Summary
אנו מדגמים בדיקת ECL כפולה פשוטה המשלבת 7 מבחני נוגדנים עצמיים יחד. הבדיקה מסוגלת לבצע סינון ל-T1D ולמחלות אוטואימוניות רבות אחרות, בו זמנית, כולל צליאק, מחלת בלוטת התריס אוטואימונית ותסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית 1.
Abstract
נוגדנים עצמיים של איים (IAbs) נמצאים בשימוש נרחב באבחון וחיזוי סוכרת מסוג 1 (T1D). ארבעה IAbs עיקריים לאינסולין (IAA), גלוטמט דקרבוקסילאז-65 (GADA), אנטיגן אינסולינומה -2 (IA-2A) ואבץ טרנספורטר-8 (ZnT8A) חשובים באותה מידה לחיזוי מחלות. כיום, עד 40% מהחולים המאובחנים עם T1D ממשיכים לפתח הפרעות אוטואימוניות אחרות. למרבה הצער, שיטות הסינון הנוכחיות המשתמשות בנוגדן עצמי יחיד למדידה הן מייגעות ולא יעילות עבור מחקרי סינון בקנה מידה גדול. לאחרונה פיתחנו בדיקה פשוטה של אלקטרוכמילומינסנציה מרובבת (ECL) כדי לטפל בבעיות הנוכחיות הללו. הבדיקה משלבת את כל 7 בדיקות הנוגדנים העצמיים לבאר אחת. כל באר כוללת שלושה IAbs (IAA, GADA ו-IA-2A), נוגדנים עצמיים לפרוקסידאז של בלוטת התריס (TPOA) וגלובולין של בלוטת התריס (ThGA) לזיהוי מחלות אוטואימוניות של בלוטת התריס, נוגדנים עצמיים לטרנסגלוטמינאז רקמתי (TGA) למחלת צליאק, ונוגדנים עצמיים לאינטרפרון אלפא (IFNαA) לתסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית-1 (APS-1); כל אלה מסננים T1D ומחלות אוטואימוניות רלוונטיות אחרות, בו זמנית. בדיקת המולטיפלקס ECL מבוססת על פלטפורמת בדיקת ECL יחידה, אך במקום זאת משתמשת בלוח המולטיפלקס המשלב מספר מבחני נוגדנים עצמיים, עד 10, לבאר אחת. ההבדל העיקרי מבדיקת ECL יחידה הוא שכל קומפלקס נוגדנים-אנטיגן שנוצר בשלב הנוזלי מרוסן על נקודה מסוימת בכל באר באמצעות מערכת מקשר על צלחת המולטיפלקס. בדיקת 7-Plex ECL, במחקר הנוכחי, מאומתת כנגד מבחני רדיו סטנדרטיים (RBA) ומבחני ECL בודדים, תוך שימוש בקבוצה גדולה של חולי T1D שאובחנו לאחרונה ובקרות בריאות תואמות גיל, וכתוצאה מכך רגישות וספציפיות מצוינת לבדיקה.
Introduction
סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה כרונית קשה הנפוצה ביותר בילדות. נכון לעכשיו, כ -1.4 מיליון אנשים יש T1D בארצות הברית; באופן מדהים, השכיחות של T1D עולה בהתמדה בשיעור של 3-5% בכל שנה ברחבי העולם והוכפלה בשני העשורים האחרונים, במיוחד בקרב ילדים צעירים 1,2. נוגדנים עצמיים של איים (IAbs) במחזור הדם הם הסמן הביולוגי האמין ביותר כיום. ה-IAbs עשוי להופיע שנים לפני שה-T1D הקליני מתפתחב-3. נכון לעכשיו, ארבעה IAbs עיקריים נמצאים בשימוש נרחב באבחון T1D ובבדיקת סיכונים, כולל נוגדנים עצמיים לאינסולין (IAA), גלוטמט דקרבוקסילאז-65 (GADA), אנטיגן אינסולינומה -2 (IA-2A) ואבץ טרנספורטר-8 (ZnT8A). ארבעת ה-IAbs האלה חשובים באותה מידה בחיזוי התפתחות T1D. הסיווג של T1D הוגדר מחדש לאחרונה כנוכחות של ≥2 מכל 4 IAbs עם מטבוליזם גלוקוז תקין כשלב המחלה 14.
במחקר האוטואימוניות לסוכרת בצעירים (DAISY), התגלה כי אחד מכל ארבעה ילדים בסיכון ל- T1D צפוי להתקדם לאיונים, צליאק, בלוטת התריס או אוטואימוניות שגרונית ובאופן בולט יותר, כ -40% מהחולים שאובחנו עם T1D מפתחים בסופו של דבר מחלה אוטואימונית נוספת 5,6,7 . זיהוי נוגדנים עצמיים חיוני לחיזוי ואבחון של מחלות אוטואימוניות אלה ואמור לספק טיפול קליני טוב יותר לחולים. אין כיום דרך קלה וזולה לסנן את המחלות האוטואימוניות המרובות הללו. שיטות הסינון הנוכחיות באמצעות בדיקת קשירת רדיו סטנדרטית (RBA), עם מדידת נוגדנים עצמיים יחידה, הן מייגעות ולא יעילות להקרנה בקנה מידה גדול.
כאן, נתאר את בדיקת ה- ECL הפשוטה שפותחה לאחרונה, אותה אימתנו באמצעות פלטפורמת בדיקת ECL אחת 8,9,10,11. בדיקת המולטיפלקס ECL משלבת 7 בדיקות נוגדנים עצמיים לבאר אחת, תוך שימוש ב-15 μL בלבד של סרום, ומסוגלת לבצע בדיקות סקר לאיתור T1D ומספר מחלות אוטואימוניות רלוונטיות בו זמנית, כולל מחלת צליאק, מחלת בלוטת התריס אוטואימונית ו-APS-1. בדיקת ZnT8A ECL לא פותחה באותה עת ולא נכללה במבחן המולטיפלקס. בדיקת המולטיפלקס ECL מספקת כלי מצוין לתפוקה גבוהה בבדיקת סקר באוכלוסייה הכללית עבור T1D ומחלות אוטואימוניות מרובות.
Protocol
פרוטוקול המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית המרובים של קולורדו.
1. הכנת חיץ
- צור את מאגר התוויות (2x PBS, pH 7.9). באמצעות 400 מ"ל של מים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה (DD), יש להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS. כדי לכוונן את ה- pH של התמיסה, הוסף NaOH עד שהוא מגיע ל-7.9.
- צור ביוטין של 3 mM על ידי המסת 1 מ"ג ביוטין לתוך 588 μL של מאגר תיוג שנוצר בעבר. הפוך 3 mM Ru Sulfo-NHS על ידי המסת 150 nmol של Ru Sulfo-NHS לתוך 50 μL של חיץ תיוג.
- צור את מאגר האנטיגן (1% BSA) על ידי לקיחת 500 מ"ל של PBS 1x והוספת 5 גרם של אלבומין בסרום בקר (BSA) לתמיסה. הכן 0.5 M של תמיסת חומצה אצטית. הכן מאגר Tris-HCl של 1 M באמצעות בסיס Trizma והתאמת ה- pH ל- 9.0.
- עבור חיץ הציפוי (3% חוסם A), קח 500 מ"ל של 1x PBS והוסף 15 גרם של חוסם A. הכן את חיץ הכביסה (0.05 % Tween 20, PBST) על ידי ערבוב 5000 מ"ל של 1x PBS עם 2.5 מ"ל של Tween 20. צור מאגר קריאה (2x Read Buffer T עם חומרים פעילי שטח) על-ידי הוספת 500 מ"ל של מי DD ו-500 מ"ל של 4x Read Buffer T עם חומרים פעילי שטח.
הערה: כדי לשמור על עקביות בין המבחנים, חשוב שגם פתרונות הביוטין וגם פתרונות Ru Sulfo-NHS ייווצרו ממש לפני הליך ההתוויה ולא ייווצרו ויאוחסנו לשימוש עתידי.
2. תיוג כל חלבון אנטיגן עם ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS בנפרד
הערה: כדי לקבל תגובת תיוג יעילה יותר, השתמש בריכוז חלבון אנטיגן של ≥0.5 מ"ג/מ"ל.
- חשב את המספר הטוחן של כל חלבון אנטיגן ואת המספרים הטוחנות של הביוטין ו- Ru Sulfo-NHS. הוסף כמות נאותה של ביוטין או Ru Sulfo-NHS לחלבון אנטיגן לתגובת תיוג בהתאם ליחס הטוחנות של חלבון אנטיגן לביוטין או Ru Sulfo-NHS.
- עבור האנטיגן בעל המשקל המולקולרי הקטן יותר (≤10 kDa), כגון חלבון פרואינסולין, השתמש ביחס טוחן של 1:5 (אנטיגן: ביוטין ו- Ru Sulfo-NHS). עבור האנטיגן בעל המשקל המולקולרי הגדול יותר (>50 kDa), כגון חלבון GAD, השתמש ביחס טוחן של 1:20. עבור האנטיגן בעל משקל מולקולרי בינוני (10-50 kDa), השתמש ביחס טוחן מותאם בין 1:5-1:20.
- הן עבור הביוטין והן עבור Ru Sulfo-NHS, חלקו כל משקל אנטיגן במשקלים המולקולריים המתאימים להם כדי לקבל את מספר טוחנות האנטיגן עבור כל אחד מהם. חלקו את המספר הטוחן בריכוז כדי לקבל את נפח הביוטין. חזור על זה עבור Ru Sulfo-NHS.
- ערבבו את חלבון האנטיגן עם ביוטין באמצעות יחס טוחנות תקין, שנקבע בשלב 2.2. ואז לעשות את אותו הדבר עבור Ru Sulfo-NHS.
הערה: כדי לייעל את תגובת הסימון, כל כימיקלים מחזרים כגון טריס או גליצין במערכת החיץ צריכים להיות מוחלפים ל-2x PBS buffer, pH 7.9 על ידי עמודת הספין של הגודל. פרוטוקולי הסימון של ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS זהים. - מכסים את צינורות התגובה ברדיד אלומיניום ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת. הסיבה המכסה את צינורות התגובה בנייר כסף היא מכיוון שגם ריאגנטים של ביוטין וגם של Ru Sulfo-NHS רגישים לאור.
- פריים את עמודת הספין של 2 מ"ל או 5 מ"ל בזמן שצינורות התגובה דוגרים (גודל עמודת הספין נקבע על ידי הנפח המועלה לעמודה). מלא את עמודת הסיבוב במאגר PBS 2x ולאחר מכן בצע צנטריפוגה ב-1,000 x g למשך 2 דקות בכל פעם, ובסך הכל שלוש פעמים.
- עצור את תגובת התיוג לאחר שצינורות התגובה סיימו לדגור. כדי לעצור את התגובה, טהרו את חלבון האנטיגן המסומן על ידי העברתו דרך עמודת הספין פעם אחת. לאחר מכן צנטריפוגה של העמודה ב 1,000 x גרם במשך 2 דקות.
- חשב את ריכוז האנטיגן הכולל המסומן על-ידי חלוקת כמות חלבון האנטיגן הקיים בנפח הסופי. Aliquot 50 μL של חלבון אנטיגן מסומן מטוהר לכל צינור ולאחסן את aliquots ב -80 °C לשימוש לטווח ארוך.
הערה: חשוב להיות מודעים לכך שבכל פעם שעמודת הספין מעבירה את חלבון האנטיגן, יהיה שיעור שימור של כ-90-95%.
3. הגדר את הריכוז והיחסים הטובים ביותר עבור שני האנטיגנים המסומנים עבור הבדיקה (בדיקת לוח משבצות)
הערה: מכיוון שבדיקת ECL-IAA במבחן 7-Plex זה דורשת טיפול חומצי בדגימות סרום, בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן צריכה לעבור שלב זה לפני הדגירה עם תערובת האנטיגן המסומנת.
- החל את בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן בנפרד לפני הפעלת בדיקת המולטיפלקס. שלבים 3.2-3.6 ישתמשו ב- GAD65 כדוגמה.
- חישוב דילול של חלבון GAD65 המסומן. הריכוז הממוקד המומלץ של תמיסת התערובת הראשונה של GAD65 שעבר ביוטינילציה הוא 2000 ננוגרם/מ"ל ו-Ru Sulfo-NHS המסומן GAD65 הוא 1000 ננוגרם/מ"ל. אם הריכוז של ביו-טינילציה ושל Ru Sulfo-NHS המסומן GAD65 בתמיסה במלאי הוא 1.0 מיקרוגרם/מיקרול, הנפח הדרוש ל-GAD65 שעבר ביוטינילציה ב-560 מיקרו-ליטר של תמיסה עובדת יהיה 1.12 μL, והנפח הדרוש ל-Ru Sulfo-NHS שכותרתו GAD65 ב-700 μL של תמיסה עובדת יהיה 0.7 μL.
- יש לערבב 1.12 μL של חלבון GAD65 שעבר ביוטינילציה עם 240 μL של קישור מצומד סטרפטאבידין 1 בשפופרת אחת ו-160 μL של 1% BSA. לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מוסיפים 160 μL של תמיסת עצירה לצינור ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות.
- בצע דילול סדרתי. קח 280 μL של התערובת לצינור חדש ולהוסיף 280 μL של תמיסת עצירה כדי לבצע דילול 1:2. הכינו מספר צינורות חדשים. חזור על שלב זה כדי להפעיל דילול טורי אופקי עבור ביוטין שכותרתו אנטיגן GAD65 (עיין בפרסום הקודם12).
- יש לערבב 0.7 מיקרוגרם של חלבון Ru Sulfo-NHS עם התווית GAD65 (1 מיקרוגרם/מיקרול) עם 700 μL של תמיסת עצירה. לאחר מכן קח 350 μL של התערובת לצינור חדש והוסף 350 μL של תמיסת עצירה כדי לבצע דילול 1:2. הכן מספר צינורות חדשים, חזור על שלב זה כדי להפעיל דילול סדרתי אנכי עבור Ru Sulfo-NHS שכותרתו אנטיגן GAD65.
- הכן שתי דגימות סרום, דגימה אחת חיובית מאוד עבור GADA ודגימה אחת שלילית עבור GADA, כל אחת בעלת נפח של 0.75 מ"ל. Aliquot 15 μL של סרום חיובי לכל באר בחצי השמאלי של צלחת PCR 96 באר. Aliquot 15 μL של סרום שלילי לתוך כל באר על החצי הימני של צלחת PCR 96 באר.
- מוסיפים 18 μL של 0.5 M חומצה אצטית לכל באר ומערבבים. דגירה במשך 45 דקות ב- RT. הכן צלחת PCR חדשה של 96 בארות. הוסיפו 17.5 μL של האנטיגן המסומן בביוטין ו-17.5 μL של האנטיגן המסומן Ru Sulfo-NHS לכל באר בהתאם לדילולים הסדרתיים (עיין בפרסום הקודם12).
- המשך את שאר שלבי הבדיקה המתוארים בשלבים 5.2 עד 9.1.
- קבע את יחס האות מהדגימות החיוביות הגבוהות מול אותות הדגימה השליליים המתאימים. בחר את הריכוז הטוב ביותר עבור האנטיגן המסומן בביוטין והאנטיגן המסומן Ru Sulfo-NHS על ידי זיהוי הנקודה בעלת היחס הגבוה ביותר או הקרוב ליחס הגבוה ביותר של אות חיובי לשלילי. בחישוב יחס זה, שקול את אות הרקע הנמוך המתקבל מהדגימות השליליות.
הערה: הריכוזים האופטימליים של Ru Sulfo-NHS וחלבוני אנטיגן המסומנים בביוטין ממבחני לוח משבצות מוצגים להלן: 30 ננוגרם/מ"ל ו-200 ננוגרם/מ"ל עבור GAD65, 120 נ"ג/מ"ל ו-120 נ"ג/מ"ל עבור פרואינסולין, 10 נ"ג/מ"ל ו-42 נ"ג/מ"ל עבור IA-2, 80 נ"ג/מ"ל ו-80 נ"ג/מ"ל עבור TG, 8 נ"ג/מ"ל ו-16 נ"ג/מ"ל עבור TPO, 31 ננוגרם/מ"ל ו-31 ננוגרם/מ"ל עבור ThG, ו-12 ננוגרם/מ"ל ו-12 ננוגרם/מ"ל עבור IFNα.
4. צור את תמיסת האנטיגן המשולבת של המקשר
- בחר את הריכוז האופטימלי עבור כל אנטיגן בהתבסס על בדיקת לוח המשבצות. לדלל את הביוטין ואת Ru Sulfo-NHS שכותרתו אנטיגן לריכוז העבודה הרציונלי.
- קשרו מקשרים שונים לכל אחד מחלבוני האנטיגן הביוטיניליים הייחודיים. עבור בדיקת צלחת אחת של 96 בארות, יש לערבב 4 μL של חלבון GAD65, TPO, tTG, ThG, פרואינסולין, IFN-α ו-IA-2 עם 240 μL של קישור מצומד סטרפטווידין 1, 2, 3, 4, 8, 9 ו-10 לצינור נפרד (איור 1). לאחר מכן הוסף 156 μL של PBS / 1% BSA לכל צינור. לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- הוסיפו 160 μL של תמיסת עצירה לכל צינור ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. קח 400 μL של אנטיגן מצומד לינקר מכל צינור, ושלב את כל 7 האנטיגנים יחד. הוסף 1.2 מ"ל של תמיסת עצירה ולאחר מכן הוסף 4 μL של Ru Sulfo-NHS שכותרתו GAD65, TPO, tTG, ThG, פרואינסולין, IFN-α ואנטיגן IA-2 לתערובת. עכשיו פתרון אנטיגן מוכן לשימוש בבדיקה.
5. דגירה דגימות סרום עם האנטיגן המסומן
הערה: מכיוון שבדיקת ECL-IAA בבדיקת 7-Plex זו דורשת טיפול חומצי בדגימות סרום, כל סרום דורש את שלב הטיפול בחומצה לפני הדגירה עם תערובת אנטיגן מסומנת עבור בדיקת 7-Plex זו.
- Aliquot 15 μL של סרום לכל באר עבור צלחת PCR 96 באר. מוסיפים 18 μL של 0.5 M חומצה אצטית לכל באר ומערבבים. דגירה במשך 45 דקות ב- RT. הכן צלחת PCR חדשה של 96 בארות ואליקוט 35 μL של תמיסת אנטיגן לכל באר.
- בזמן שהצלחת עדיין דוגרת, יש להוסיף 13 μL של חיץ 1 M Tris pH 9.0 לכל באר בצלחת האנטיגן. הוסף חיץ לצד של כל באר כדי להגביל את הערבוב של חיץ Tris ואנטיגן. לאחר השלמת הדגירה, קח 25 μL של הסרום המטופל בחומצה, ומיד פיפטה אותו לתוך כל באר על צלחת האנטיגן. התסיסו את התמיסה וכסו את הצלחת בנייר כסף לאיטום PCR כדי למנוע חשיפה לאור.
- ב RT, לשים את הצלחת על שייקר, להגדיר במהירות נמוכה, במשך 1 שעה. לאחר מכן, אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ותנו לצלחת לדגור במשך 18-24 שעות.
6. הכינו את צלחת המולטיפלקס
- קחו צלחת מולטיפלקס ממקרר 4 מעלות צלזיוס ותנו לצלחת להגיע ל-RT. לאחר שצלחת המולטיפלקס נמצאת ב- RT, הוסף 150 μL של 3% חוסם A לכל באר. מכסים את צלחת המולטיפלקס בנייר כסף לאיטום. לדגור את הצלחת במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: יום הבדיקה 1 כולל שלבים 4 עד 6.
7. מעבירים דגירה של סרום/אנטיגן לתוך צלחת המולטיפלקס
- למחרת, הניחו מגבות נייר על השולחן וקחו את צלחת המולטיפלקס הדגירה מהמקרר. רוקנו את כל החיץ מהצלחת. כדי לעשות זאת, הפוך את הצלחת הפוך וטפח אותה על מגבות הנייר המוכנות עד שאין חיץ נוכח באף אחת מהבארות.
- שטפו את צלחת המולטיפלקס על ידי הוספת 150 μL של PBST לכל באר. בטל את המאגר, כפי שצוין בשלב 7.1., וחזור על שלב זה שלוש פעמים. הוסיפו 30 μL של דגירה של סרום/אנטיגן לכל באר בצלחת המולטיפלקס. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי להגביל את חשיפתה לאור. הניחו את הצלחת על שייקר צלחת, המוגדר למהירות נמוכה, ב-RT למשך שעה אחת.
8. שוטפים את הצלחת ומוסיפים חיץ קריאה
- הסירו את הדגירה של הסרום/אנטיגן מצלחת המולטיפלקס על ידי החזקת הצלחת במהופך והזזת התמיסה החוצה. הוסיפו 150 μL של PBST לכל הבארות והוציאו את המאגר מהצלחת על ידי החזקת הצלחת שוב במהופך והוצאת התמיסה החוצה. חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר השלמת הכביסה השלישית, יש להוסיף 150 μL של חיץ קריאה לכל באר.
הערה: בועות אוויר מפריעות ליכולתה של מכונת קורא הצלחות לנתח במדויק את תוצאות הצלחת ויש להימנע מהן בכל מחיר.
9. קרא את הצלחת ונתח נתונים
- ספירת הלוח המוכן במכונת קורא הלוחות, תוך קריאת כל הערכים בספירות לשנייה (CPS).
- חישוב האינדקס היחסי עבור הבדיקה, באמצעות רמות הנוגדנים המתקבלות ממכונת קורא הלוחות, עם המשוואה הבאה:
ערך אינדקס = [CPS (מדגם) - CPS (תקן שלילי)] / [CPS (תקן חיובי) - CPS (תקן שלילי)]. - קבע אילו תוצאות נוגדנים הן שליליות או חיוביות באמצעות החתכים שנקבעו.
הערה: יום הבדיקה 2 כולל את שלבים 7 עד 9.
Representative Results
ניתוח תוצאות הבדיקה הוצג בטבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3. ערכי הקריאה מגיעים מהנתונים מ-10 הנקודות בתוך אותה באר. ערכי האינדקס עבור כל מדגם חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות הפנימיות המתאימות להם, כמתואר בפרוטוקול הבדיקה. דוגמאות לכפילויות שגויות מוצגות בטבלה 1 וגרמו לשגיאת חישוב האינדקס הסופי בטבלה 3. יש לבדוק את כל ערכי הספירה הגולמית כדי להימנע מתוצאות חיוביות כוזבות או שליליות שגויות.
בדיקת ה-ECL בעלת 7 המולטיפלקסים אומתה באמצעות קבוצה גדולה של דגימות מ-1026 מטופלים שאובחנו לאחרונה עם T1D ו-1022 נבדקי בקרה בריאים שהתאימו לגיל ולמין. רמות הנוגדנים העצמיים מבדיקת ECL 7-Plex עבור 1026 חולי T1D הושוו לרמות מכל אחד ממבחני ה-ECL היחידים המקבילים שלנו, כפי שמוצג באיור 2 , ומכל RBA ו-ELISA סטנדרטיים יחידים, כפי שמוצג באיור 3. מאפייני הבדיקה הוגדרו זהים באחוזון99 עבור כל מבחני הנוגדנים העצמיים למעט נוגדנים עצמיים של בלוטת התריס (שם נעשה שימוש באחוזון ה-95), מתוך 1022 בקרות בריאות עבור כל שלוש שיטות הבדיקה (7-Plex ECL, ECL יחיד, RBA או ELISA) כמפורט בטבלה 4. קורות החיים הבין-מבחנים של GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA ו- IFNαA הם 6.4%, 4.5%, 9.1%, 4.9%, 5.7%, 11.3% ו- 5.9%, בהתאמה.
מספר קטן של דגימות סותרות עבור כל אחד מ-7 הנוגדנים העצמיים נמצאו סביב קו הגבול של חתכים עבור כל בדיקה (איור 2 ואיור 3). 11 דגימות בקרה (11/1022, 1.1%) נמצאו נוגדנים עצמיים מרובים חיוביים רק במבחן 7-Plex ושליליים בכל בדיקה בודדת מקבילה. באופן דומה, זה קרה ב 9 דגימות של חולי T1D (9/1026, 0.9%). בנוסף, 10 TPOA חיוביים גבוהים ו- ThGA אחד בקבוצת המטופלים שנראו הן במבחן ECL יחיד והן ב- RBA הוחמצו במבחן 7-Plex. דגימות אלה הומרו חיוביות במבחן 7-Plex כאשר הן דוללו עוד יותר. באופן כללי, 100% מהחיוביות במבחן ECL יחיד או RBA כוסו במבחן ECL 7-Plex, עם אותה ספציפיות בדיקה כפי שמודגם בטבלה 4.
איור 1: איור של בדיקת Mutiplex ECL.
נוגדנים עצמיים בסרום יגשרו בין האנטיגן Ru Sulfo-NHSged לאנטיגן הביוטינילציה. זה יחד עם מקשר ספציפי כדי ליצור קומפלקס של אנטיגן-נוגדן-אנטיגן-מקשר. הקומפלקסים נלכדים על הצלחת ומרוסנים לנקודות הספציפיות שלהם דרך כל מקשר ספציפי. מספרי המקשרים המצומדים באופן ספציפי, עבור 7 חלבוני האנטיגן השונים, מודגמים. זיהוי אותות נוגדנים מתבצע באמצעות אנטיגנים מסומנים Ru Sulfo-NHS עם אלקטרוכמילומינסנציה. האיור הוא מתוך גו, י' ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השוואה של 7 רמות נוגדנים עצמיים ב-1026 מטופלים חדשים עם T1D בין בדיקת ECL יחידה לבדיקת ECL 7-Plex.
לוחות a, b, c, d, e, f ו- g מציגים השוואות של רמות נוגדנים עצמיים עבור GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ו- IFNαA, בהתאמה. הקווים המקווקווים מייצגים את חתכי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים. החתכים נקבעו לאחוזון ה-99 של 1022 בקרות בריאות תואמות גיל עבור כל בדיקה (למעט TPOA ו-ThGA שנקבעו לאחוזוןה-95), כפי שמוצג בטבלה 4, מ-1022 הבקרות הבריאות התואמות גיל הן עבור מבחני ECL בודדים והן עבור מבחני ECL מרובים. יהלומים סגורים אדומים מסומנים כחיוביים 'כוזבים' בבדיקת 7-Plex ECL, <1% מהקבוצה שנחקרה, והם אומתו כשליליים הן ב-ECL יחיד והן ב-RBA. ריבועי סגירה אדומים מסומנים כשליליים 'כוזבים' בבדיקת 7-Plex ECL הנגרמת על ידי תופעת ה'פרוזון', המתרחשת בעיקר בבדיקת TPOA ב-<1% מהקבוצה שנחקרה. שתי התוצאות החיוביות הכוזבות והשליליות הכוזבות הללו נדונות בחלק הדיון. האיור הוא מתוך גו, י' ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השוואה של 7 רמות נוגדנים עצמיים ב-1026 מטופלים חדשים עם T1D בין ה-RBA (ELISA עבור IFNαA) לבין בדיקת 7-Plex ECL.
פאנלים a, b, c, d, e, f ו-g מציגים השוואות של רמות נוגדנים עצמיים עבור GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ו- IFNαA, בהתאמה. הקווים המקווקווים מייצגים את חתכי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים, אותה ספציפיות שנקבעה הן עבור RBA והן עבור בדיקת ECL 7-Plex, כפי שמוצג בטבלה 4, מ-1022 בקרות בריאות תואמות גיל. יהלומים סגורים אדומים וריבועים מייצגים תוצאות חיוביות 'כוזבות' ושליליות 'כוזבות' המופיעות במבחן 7-Plex ECL, כפי שניתן לראות באיור 2. האיור הוא מתוך גו, י' ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | מקשר-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | מקשר-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | מקשר-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | מקשר-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | מקשר-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | מקשר-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | מקשר-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | מקשר-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | מקשר-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | מקשר-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | מקשר-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | מקשר-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | מקשר-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | מקשר-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | מקשר-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | מקשר-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | מקשר-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | מקשר-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | מקשר-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | מקשר-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | מקשר-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | מקשר-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | מקשר-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | מקשר-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | מקשר-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | מקשר-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | מקשר-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | מקשר-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | מקשר-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | מקשר-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | מקשר-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | מקשר-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | מקשר-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | מקשר-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | מקשר-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | מקשר-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | מקשר-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | מקשר-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | מקשר-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | מקשר-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | מקשר-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | מקשר-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | מקשר-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | מקשר-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | מקשר-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | מקשר-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | מקשר-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | מקשר-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | מקשר-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | מקשר-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | מקשר-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | מקשר-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | מקשר-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | מקשר-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | מקשר-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | מקשר-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | מקשר-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | מקשר-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | מקשר-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | מקשר-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | מקשר-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | מקשר-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | מקשר-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | מקשר-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | מקשר-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | מקשר-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | מקשר-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | מקשר-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | מקשר-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | מקשר-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | מקשר-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | מקשר-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | מקשר-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | מקשר-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | מקשר-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | מקשר-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | מקשר-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | מקשר-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | מקשר-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | מקשר-10 | |
טבלה 1: ניתוח של בדיקת ECL 7-plex: ספירות CPS גולמיות (מחצית שמאלית של הצלחת). ספירות CPS גולמיות נרכשות מצלחת בדיקה (החצי השמאלי של הצלחת) וכל דגימה מבוצעת בשכפול. מתחת לכל שורה בלוחית (A-H), יש 10 שורות של ערכי קריאה המייצגות את הנתונים מ-10 הנקודות בתוך אותה באר, המתאימות לכל מספר מקשר כפי שסומן. דוגמאות לכפילויות פגומות מודגשות באפור, כפי שניתן לראות בשורה F-linker 3 עמודות 5 ו-6.
| שורה של טבלה 1A | עמודה של טבלה 1A | מקשר 1 | מקשר 2 | מקשר 3 | מקשר 7 | מקשר 8 | מקשר 9 | מקשר 10 | |
| A | 1-2 | מחשב גאדה | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | גדה מחשב נמוך | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | מחשב TPOA | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA מחשב נמוך | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | מחשב TGA | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG מחשב נמוך | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA מחשב נמוך | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| A | 3-4 | מחשב IAA | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA מחשב נמוך | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | מחשב IFNaA | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA מחשב נמוך | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | מחשב IA-2A | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | מחשב נמוך IA-2A | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | נ.צ. | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | נ.צ. | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| A | 5-6 | דוגמה1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | דוגמה2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | דוגמה3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | דוגמה4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | דוגמה5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | דוגמה6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | דוגמה7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | דוגמה8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
טבלה 2: ניתוח של בדיקת ECL 7-plex: סידור נתוני טבלה 1, המסומנים כ-7 מקשרים. הנתונים מטבלה 1 אורגנו מחדש, כאשר המקשרים 4 עד 6 (לא נעשה בהם שימוש) נמחקו, וערכים ממוצעים חושבו מכל קריאה כפולה מטבלה 1. הערכים של הבקרות החיוביות הגבוהות והנמוכות הסטנדרטיות הפנימיות, המתאימות לכל בדיקת נוגדנים עצמיים, המרוסנים על ידי מקשר מסוים, נמצאים בהדגשה כהה. מחשב, שליטה חיובית. NC, שליטה רגילה.
| גד-אינדקס | TPOA-אינדקס | TGA-Index | ThGA-Index | מדד IAA | IFNaA-Index | מדד IA-2A | |
| מחשב גאדה | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| גדה מחשב נמוך | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| מחשב IAA | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA מחשב נמוך | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| מחשב IA-2A | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| מחשב נמוך IA-2A | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| מחשב TGA | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG מחשב נמוך | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| מחשב TPOA | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA מחשב נמוך | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA מחשב נמוך | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| מחשב IFNaA | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA מחשב נמוך | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| נ.צ. | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| נ.צ. | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| דוגמה1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| דוגמה2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| דוגמה3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| דוגמה4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| דוגמה5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| דוגמה6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| דוגמה7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| דוגמה8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
טבלה 3: ניתוח של מבחן ECL 7-plex: תוצאות של ערכי מדד. ערכי האינדקס עבור כל מדגם עבור כל 7 מבחני הנוגדנים העצמיים חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות הפנימיות המקבילות שלהם כמתואר בפרוטוקול הבדיקה. כל ערך אינדקס שהיה גדול מערך החיתוך הוגדר כתוצאה חיובית, המוצגת בהדגשה כהה. ערך TGA-index של sample6 הודגש באפור מכיוון שמדובר בשגיאה הנגרמת על-ידי כפילויות שגויות המוצגות בשורה F-linker 3-עמודות 5 ו- 6 בטבלה 1.
| גדא | IA-2A | רשות העתיקות | .TGA | TPOA | ת.ג.א. | IFNαA* | ||||||||
| סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | סנס | מפרט טכני | |
| RBA | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| ECL יחיד | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
טבלה 4: בדיקת רגישות וספציפיות בקרב 1026 מטופלי T1D ו-1022 בקרות, המותאמות הן לגיל והן למין, בבדיקת ECL של 7 פלקסים, בהשוואה לבדיקת ECL יחידה מקבילה ו-RBA או ELISA*. מבחני T hree שונים (RBA, ECL יחיד ו- 7-Plex ECL) עבור כל נוגדן אוטומטי הוגדרו למאפיינים ספציפיים דומים באמצעות 1022 גיל ומין תואמים בקרות בריאות. תוצאת הספציפיות של קבוצת הביקורת שנחקרה נקבעה סביב 95% עבור TPOA ו- ThGA ו- 99% עבור 5 המבחנים האחרים. *כוכבית מסמנת את בדיקת IFNαA עבור ELISA, בעוד שאחרות הן RBA.
Discussion
בניסויים קליניים לאומיים ובינלאומיים רבים לסוכרת מסוג 1, הביצועים של בדיקת ECL יחידה לאיתור נוגדנים עצמיים של איונים ונוגדנים עצמיים לטרנסגלוטמינאז (TGA) למחלת צליאק, הוכחו 8,9,10,11. לאורך שבילים אלה, בדיקה זו הגבירה את הרגישות והספציפיות לזיהוי אוטואנטיגן כאשר הוערך מול תקן 'הזהב' הקיים RBA. ניתן לראות את הספציפיות המשופרת של המחלה כאשר מפלים בין נוגדנים עצמיים בעלי זיקה גבוהה ואיונים בסיכון גבוה לבין אותות בסיכון נמוך וזיקה נמוכה, בין בדיקת ECL יחידה לבין RBA14,15,16,17. בהתבסס על בדיקת ECL יחידה, אנו מציבים בדיקת נוגדנים עצמיים חדשה של ECL עם תפוקה גבוהה, כדי לאפשר לנו לסנן T1D כמו גם מספר מחלות אוטואימוניות ישימות בו זמנית.
בדיקת המולטיפלקס ECL משתמשת בלוח המולטיפלקס, שיכול לשלב עד 10 מבחני נוגדנים עצמיים לבאר אחת. עבור המחקר הנוכחי, 7 בדיקות נוגדנים עצמיים משולבים יחד. הנוגדנים העצמיים מורכבים מ-3 IAbs (IAA, GADA ו-IA-2A), 2 נוגדנים עצמיים למחלות אוטואימוניות של בלוטת התריס (TPOA ו-ThGA), נוגדנים עצמיים למחלת צליאק (TGA) ונוגדנים עצמיים של APS-1 לאינטרפרון אלפא (IFNαA). מנגנון הבדיקה מבוסס, באופן כללי, על בדיקת ECL אחת כפי שפורסם בעבר 9,10,12,18 עם כמה שינויים. ההבדל העיקרי של בדיקת ECL מרובבת מבדיקת ECL יחידה הוא שכל קומפלקס נוגדנים-אנטיגן שנוצר בשלב הנוזלי מרוסן לקישור ספציפי (איור 1). הביוטין המסומן כאנטיגן מודגר עם מצומד סטרפטאווידין, מקשר המשמש ליצירת קומפלקס אנטיגן-מקשר ספציפי. קומפלקס חיסוני נוגדן-אנטיגן נוצר לאחר הדגירה עם סרום המטופל והוא נלכד על נקודה מסוימת דרך מערכת המקשר הספציפית על כל באר של צלחת multix. Ru Sulfo-NHS שכותרתו אנטיגן שנלכד על ידי נוגדנים בו זמנית מספק את האות עם אלקטרוכמילומינסנציה. מכונת קורא הצלחות יכולה לזהות עד 10 אותות שונים ממקורות הספוט הממוקמים בכל באר. כדי לשמור על עקביות בדיקות נוגדנים עצמיים בין הצלחות ותוך כדי ביצוע מחקרים ארוכי טווח, אנו מציעים להשתמש באותו מקשר.
לפני הגדרת בדיקת ECL מרובבת, מבחני ECL בודדים עבור כל נוגדנים עצמיים צריכים להיות ממוטבים על צלחת מולטיפלקס, בהתאמה, ומאומתים הן כנגד מבחני RBA והן מול מבחני ECL בודדים על צלחת ECL רגילה. כדי לשפר את בדיקת לוח המשבצות, לבדיקת הנוגדנים העצמיים הקשורים על צלחת המולטיפלקס, נעשה שימוש בחולה חיובי גבוה ובדגימת מטופל שלילית. לאחר ביצוע בדיקת לוח המשבצות, הריכוזים האידיאליים ביותר עבור Ru Sulfo-NHS וביוטין שכותרתו אנטיגן חושבו עבור כל אחד מ-7 מבחני הנוגדנים העצמיים. הריכוזים הבאים מראים את הריכוזים הבאים: 30 נ"ג/מ"ל ו-200 נ"ג/מ"ל עבור GAD65, 120 נ"ג/מ"ל ו-120 נ"ג/מ"ל עבור פרואינסולין, 10 נ"ג/מ"ל ו-42 נ"ג/מ"ל עבור IA-2, 80 נ"ג/מ"ל ו-80 נ"ג/מ"ל עבור TG, 8 נ"ג/מ"ל ו-16 נ"ג/מ"ל עבור TPO, 31 נ"ג/מ"ל ו-31 נ"ג/מ"ל עבור ThG, ו-12 ננוגרם/מ"ל ו-12 ננוגרם/מ"ל בהתאמה עבור IFNα13. ייתכן שיהיה צורך להתאים עוד יותר את הריכוזים של חלק מהאנטיגנים מבדיקת לוח המשבצות בהתאם לתוצאות בבדיקת המולטיפלקס בפועל לאחר שילוב כל המבחנים יחד.
מכיוון ש- IAA נכללת בבדיקת ECL המולטיפלקס הנוכחית, טיפול חומצי בדגימות סרום הוא חובה לפני דגירה של הסרום עם אנטיגן, כפי שדווח במחקר הקודם12. באופן כללי, כאשר מוסיפים נוגדנים עצמיים נוספים לבדיקת מולטיפלקס, רקע הבדיקה מושפע ואות גבוה במיוחד מנקודה אחת, בבאר, עלול לחסום את התוצאות של כתמים סמוכים באמצעות crosstalk. לכן, יש להגביל את ה-CPS המרבי ל-20,000 ספירות עבור כל נוגדן עצמי, או נמוך יותר, עבור הדגימות החיוביות הגבוהות ביותר. מהידע שלנו, על מנת להפחית את כמות ההצלבות המעורבות, יש להפריד בין נוגדנים עצמיים בעלי רקע נמוך יותר, בעת תכנון מפת הספוט, הרחק מנקודות עם תדירות גבוהה יותר של ספירות.
תוצאות חיוביות גבוהות ובקרות שליליות שימשו באופן פנימי בכל בדיקה כדי לחשב מדד מדויק עבור הדגימות הלא ידועות שנבדקו. כדי להעריך ולנטר במדויק את רגישות הבדיקה, נעשה שימוש בבקרות חיוביות נמוכות, שנקבעו בסמוך לגבול העליון של הבדיקה. בקרות חיוביות ושליליות סטנדרטיות אלה נוצרו בתפזורת ובאליקוט לשימוש ארוך טווח ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ומטה, לצורך עקביות בין המבחנים. למטרות אבטחת איכות, הדגימות הופעלו פעמיים בכל בדיקה וכל תוצאה חיובית שודרה מחדש ואושרה על ידי הרצת הדגימה בבדיקת ECL חדשה למחרת. אם הייתה מחלוקת עם המבחן המאשר הראשון והשני, היה צורך בבדיקה שלישית. מבין שלושת המבחנים שנערכו, התוצאות של שני המבחנים המסכימים (למשל, +, + או -,-), קבעו את התוצאה הסופית (חיובית או שלילית) של המדגם.
בעשור האחרון, קבוצות מחקר רבות מחפשות בדיקת תפוקה גבוהה תוך שימוש בשיטת המולטיפלקס כדי לשלב מספר מבחני נוגדנים עצמיים יחד לבאר אחת כדי לסנן אוכלוסיות גדולות. ישנם מספר מחקרים המשתמשים בסוגים שונים של טכנולוגיות כדי לבצע מבחני נוגדנים עצמיים מרובים 19,20,21,22, אך אין השוואה לאף אחד מהמבחנים הללו ברגישות ובספציפיות מול תקן 'הזהב' הנוכחי RBA, כאשר חוקרים T1D. סוגים שונים אלה של פלטפורמות בשימוש אינם מאומתים באמצעות סדנת התקינה הבינלאומית של איון נוגדנים עצמיים (IASP) או באמצעות בדיקת קבוצות גדולות בניסויים קליניים. בסינון מבוסס אוכלוסייה כללית שנערך לאחרונה בגרמניה, בדיקה משולבת בתפוקה גבוהה, 3 Screen ICATM ELISA המופצת על ידי Kronus, משמשת ככלי לסינון קו ראשון לאיתור שלושה IAbs, GADA, IA-2A ו- ZnT8A, כדי להשיג אבחון מוקדם של T1D23 בילדות. בדיקת ELISA בעלת 3 המסכים מודדת 3 נוגדנים עצמיים ב-3 בארות מופרדות, הצורכים כמות גדולה של סרום, או בבאר אחת כאשר כל 3 הבדיקות מעורבות. אם אחד היטב במבחן ELISA בעל 3 המסכים הוא חיובי, לא ניתן להבחין אילו מבין שלושה נוגדנים עצמיים קיימים. החיסרון הגדול ביותר של בדיקה זו הוא חוסר היכולת שלה לכלול מדידה של רשות העתיקות. לכל תוצאות רשות העתיקות המבוצעות על ידי ELISA, כפי שהוכח בסדנאות IASP, אין רגישות וספציפיות מקובלות24. רשות העתיקות היא בדרך כלל ה-IAb הראשונה שמופיעה ויש לה שכיחות גבוהה בקרב ילדים צעירים. בדיקת IAb, עם רשות העתיקות, נחוצה לילדים ולא מקובל לבצע סינון זה ללא רשות העתיקות כדי להעריך סיכון T1D בקהילה. בנוסף, לא פורסמו מחקרים או נתונים המראים כי בדיקת ערכת Kronus IAb היא ספציפית יותר למחלת T1D ומסוגלת להבחין בין סיכון גבוה ל- IAbs בסיכון נמוך. בדיקת 7-Plex ECL, במחקר הנוכחי, אומתה באמצעות קבוצה גדולה של חולים שאובחנו לאחרונה עם T1D13. בהשוואה ל- RBA הסטנדרטי הנוכחי ולבדיקת ECL יחידה מבוססת היטב, מבחן 7-Plex מסוגל לשמור על 100% חיוביות עם אותה ספציפיות בדיקה (טבלה 4). נכון לעכשיו, בדיקת 4-Plex ECL, במקביל ל- RBA הסטנדרטי, מיושמת בניסוי קליני גדול מתמשך: מחקר סינון אוטואימוניות לילדים (ASK). ניסוי זה בודק ילדים באוכלוסייה הכללית, של מטרופולין דנוור, עבור T1D וצליאק. בהשוואה ל-RBA סטנדרטי שנעשה בו שימוש במחקר ASK, בדיקת המולטיפלקס ECL מראה רגישות מצוינת וספציפיות גבוהה יותר למחלה, זהה לדוחות הקודמים שלנו באמצעות מחקר ECL יחיד25. יתר על כן, בדיקת 4-Plex ECL שלנו הדגימה הפחתה בולטת בעבודה, בעלות ובנפח הסרום ב-70%, בהשוואה ל-4 המבחנים הבודדים המקבילים עבור ECL ו-RBA. באמצעות בדיקת ECL מרובבת, אנו יכולים להתאים אישית כל באר עם מספרים שונים, המייצגים נוגדנים עצמיים שונים (עד 10), כדי לבדוק מחלות אוטואימוניות שונות הספציפיות לצרכים של מיקום קליני מסוים.
ישנן כמה מגבלות שנצפו, המוצגות במחקר הנוכחי, עבור בדיקת ECL מרובת באמצעות צלחת המולטיפלקס. הדילול הסופי של הסרום, הדגירה עם אנטיגן, אינו ניתן להתאמה כדי להניב את התנאים האופטימליים ביותר עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים אחת המשולבת בבאר אחת. תשע דגימות (9/1026), מחולי T1D, נצפו כבעלות תוצאה שלילית כוזבת עבור נוגדנים עצמיים מסוימים. 7 מהתוצאות השליליות הכוזבות היו עבור TPOA ו-2 היו עבור ThGA, במבחן ECL 7-Plex, אך תוצאות חיוביות גבוהות הוצגו הן במבחן ECL היחיד והן ב-RBA (איור 2 ו-3). לאחר דילול נוסף של כל 9 הדגימות, הם הפכו חיוביים על צלחת multix. תוצאה זו נגרמת על ידי, מה שאנו מתארים כתופעת 'פרוזון'. תופעה זו גורמת לדגימה להראות תוצאה שלילית כוזבת מכיוון שטיטרים בעלי נוגדנים גבוהים משפיעים על היווצרות סריגים של נוגדנים-אנטיגן. בעת הגדרת בדיקת מולטיפלקס, מומלץ לבצע דגימות עם טיטרים גבוהים מאוד, עבור כל אחד מהנוגדנים העצמיים המשולבים, לבצע בדיקות מקדימות כדי לזהות את הדילול האופציונלי של סרום לדגירה של אנטיגן. לחלופין, יש לבחור מבחני נוגדנים עצמיים עם תנאים אופטימליים דומים כדי ליצור בדיקה משולבת שממנה מושגת הרגישות והספציפיות הטובות ביותר לבדיקה עבור כל נוגדן עצמי. במחקר הנוכחי, 7 דגימות (7/1022), מבקרות נורמליות בריאות, הביאו לתוצאות חיוביות כוזבות עבור נוגדנים עצמיים מרובים במבחן 7-Plex, אך לאחר הרצת בדיקת ECL אחת ו-RBA (איור 2 ו-3) נמצאו נוגדנים עצמיים אלה שליליים בשני המבחנים. הסיבות מאחורי התוצאות החיוביות המוטעות הללו המתרחשות על לוח המולטיפלקס, עבור תת-קבוצה קטנה זו של דגימות, אינן ידועות כעת. עבור היישום הנוכחי של בדיקת ECL המולטיפלקס, כל הדגימות החיוביות חוזרות על עצמן עם בדיקת ECL היחידה המתאימה שלהן כדי לאשר חיוביות, מה שמסיר שגיאה חיובית שגויה זו מבדיקת ECL המולטיפלקס.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH DK32083, מענקי JDRF 2-SRA-2015-51-Q-R ו- 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
