram prematuramente. No seguimento, 85,72% de todos os aneurismas permaneceram patente. Ambos os grupos revelaram um aumento no tamanho do aneurisma ao longo do tempo; isso foi mais pronunciado no grupo controle (6,48 ± 1,81 mm3 no momento da criação versus. 19,85 ± 6,40 mm3 no seguimento, p = 0,037) do que no grupo modificado (8,03 ± 1,08 mm3 no momento da criação contra 20,29 ± 6,16 mm3 no seguimento, p = 0,054).
Nossos achados demonstram a adequação desse novo modelo de coelho que permite a criação de aneurismas de bifurcação com diferentes condições de parede em uma abordagem microcirúrgica. Dada a excelente patency a longo prazo e a propriedade do crescimento do aneurisma ao longo do tempo, este modelo pode servir como uma importante ferramenta para avaliação pré-clínica de novas terapias endovasculares.
Introduction
Hemorragia subaracnóide resultante da ruptura do aneurisma intracraniano (IA) pode ser efetivamente controlada por técnicas de oclusão endovascular ou microcirúrgica 1,2,3,4. Diferentes terapias endovasculares, para superar a principal limitação da recidiva da IA após o enrolamento, ganharam importância nas últimas décadas gerando uma necessidade crescente de testar dispositivos endovasculares. Para testar essas novas abordagens de tratamento, modelos animais apropriados que respeitam as propriedades reológicas, as condições de hemodinâmica e aneurisma são altamente justificadas 5,6,7. Nesse contexto, estudos clínicos e pré-clínicos já revelaram o importante papel das condições da parede do aneurisma em relação à ruptura e recorrência do aneurisma após a oclusão, especialmente com foco na perda de células mural 7,8,9.
Até agora, aneurismas experimentais em coelhos têm sido mais frequentemente criados por tocos de artéria carótida comum (CCA) incubados por elastase ou por bolsas venosas suturadas em uma bifurcação cca artificial. 10,11,12,13,14,15,16 Assim, nunca foi descrito um verdadeiro modelo de bifurcação de bolsa arterial.
O objetivo deste estudo foi projetar uma técnica segura, rápida e padronizada para a criação microcirúrgica de aneurismas bifurcação com diferentes condições de parede em um modelo de coelho (Figura 1). Isso foi conseguido através da sutura de bolsas arteriais não modificadas e modificadas em uma bifurcação artificial criada de ambos os CCAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os cuidados veterinários foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais (todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Local de Cuidados Com Animais do Cantão Bern, Suíça (BE 108/16)) e realizados sob supervisão de um anestesista veterinário certificado pelo conselho. As diretrizes de ARRIVE e os princípios 3R foram rigorosamente seguidos17,18.
NOTA: Abrigar todos os animais a uma temperatura ambiente de 22\u201224 Celsius (°C) e manter um ciclo claro/escuro de 12 horas.. Forneça acesso gratuito à dieta de água, pelotas e ad libitum hay todas as vezes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste não paramétrico Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Considerou-se significativo um valor de probabilidade (p) de ≤ 0,05.
1. Fase pré-úrgica
- Realize um exame clínico pré-operatório detalhado de todos os coelhos planejados para a cirurgia imediatamente próximo a uma sala de cirurgia tranquila e asséptica mantendo uma temperatura de 23 ± 3 °C.
- Registo o peso de cada animal, avalie macroscopicamente as membranas mucosas, o tempo de recarga capilar e a qualidade do pulso.
- Mais adiante, realize a auscultação cardíaca com estetoscópio e palpação abdominal.
- Com base nos achados clínicos, atribuem uma classificação da Sociedade Americana de Anestesiologistas (ASA) a cada coelho19. Inclua apenas animais com pontuação ASA I no estudo.
- Raspe ambas as orelhas externas com um barbeador elétrico e aplique creme prilocaine-lidocaína em artérias e veias auriculares.
- Sedar o coelho com uma combinação de 20 miligramas (mg)/killograma (kg) de cetamina, 100 mg/kg de dexmedetomidina e 0,3 mg/kg de metadona injetada subcutânea (SC) através de uma seringa.
- Deixe cada animal imperturbável por pelo menos 15 minutos.
- A partir daí, sob oxigenação suplementar com 3 litros (l) /minuto (min) através de uma máscara facial solta e monitoramento constante através de um oxímetro de pulso, coloque uma cânula de 22 G na artéria central auricular esquerda e outra cânula de 22 G na veia auricular do ouvido contralateral.
- Raspe o campo cirúrgico (pescoço) e injete 0,75% de ropivacaína peri-incisional intradermicamente. Em seguida, raspe a testa e prepare-se para colocar sensores eletroencefalográficos pediátricos (EEG).
- Induzir anestesia geral com propofol 1-2 mg/kg por via intravenosa (IV) para efeito. Em seguida, entuba imediatamente a traqueia de todos os coelhos com um tubo de silicone (3 milímetros (mm) de diâmetro interno sob controle capnográfico. Depois, transporte todos os coelhos para a sala de cirurgia, coloque-os em recumbência dorsal e conecte o tubo a um sistema de círculo pediátrico.
- Alcançar o aprofundamento e manutenção da anestesia através de isoflurano em oxigênio, visando uma concentração máxima de isoflurane de extremidade máxima de 1,3%.
- Garantir o monitoramento clínico e instrumental (oximetria de pulso, doppler e pressão arterial invasiva, eletrocardiograma de 3 chumbo, EEG, monitoramento da temperatura retal e gases inalados e expirados) até a extubação traqueal.
- Para manter a hidratação, forneça o lactato de Ringer a uma infusão de taxa contínua (CRI) de 5 ml/kg/h através do acesso venoso. Confirme sempre a anestesia adequada usando pinças do dedo do dedo em um intervalo de 10 minutos.
- Desinfete o campo cirúrgico usando iodo povidone do manúbrio sterni para ambos os ângulos da mandíbula. Agora, realize o draping estéril do campo cirúrgico.
- Durante a cirurgia, forneça analgesia com lidocaína a um CRI de 50 microgramas (μg)/kg/min e fentanil a 3\u201210 μg/kg/h. Aplique ventilação espontânea ou assistida, bem como hipercapnia permissiva. Realize a análise de gás arterial pelo menos uma vez durante a cirurgia.
- Tratar hipotensão relevante (pressão arterial média < 60 mmHg) com noradrenalina. Evite hipotermia (temperatura retal ≤ 38 °C) usando uma almofada de aquecimento ou um sistema de aquecimento forçado de aquecimento.
2. Fase cirúrgica – Passo I
- Inicie a cirurgia com uma incisão mediana da pele do manúbrio sterni ao nível dos ângulos da mandíbula/laringe. Dissecar bruscamente a pele e o tecido mole com um bisturi, tesoura cirúrgica e fórceps. Separe o subcutis e o bloco de gordura medialmente por dissecção sem cortes.
- Entre no cume superior anterior do músculo estenicleidomastoide mediadamente no lado esquerdo por dissecção contundente, usando micro fórceps e tesoura cirúrgica.
- Macroscopicamente, realize a preparação contundente e separe cuidadosamente a CCA esquerda do nervo vagal distally para evitar parese laríngea usando ainda mais micro fórceps e tesoura cirúrgica (Figura 2). Note-se que a bifurcação da CCA esquerda serve como marco intraoperatório (Figura 3 e Figura 4A). Para todas as etapas seguintes, use um espalhador de tecido mole para melhorar a visualização cirúrgica.
- Após a preparação bem sucedida e a liberação da CCA distal esquerda do nervo vagal, administre papaverina (40 mg/ml, 1:1 diluída em 0,9% solução isotônica de cloreto de sódio) localmente. Proteja continuamente todos os segmentos de embarcações com micro cotonetes seguidos de uma administração papaverina externamente. Coloque a CCA esquerda encharcada de papaverina abaixo do tecido muscular autólogo para proteger o vaso da secagem sob a luz do microscópio de operação.
- Mude de lado enquanto maximiza o conforto do cirurgião durante o procedimento cirúrgico. Repita o mesmo procedimento cirúrgico no lado direito. Disseque a CCA distral e proximally até os marcos predefinidos (bifurcação carótida ao nível dos ângulos da mandíbula/laringe e veia jugular interna; Figura 4A,B). Reinserir um espalhador e administrar micro cotonetes e papaverina como descrito anteriormente.
- Antes da ligadura do CCA proximal direito, injete heparina (500 unidades internacionais (UI)/kg) sistematicamente através de um cateter auditivo venoso.
- Use um microscópio cirúrgico de agora em diante. Primeiro, ligar a CCA proximal direita com uma sutura 4-0 não absorvível diretamente no final do marco proximal macroscopicamente visível para evitar qualquer tensão no vaso arterial.
- Em segundo lugar, aplique uma ligadura 6-0 não absorvível exatamente 4\u20125 mm distally usando um clipe de vaso para medição, considerando que após cortar distally da primeira ligadura 4-0, a bolsa arterial resultante será de comprimento padronizado de cerca de 3\u20124 mm em cada animal (Figura 5A,C).
- Depois de apertar a ligadura 6-0, aperte a CCA direita o mais longe possível com um clipe de vaso temporário (como normalmente usado em cirurgia de aneurisma cerebral) para evitar qualquer dano endotelial e criar um longo segmento de vaso para irrigação, a fim de prevenir trombogênese (Figura 5B).
- Agora faça um corte distally para a ligadura 4-0 não absorvível. Para colher a bolsa arterial (Figura 5C), realize um segundo corte distally para a ligadura 6-0 não absorvível.
- Limpe a bolsa arterial meticulosamente de todo tecido mole e meça seu comprimento, largura e profundidade (Figura 5C) com um clipe de vaso. Se não for necessário mais modificações, mantenha o enxerto arterial autólogo em uma solução heparinizada (500 UI/100 ml em cloreto de sódio isotônico de 0,9%) à temperatura ambiente até uso posterior.
3. Degradação da bolsa arterial
- Se for necessária uma degradação da bolsa arterial, limpe-o meticulosamente do tecido mole e pré-insuse com 100 UI de elastase suína dissolvida em 5 ml de tris-tampão à temperatura ambiente no dia do experimento por 20 minutos. Não use uma técnica de escova. Incubar a bolsa arterial intra e extra-luminally usando um shaker.
- Antes de colocar a bolsa em uma solução heparinizada de cloreto de sódio isotônico de 0,9%, deslize-a três vezes por 3 minutos com fórceps anatômicos em 0,9% solução isotônica de cloreto de sódio para lavar o restante da descoramas porcina.
- Se necessário, mantenha o lúmen da bolsa arterial aberto com um microtubo feito de silicone; proteger meticulosamente a CCA esquerda e direita durante todo o procedimento cirúrgico com micro estofamentos molhados.
4. Fase cirúrgica – Passo II
- Para uma preparação adicional da CCA, coloque dois micro cotonetes redondos diretamente abaixo dela para mover a artéria de forma mais superficial. Agora, coloque um micro cotonete com um estofamento roxo sob a CCA esquerda no terço distal para melhor visualização da artéria.
- Lave a CCA proximal direita com uma solução de cloreto de sódio isotônico de 0,9% combinado com 500 UI de heparina dissolvida em 100 ml de cloreto de sódio isotônico de 0,9%. Para criar uma anastomose livre de tensão, coloque a CCA direita sob a musculatura de almofada de gordura/peritracheal usando uma tesoura cirúrgica para túnel para o lado esquerdo. Remova o tecido mole da artéria.
- Agora realize uma incisão bucal de 2 mm no lado proximal da CCA direita usando uma micro tesoura e fórceps.
- Mude o lado da mesa de operação. Corte a CCA distal esquerda com outro clipe temporário de vaso seguido pela CCA esquerda proximal com dois clipes temporários de vaso. Proteja todos os segmentos de vasos expostos de secar sob a luz cirúrgica usando micro cotonetes molhados.
- Liberte o terço distal da CCA esquerda completamente do tecido mole e realize uma arteriotomia. Use micro fórceps cirúrgicos e pegue delicadamente alguns tecidos moles. Agora eleve a artéria e incise a CCA distal esquerda lentamente com uma micro tesoura cirúrgica. Lave os segmentos de vasos com heparina (500 UI dissolvida em 100 ml de solução isotônica de cloreto de sódio 0,9%).
- Após a realização da arteriotomia com micro fórceps curvados e micro tesouras, amplie a arteriotomia localizada no terço distal da CCA esquerda, medindo cerca de 2 vezes do diâmetro da direita da artéria carótida e do enxerto autólogo. Isso permite o fluxo sanguíneo suficiente para a bolsa arterial.
- Tire a bolsa arterial da solução salina heparinizada. Coloque a bolsa no campo cirúrgico, onde a bifurcação está planejada. Comece a suturar a parte traseira da direita carótida sem corte, localizada com uma sutura 9-0 não absorvível, seguida de uma sutura no lado traseiro cranialmente localizado ao nível da incisão da boca do peixe. Finalize a costura da parte traseira do distal ao proximal por pontos únicos.
- Enquanto sutura, mantenha todas as bolsas pré-insubadas elas úmidas com irrigação contínua. Enquanto suturar a parede do vaso da bolsa, use micro fórceps cirúrgicos curvos para abrir suavemente o lúmen com sua ponta. Sempre que suturar partes da CCA direita esquerda ou proximal, use micro fórceps cirúrgicos retos. Depois, suturar a parte traseira horizontal.
- Em seguida, suturar o lado frontal horizontal, começando na cúpula do aneurisma movendo-se para sua base. Depois, comece com pontos individuais no lado da frente movendo-se caudally.
- Para todas as etapas 4.5\u20124.8 enquanto sutura a anastomose preste atenção apenas para pegar a parte do vaso perto da arteriotomia para evitar estenose iatrogênica. Além disso, umedeça continuamente todos os segmentos de vasos durante todo o procedimento cirúrgico extraluminal com uma seringa cheia de solução de cloreto de sódio heparinizado (500 UI dissol dissol em 100 ml de cloreto de sódio isotônico) e proteja-os com micro cotonetes molhados.
- Antes de terminar a anastomose, irrigar todo o complexo com solução de cloreto de sódio isotônico heparinizada de 0,9% intraluminal (500 UI dissol em 100 ml de cloreto de sódio isotônico) de 0,9%). Cuidado para que bolsas arteriais modificadas elastase devem ser costuradas o mais rápido possível devido à sua forte tendência de secar e trombose. Devido ao comportamento agressivo da concentração de elastase residual na bolsa em relação à digestão de vasos circunferenciais, proceda rapidamente com a cirurgia para reutilizar rapidamente o complexo do vaso.
- Remova todos os grampos vasculares temporários em sentido passo a passo.
- Remova o grampo distal da CCA esquerda. Aceite um sangramento menor e agite-o imprimindo suavemente micro cotonetes na anastomose. Em seguida, remova o grampo da CCA direita, pressione suavemente com micro swab e fórceps para evitar a formação de trombos.
- Se necessário, substitua os clipes vasculares temporários para fornecer coagulação suficiente. Depois, alivie os dois clipes do vaso do lado esquerdo proximally. Se necessário em qualquer etapa, substitua os clipes para permitir a coagulação ou para realizar a re-costura.
- Nesta fase realizam a angiografia da fluorescência do complexo vaso (Figura 6 e Figura 7).
NOTA: A angiografia da fluorescência é realizada administrando 1 ml de fluoresceína IV, utilizando 2 filtros de bandpass, um smartphone com câmera de vídeo e um holofote de bicicleta. Este procedimento já foi descrito em outros lugares 20,21,22. - Por último, feche o situs operacional. Readapt e sutura suavemente a almofada de gordura com uma sutura 3-0 resorbável com nódulos únicos para proteger a anastomose. Feche subcutis e pele da mesma forma.
5. Fase pós-úrgica
- Descontinuar a administração de isoflurane e analgesia sistêmica no final da cirurgia e fornecer extubação traqueal assim que o reflexo de engolir tiver retornado.
- Administrar 0,5 mg/kg de meloxicam IV, aspirina 10 mg/kg (ASS) IV, 100 μg de vitamina B12 SC e 20 mg/kg de clamoxyl IV.
- Fornecer oxigenação suplementar e aquecimento ativo até que os coelhos tenham recuperado espontaneamente a recumência severa.
- Realizar acompanhamento pós-operatório e cuidados com animais quatro vezes ao dia nos três primeiros dias, de acordo com as diretrizes para avaliação e manejo da dor em roedores e coelhos23,24.
- Administre analgesia pós-operatória através de um patch de fentanil (12 μg/h) aplicado no ouvido externo, meloxicam uma vez por dia SC por três dias e metadona como terapia de resgate SC, de acordo com a folha de pontuação para avaliação da dor. Administre 250 UI/kg de heparina de baixa molecular (LMH) subcutânea por três dias em todos os coelhos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após uma série piloto de sete animais, totalmente 16 animais foram incluídos no protocolo experimental. Dois animais morreram prematuramente e, portanto, foram excluídos da análise final (12,5% de mortalidade). Calculada em 14 animais, a taxa imediata de patência de aneurisma durante a angiografia da fluorescência foi de 71,43% em ambos, no grupo controle e modificado. Quatro aneurismas tiveram que ser reabertos com evacuação consecutiva de trombos e após uma repetida angiografia de fluorescência houve uma patência documentada em todos os casos (100%). A taxa de patency aneurisma em ressonância magnética e fluorescência-angiografia foi de 85,72% no controle e 85,72% no grupo modificado elastase no seguimento após 28 dias (dois animais apresentaram artéria parental completa e trombose aneurisma e, portanto, foram excluídos da análise posterior). A trombose parcial foi observada pela análise das reconstruções tridimensionais da imagem de Ressonância Magnética (Figura 9) em 3 dos 12 casos restantes. Ambos os grupos demonstraram um aumento no tamanho do aneurisma ao longo do tempo; grupo controle: 6,48 ± 1,81 mm3 no momento da criação contra 19,85 ± 6,40 mm3 no seguimento, p = 0,037 (todos os testes estatísticos foram realizados utilizando o teste não paramétrico Wilcoxon-Mann-Whitney-U); grupo modificado: 8,03 ± 1,08 mm3 no momento da criação vs. 20,29 ± 6,16 mm3 no seguimento, p = 0,054), não mostrando significância entre ambas as taxas de crescimento (p = 0,87). Não houve hemorragia relacionada ao aneurisma pós-operatório. A duração média do procedimento cirúrgico para o grupo controle foi de 164 ± 10 min (intervalo, 122\u2012187 min) em comparação com 201 ± 13 min (intervalo, 158\u2012250 min) para o grupo modificado. Uma média de 24 ± 1 suturas interrompidas (intervalo, 21\u201226) foi necessária para criar aneurismas no grupo controle, 25 ± 2 (intervalo, 18\u201228) pontos no grupo elastase. As medidas mortométricas da Figura 8 e da Figura 9 apresentam características histológicas, bem como as medidas morfométricas CE-3D-MRA de aneurismas de bifurcação no dia 28.
Figura 1: Fluxograma da configuração experimental.
No total, após uma fase de pilotagem de sete animais, 16 animais foram operados e randomizados para o grupo controle ou pré-tratamento de elastase. Dois animais morreram no início do pós-operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapa operacional inicial.
Passo operacional inicial, representando a artéria carótida esquerda (seta branca), nervo vagal (seta preta) (A) e a cuidadosa separação da artéria carótida esquerda do nervo vagal distralmente para evitar paresia laríngea (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema das etapas cirúrgicas.
O arco aórtico (§) com ambas as artérias carótidas (artéria carótida esquerda, x; artéria carótida direita, #) de um coelho branco da Nova Zelândia é mostrado (A). Na artéria carótida direita proximal, é realizada uma ligadura 4-0, e uma ligadura 6-0 adicionada distally (B). A bolsa arterial autóloga (*) já foi colhida e a parte cega da artéria carótida direita é suturada ao terço distal da artéria carótida esquerda (C) criando a bifurcação arterial complexa artificial (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A bifurcação da artéria carótida esquerda como marco distal para o lado esquerdo e direito (A, preto *) e a veia jugular interna como marco proximal para a preparação do lado direito (B, branco *). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: As fotografias mostram as ligaduras proximais 4-0 e 6-0 da artéria carótida direita para a criação de uma nova bolsa arterial vital (A), a colocação do clipe na artéria carótida direita acima das duas ligaduras (B) e a bolsa colhida autóloga (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Criação de complexos vitais arteriais (A) e após o pré-tratamento de elastase (A.1) aneurismas de bifurcação (*).
A mesma situação após a realização de uma angiografia de fluorescência mostrando patency das artérias parentais e dos aneurismas em si (B, B.1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Angiografia de fluorescência do complexo de vasos.
Foto ampliada (A) do situs operacional após a criação de um aneurisma de bifurcação complexo pré-tratado elastase (x). Preto * retrata a artéria carótida comum direita, branca * à esquerda. A linha pontilhada mostra o meio do pescoço. A mesma situação após a realização de uma angiografia de fluorescência mostrando patency das artérias parentais e do próprio aneurisma (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Exemplo de histologia em um zoom digital de 2 vezes e 20 vezes de um aneurisma vital na constelação de bifurcação.
A parede vital (#) é marcada por alta densidade celular. * retrata o lúmen do aneurisma, um lúmen da direita, b o lúmen da artéria carótida proximal esquerda, § o lado luminal ampliado do aneurisma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Achados histológicos correlacionados com a ressonância magnética.
(A) Exemplo de zoom digital de bolsa arterial modificada costurada em uma bifurcação arterial A cúpula parcial de aneurisma trombose (#), o lúmen do aneurisma (*), o lúmen do proximal esquerdo (b) e distal (a) bem como o lúmen da artéria carótida direita (c). (B) retrata as medidas morfométricas CE-3D-MRA do aneurisma após 28 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| n | Tempo de Operação (min) |
Peso (g) | # de Suturas n |
Diâmetro artéria parental proximal ao Aneurisma (mm) |
Tempo de sutura (min) |
Artéria parental de diâmetro distal ao Aneurisma (mm) |
Linha de base do Aneurisma de Diâmetro (mm) |
Linha de base de volume (mm3) |
Acompanhamento do Aneurisma de Diâmetro (mm) |
Acompanhamento de volume (mm3) |
|
| Bolsas vitais | |||||||||||
| 1 | 187 | 4100 | 24 | 2.5 | 54 | 2.8 | 1 | 1.96 | 1.5 | 5 | |
| 2 | 183 | 4200 | 24 | 3.3 | 53 | 2.9 | 1 | 2.35 | 2.8 | 7.73 | |
| 3 | 163 | 3800 | 26 | 3.4 | 66 | 3 | 1.5 | 4.71 | 3.1 | 28.03 | |
| 4 | 122 | 3600 | 22 | 2.8 | 42 | 2.8 | 2 | 6.28 | 3.2 | 47.37 | |
| 5 | 180 | 3700 | 24 | 3.2 | 45 | 3 | 2 | 10.99 | 2 | 15.82 | |
| 6 | 149 | 3700 | 21 | 2.3 | 47 | 2.2 | 2 | 12.56 | 3.1 | 15.11 | |
| Média ± SEM | 164,00 ± 10.22 | 3850,00 ± 99,16 | 23.50 ± 0.72 | 2.92 ± 0.19 | 51.17 ± 3.52 | 2,78 ± 0,12 | 1,58 ± 0.201 | 6.48 ± 1,81 | 2.62 ± 0.29 | 19.85 ± 6.40 | |
| Bolsas elastase | |||||||||||
| 1 | 158 | 3400 | 26 | 2.9 | 76 | 2.6 | 2 | 9.42 | 2.1 | 12.26 | |
| 2 | 180 | 3400 | 27 | 3.5 | 43 | 2.8 | 2 | 10.99 | 3.3 | 46.16 | |
| 3 | 250 | 3900 | 27 | 3.5 | 70 | 3.2 | 1.4 | 6.59 | 2.2 | 10.1 | |
| 4 | 208 | 4200 | 28 | 3 | 45 | 2.6 | 2 | 9.42 | 2.6 | 24 | |
| 5 | 192 | 3660 | 18 | 2.8 | 53 | 2.8 | 2 | 8.24 | 2.7 | 4.03 | |
| 6 | 217 | 3200 | 24 | 2.7 | 58 | 2.8 | 1.5 | 3.53 | 2.2 | 25.16 | |
| Média ± SEM | 200,83 ± 13:00 | 3626,67 ± 151,58 | 25:00 ± 1.51 | 3.07 ± 0.14 | 57,50 ± 5.43 | 2.80 ± 0.09 | 1,82 ± 0,12 | 8.03 ± 1.08 | 2.52 ± 0.19 | 20.29 ± 6.16 | |
| p-valor | 0.06 | 0.22 | 0.14 | 0.46 | 0.42 | 0.5 | // | 0.46 | // | 0.87 | |
Tabela 1: Características cirúrgicas e medidas morfométricas CE-3D-MRA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nosso estudo demonstra a viabilidade de criar um verdadeiro modelo de aneurisma de bifurcação com diferentes condições de parede em coelhos. No total, 14 coelhos brancos da Nova Zelândia com peso médio de 3,7 ± 0,09 kg e idade média de 112 ± 3 dias foram incluídos no estudo. 85,72% de todos os aneurismas permaneceram patenteados durante um seguimento aos 28 dias. Dois animais morreram prematuramente (12,5% de mortalidade).
Estudos anteriores sugeriram uma variedade de modelos de aneurisma extracranal para analisar o manejo do tratamento do aneurisma endovascular 25,26,27,28. No entanto, nenhum deles permitiu a comparação de diferentes condições de parede. Experimentos anteriores já estudaram aneurismas descelularizados em um aneurisma modelo de rato de parede lateral29. O modelo apresentado no presente estudo representa um refinamento translacional, uma vez que um verdadeiro modelo de bifurcação de bolsa arterial imitando diferentes condições de parede ainda não foi descrito na literatura. Além disso, os aneurismas intracranianos em humanos ocorrem com mais frequência nas bifurcações arterials30,31. Além disso, os modelos de coelho mostraram-se muito próximos aos seres humanos no que diz respeito à hemodinâmica e à comparabilidade do sistema de coagulação e, ainda mais, à prova de custo-benefício 32,33,34.
Modelos de bolsa venosa em coelhos (exclusivamente, bilobular complexo, bisaccular complexo ou com pescoços largos) já foram bem descritos. 12,13,35,36 Como mencionado, ainda não foi descrita a técnica de implantação de bolsas arteriais verdadeiras ou paredes de vasos degeneradas em uma bifurcação artificial. 37,38,39 Em nosso estudo, a taxa de mortalidade foi de 12,5%. Em comparação com a literatura com altas taxas de morbidade e mortalidade até 50%, ficamos claramente abaixo e, assim, demonstramos a viabilidade de criar aneurismas complexos de bifurcação arterial em coelhos com baixa morbidade, mortalidade e alta curto prazo, bem como taxas de patêção de aneurisma de longo prazo27. Um fator importante adicional que possibilitou a redução das taxas de morbidade e mortalidade nesta série de coelhos foi a implementação de técnicas cirúrgicas a partir de experiências anteriores do nosso laboratório12. Exemplar, a técnica de preparar cuidadosamente um longo segmento da CCA esquerda foi aplicada e refinada apenas para dissecar o terço distal, especialmente para evitar lesões iatrogênicas no nervo vagal e nervos laríngeos superiores. Além disso, o tecido mole altamente trombogênico foi removido meticulosamente de ambos os CCAs antes de realizar uma anastomose sem tensão. As suturas, sempre começando na parte traseira para um melhor controle visual, foram mantidas em baixo número para evitar trombogênese iatrogênica. Se necessário, foi realizada a vedação com tecido adiposo autólogo ao redor da anastomose para minimizar o risco de hemorragia pós-operatória; da mesma forma, readapting e suturando a almofada de gordura diretamente acima da anastomose forneceu efeito protetor adicional. Uma preparação controlada e dissecção do nervo vagal com fibras laríngeas associadas, bem como uma preparação suficiente da CCA direita proximally e distally para a criação de uma anastomose sem tensão, desempenham papéis-chave na redução da mortalidade e morbidade por problemas respiratórios ou paralisia laríngea12.
Usando o regime anticoagulação com LMH por três dias, o uso de ASS (fornecido como um único tiro imediato pós-operatório) juntamente com a recém-iniciada administração sistêmica de heparina antes de fechar a CCA direita levou a 85,72% de aneurisma e patência de vasos-pais. Esses resultados estão em consonância com nossas experiências anteriores com os modelosde bolsa venosa 10,11,12,13,40. Nesse sentido, a angiografia da fluorescência intraoperatória também contribuiu para boas taxas de patência de longo prazo com redução da morbidade. Em casos de detecção de trombos no próprio aneurisma ou na artéria dos pais, a reabertura da anastomose foi realizada com evacuação detrombos 20. Não foi observada hemorragia aneurisma espontânea. No entanto, a irrigação extraluminal contínua e a proteção dos vasos com micro cotonetes molhados, bem como a irrigação intraluminal com solução salina heparinizada de 0,9% contribuíram aditivamente para combater as influências trombogênicas. Em nossa opinião, a anestesia equilibrada e o monitoramento contínuo e extensivo intraoperatório e pós-operatório também influenciaram positivamente a mortalidade e a morbidade. Estender o atendimento analgésico por pelo menos 72 h e garantir uma alimentação ininterrupta poderia ter contribuído para reduzir outras complicações, como úlceras de estresse gastrointestinal.
Vários estudos demonstraram um aumento mais forte do tamanho do aneurisma em aneurismas deteriorados ao longo do tempo 7,29. Em nossa série, essas descobertas não puderam ser confirmadas. O grupo controle demonstrou um crescimento significativo do aneurisma ao longo do tempo. No entanto, o valor p do grupo modificado mostrou tendência para um padrão de crescimento significativo em comparação com o grupo controle (p = 0,054). Esta taxa de crescimento insignificante com volumes iguais no grupo modificado elastase após 28 dias poderia pelo menos ser parcialmente explicada pelo grande volume inicial de aneurisma. Além disso, o número de animais de pequeno porte, bem como o seguimento de apenas 28 dias, é uma razão potencial pela qual o crescimento extensivo do aneurisma foi observado apenas em dois casos. Além disso, há uma curva de aprendizado envolvida para o cirurgião 14,15,41.
Uma comparação direta dos malotes de bifurcação modificados pelo controle e elastase, em termos de tratamento de bobinas endovasculares, ainda está em falta. Para bolsas venosas, jáfoi relatada uma taxa inicial de oclusão completa e incompleta de 35% e 65%. Após 3\u20126 meses de acompanhamento, a oclusão completa poderia ser objetificada em 15%27. Quanto às excelentes taxas de patency deste novo modelo animal apresentado, os malotes degenerados arteriais podem ser avaliados com embolização de bobina, tratamento de stent ou embolização de bobina assistida por stent em um cenário prospectivo em condições fisiológicas e filosofosiológicas.
As bolsas arteriais modificadas por elastase são difíceis de serem costuradas porque as paredes da bolsa são muito pegajosas; a bolsa em si reage muito trombogenicamente e, portanto, o lúmen não é tão naturalmente aberto em comparação com o grupo controle. Ao suturar a bolsa, certifique-se de que nenhuma tensão seja aplicada nos vasos circunferentes porque elastase se comporta agressivamente na angioarquitura das artérias parentais como mencionado acima.
Por fim, esse modelo, se praticado ao longo de um determinado período de tempo, proporciona grande valor para os residentes neurocirúrgicos na adaptação de habilidades microcirúrgicas, realizando continuamente procedimentos altamente microcirúrgicos42. Após o treinamento inicial, as técnicas podem ser facilmente aplicadas e realizadas de forma segura e padronizada.
As limitações deste estudo são o baixo número animal em termos de estudo de viabilidade, bem como as propriedades trombogênicas potenciais do material de sutura e da bolsa arterial modificada. Mais adiante, este modelo retrata um modelo de aneurisma extracraniano que não pode ser definido equivalente a uma configuração intracraniana. Além disso, esse modelo requer muitos recursos (um veterinário, um assistente cirúrgico, uma enfermeira e máquinas de anestesia). Uma vantagem da abordagem é a possibilidade de implantação de bolsas arterials modificadas de elastase, bem como bolsas não modificadas em uma cirurgia. Assim, os princípios 3R relativos ao bem-estar animal são estritamente seguidos.
Em resumo, apresentamos um protocolo novo, reprodutível e padronizado para criar aneurismas de bifurcação de bolsa arterial autóloga imitando diferentes condições de parede. Dada a excelente patency de longo prazo e propriedade do crescimento do aneurisma ao longo do tempo no grupo de malotes não modificados e modificados, este modelo pode servir como uma ferramenta importante para uma avaliação pré-plínica adicional de novos dispositivos endovasculares. Com certeza, esses resultados devem ser confirmados em uma série maior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Este trabalho foi apoiado pelos fundos de pesquisa do Conselho de Pesquisa, Kantonsspital Aarau, Aarau, Suíça e da Fundação Nacional de Ciência snf (310030_182450). Os autores são os únicos responsáveis pelo desenho e conduta do estudo apresentado e não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Olgica Beslac e Kay Nettelbeck pelo excelente apoio e assistência técnica durante a fase peri-operatória e a Alessandra Bergadano, DVM, PhD, pela supervisão dedicada da saúde animal a longo prazo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Biemer vessel clip (2 x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | temporary |
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Electrocardiogram electrodes | any other | ||
| Elastase | Sigma Aldrich | 45125 | any generic |
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | any generic |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | any generic |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | any generic |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | any generic |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | any generic |
| Glyco | any generic | ||
| Heating pad | any other | ||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Ketamine | Pfizer | 342261 | any generic |
| Laboratory shaker | Stuart | SRT6 | any other |
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | any generic |
| Longuettes | any other | ||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | any generic |
| Microtubes | any other | ||
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | any generic |
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | any other | |
| Papaverine | Bichsel | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | any generic | |
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | any generic | |
| Pulse oxymeter | any generic | ||
| Rectal temperature probe (neonatal) | any other | ||
| Ropivacaine | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | any generic |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Stethoscope | any other | ||
| Straight and curved micro-forceps | any other | ||
| Straight and curved micro-scissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 ml, 2ml and 5 ml | any other | ||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | any generic |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | any generic | ||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | any generic |
| Yasargil titan standard clip (2 x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Wanderer, S., Mrosek, J., Gessler, F., Seifert, V., Konczalla, J. Vasomodulatory effects of the angiotensin II type 1 receptor antagonist losartan on experimentally induced cerebral vasospasm after subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica (Wien). 160 (2), 277-284 (2018).
- Vatter, H., et al. Effect of delayed cerebral vasospasm on cerebrovascular endothelin A receptor expression and function. Journal of Neurosurgery. 107 (1), 121-127 (2007).
- Andereggen, L., et al. The role of microclot formation in an acute subarachnoid hemorrhage model in the rabbit. Biomed Research International. , 161702 (2014).
- Eriksen, N., et al. Early focal brain injury after subarachnoid hemorrhage correlates with spreading depolarizations. Neurology. 92 (4), 326-341 (2019).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 20 (2019).
- Bouzeghrane, F., Naggara, O., Kallmes, D. F., Berenstein, A., Raymond, J. International Consortium of Neuroendovascular C. In vivo experimental intracranial aneurysm models: a systematic review. American Journal of Neuroradiology. 31 (3), 418-423 (2010).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32 (4), 772-777 (2011).
- Marbacher, S., et al. Long-term patency of complex bilobular, bisaccular, and broad-neck aneurysms in the rabbit microsurgical venous pouch bifurcation model. Neurological Research. 34 (6), 538-546 (2012).
- Sherif, C., Marbacher, S., Erhardt, S., Fandino, J. Improved microsurgical creation of venous pouch arterial bifurcation aneurysms in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 32 (1), 165-169 (2011).
- Sherif, C., et al. Microsurgical venous pouch arterial-bifurcation aneurysms in the rabbit model: technical aspects. Journal of Visualized Experiments. 51, 2718 (2011).
- Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. Journal of Neurointerventional Surgery. 8 (5), 521-525 (2016).
- Miskolczi, L., Guterman, L. R., Flaherty, J. D., Hopkins, L. N. Saccular aneurysm induction by elastase digestion of the arterial wall: a new animal model. Neurosurgery. 43 (3), 595-600 (1998).
- Lewis, D. A., et al. Morbidity and mortality associated with creation of elastase-induced saccular aneurysms in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 30 (1), 91-94 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Group NCRRGW. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (4), 991-993 (2011).
- Tornqvist, E., Annas, A., Granath, B., Jalkesten, E., Cotgreave, I., Oberg, M. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), (2019).
- Irlbeck, T., Zwissler, B., Bauer, A. ASA classification: Transition in the course of time and depiction in the literature]. Der Anaesthesist. 66 (1), 5-10 (2017).
- Grüter, B. E., et al. Fluorescence Video Angiography for Evaluation of Dynamic Perfusion Status in an Aneurysm Preclinical Experimental Setting. Oper Neurosurg (Hagerstown). 17 (4), 432-438 (2019).
- Grüter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Strange, F., et al. Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models. Journal of Visualized Experiments. (149), e59782 (2019).
- Weaver, L. A., Blaze, C. A., Linder, D. E., Andrutis, K. A., Karas, A. Z. A model for clinical evaluation of perioperative analgesia in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 49 (6), 845-851 (2010).
- ACLAM Task Force Members. Public statement: guidelines for the assessment and management of pain in rodents and rabbits. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 46 (2), 97-108 (2007).
- Forrest, M. D., O'Reilly, G. V. Production of experimental aneurysms at a surgically created arterial bifurcation. American Journal of Neuroradiology. 10 (2), 400-402 (1989).
- Kwan, E. S., Heilman, C. B., Roth, P. A. Endovascular packing of carotid bifurcation aneurysm with polyester fiber-coated platinum coils in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 14 (2), 323-333 (1993).
- Spetzger, U., Reul, J., Weis, J., Bertalanffy, H., Thron, A., Gilsbach, J. M. Microsurgically produced bifurcation aneurysms in a rabbit model for endovascular coil embolization. Journal of Neurosurgery. 85 (3), 488-495 (1996).
- Bavinzski, G., et al. Experimental bifurcation aneurysm: a model for in vivo evaluation of endovascular techniques. Minimal Invasive Neurosurgery. 41 (3), 129-132 (1998).
- Marbacher, S., Marjamaa, J., Abdelhameed, E., Hernesniemi, J., Niemela, M., Frosen, J. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Viusalized Experiments. (92), e51071 (2014).
- Alfano, J. M., et al. Intracranial aneurysms occur more frequently at bifurcation sites that typically experience higher hemodynamic stresses. Neurosurgery. 73 (3), 497-505 (2013).
- Sakamoto, S., et al. Characteristics of aneurysms of the internal carotid artery bifurcation. Acta Neurochirurgica (Wien). 148 (2), 139-143 (2006).
- Dai, D., et al. Histopathologic and immunohistochemical comparison of human, rabbit, and swine aneurysms embolized with platinum coils. American Journal of Neuroradiology. 26 (10), 2560-2568 (2005).
- Shin, Y. S., Niimi, Y., Yoshino, Y., Song, J. K., Silane, M. Berenstein A. Creation of four experimental aneurysms with different hemodynamics in one dog. American Journal of Neuroradiology. 26 (7), 1764-1767 (2005).
- Abruzzo, T., Shengelaia, G. G., Dawson, R. C., Owens, D. S., Cawley, C. M., Gravanis, M. B. Histologic and morphologic comparison of experimental aneurysms with human intracranial aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 19 (7), 1309-1314 (1998).
- Spetzger, U., Reul, J., Weis, J., Bertalanffy, H., Gilsbach, J. M. Endovascular coil embolization of microsurgically produced experimental bifurcation aneurysms in rabbits. Surgical Neurology. 49 (5), 491-494 (1998).
- Reul, J., Weis, J., Spetzger, U., Konert, T., Fricke, C., Thron, A. Long-term angiographic and histopathologic findings in experimental aneurysms of the carotid bifurcation embolized with platinum and tungsten coils. American Journal of Neuroradiology. 18 (1), 35-42 (1997).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2020).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical Intracranial Aneurysm Models: A Systematic Review. Brain Sciences. 10 (3), 134 (2020).
- Marbacher, S., Wanderer, S., Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J. Saccular Aneurysm Models Featuring Growth and Rupture: A Systematic Review. Brain Sciences. 10 (2), 101 (2020).
- Coluccia, D., et al. A microsurgical bifurcation rabbit model to investigate the effect of high-intensity focused ultrasound on aneurysms: a technical note. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 21 (2014).
- Hoh, B. L., Rabinov, J. D., Pryor, J. C., Ogilvy, C. S. A modified technique for using elastase to create saccular aneurysms in animals that histologically and hemodynamically resemble aneurysms in human. Acta Neurochirurgica (Wien). 146 (7), 705-711 (2004).
- Morosanu, C. O., Nicolae, L., Moldovan, R., Farcasanu, A. S., Filip, G. A., Florian, I. S. Neurosurgical Cadaveric and In Vivo Large Animal Training Models for Cranial and Spinal Approaches and Techniques - Systematic Review of Current Literature. Neurologia i neurochirurgia polska. 53 (1), 8-17 (2019).
