Summary
Aqui, introduzimos e descrevemos um método nãoradioativo e não invasivo para avaliar a síntese de proteína de novo in vivo, utilizando o nematode Caenorhabditis elegans e recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Este método pode ser combinado com telas genéticas e/ou farmacológicas para identificar novos moduladores da síntese proteica.
Abstract
Manter um proteome saudável é essencial para a homeostase celular e organismo. A perturbação do equilíbrio entre controle translacional de proteínas e degradação instiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade. O declínio dos mecanismos de controle de qualidade da proteostase é uma marca do envelhecimento. Os métodos bioquímicos para detectar a síntese de proteínas de novo ainda são limitados, têm várias desvantagens e não podem ser realizados em células vivas ou animais. Caenorhabditis elegans, sendo transparente e facilmente geneticamente modificado, é um excelente modelo para monitorar as taxas de síntese proteica usando técnicas de imagem. Aqui, introduzimos e descrevemos um método para medir a síntese de proteína de novo in vivo utilizando a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP). Animais transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células ou tecidos específicos são irradiados por uma poderosa fonte de luz que resulta em fotobleaching de fluorescência. Por sua vez, a avaliação da recuperação da fluorescência significa nova síntese proteica em células e/ou tecidos de interesse. Assim, a combinação de nematoides transgênicos, intervenções genéticas e/ou farmacológicas, juntamente com imagens vivas das taxas de síntese proteica podem lançar luz sobre mecanismos que mediam o colapso da proteostase dependente da idade.
Introduction
A síntese e a degradação da proteína são essenciais para a homeostase do organismo. Uma infinidade de doenças relacionadas à idade são instigadas pela produção de proteína defeituosa1,,2. Para medir as taxas globais de tradução de proteínas, existem técnicas bioquímicas, como o perfil ribossômico, que envolve sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos para monitorar a expressão, bem como a nova síntese proteica3. Este método, além de ser uma leitura indireta das taxas translacionais, uma vez que o aumento da associação do RNA aos ribossomos não significa necessariamente aumento da tradução, tem desvantagens técnicas, como alto custo e exigência de uma grande quantidade de material inicial. Por outro lado, os métodos baseados em proteômica permitem quantificação direta da proteína por perfil metabólico de pulso seguido de análise de espectrometria de massa4,,5. No entanto, trata-se de uma abordagem semi-quantitativa com resolução temporal limitada que não pode ser facilmente utilizada in vivo. Além disso, a rotulagem da proteína pode ser desigualmente distribuída no animal/tecido de interesse. É importante ressaltar que ambos os métodos podem ocultar variações específicas de tecidos ou células nas taxas de tradução de proteínas em animais ou tecidos inteiros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo fácil de usar que pode ser cultivado em grande número6. Além disso, sua comodidade genética e transparência permitem imagens ao vivo in vivo. Este protocolo descreve a metodologia para detectar taxas de síntese proteica usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Aproveitamos a expressão transgênica de proteínas fluorescentes, seja em todo o organismo ou em tecidos/células específicas. Animais transgênicos podem expressar GFP usando o promotor de um gene, que é amplamente/globalmente expresso ou um promotor específico do tecido para atingir tipos de células específicas. Esta técnica pode ser estendida a um promotor específico para examinar as taxas de síntese proteica de uma proteína específica.
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Protocol
NOTA: Tanto as fusões transcricionais quanto as translacionais aos fluoroforos podem ser usadas para avaliar a tradução de nova proteína em vários tecidos. As taxas de síntese proteica podem ser avaliadas para múltiplas famílias de proteínas localizadas em diferentes compartimentos celulares, incluindo citoplasma, mitocôndrias e núcleo7. As seguintes cepas são usadas para monitorar as taxas globais e neuronais de síntese de proteínas, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Manutenção, sincronização e preparação de nematoides transgênicos para monitoramento da síntese de proteínas de novo
- Use um estereótipo dissetante para avaliar os estágios de desenvolvimento e o crescimento de nematoides transgênicos mutantes (wt) e mutantes.
- Dia 1: Use uma palhadeira para selecionar e transferir 10 larvas L4 de animais transgênicos wt e mutantes carregando o repórter fluorescente desejado para placas de Nematode Growth Media (NGM) semeadas com Escherichia coli (OP50)(Tabela 1).
- Faça uma picareta de vermes anexando um fio de platina na extremidade afilada de uma pipeta Pasteur de vidro derretendo o vidro no local de contato em um queimador de Bunsen. Em seguida, achate a extremidade do fio de platina em uma forma de espátula usando qualquer ferramenta (por exemplo, pinça ou martelo leve).
- Inocular uma única colônia de bactérias E. coli (OP50) em um frasco contendo 50 mL de meio líquido Luria-Bertani (LB) e crescer por 10 horas a 37 °C em uma incubadora de agitação (200 rpm; Tabela 1). Em seguida, placas de GNL de sementes com 200 μL de cultura bacteriana. Incubar as placas semeadas à temperatura ambiente durante a noite para permitir o crescimento do gramado bacteriano.
- Incubar e cultivar os nematoides na temperatura padrão de 20 °C.
- Dia 5: As placas contêm uma população mista de vermes transgênicos. Selecione e transfira 15 larvas L4 de cada cepa em placas OP50-NGM recém-semeadas.
- Dia 6: Realize o ensaio FRAP e monitore a taxa de síntese de proteínas no primeiro dia da vida adulta.
- Prepare e use cicloheximida contendo placas de NGM como um controle positivo:
NOTA: Prepare uma solução de estoque de cicloheximida diluindo na água a uma concentração de 10 mg/mL. Mantenha a solução de estoque a 4 °C.- Mate bactérias expondo as placas de NGM semeadas por 15 minutos com luz UV (intensidade de 222 μW/cm2).
- Adicione cicloheximida em cima de placas bacterianas semeadas a 500 μg/mL de concentração final no volume do ágar.
- Deixe as placas secarem à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Transfira nematoides transgênicos expressando psod-3GFP em placas contendo veículos e cicloheximida.
- Incubar animais por 2h na temperatura padrão de 20 °C.
2. Ensaio FRAP usando animais transgênicos expressando repórteres de tecido somático pife-2GFP e psod-3GFP
NOTA: Monitore a taxa global de síntese de proteínas em todo o corpo animal. Esses repórteres transcricionais apresentam diferentes níveis de expressão e são onipresentemente expressos em múltiplos tecidos somáticos, incluindo músculos do intestino, faringe e parede corporal.
- Escolha e transfira animais transgênicos adultos de 1 dia para placas individuais de GNL semeadas com uma queda de 20 μL OP50 no centro.
- Remova a tampa e coloque cada placa sob uma lente objetiva de 20x de um microscópio de epifluorescência.
- Concentre-se e capture uma imagem de referência antes de fotobleaching (pré-alvejante).
- Fotobleach cada amostra por 10 minutos.
NOTA: Pare de fazer fotobásma quando o sinal fluorescente for extinto para 30 – 50% de intensidade em relação à imagem pré-branqueamento. A intensidade da luz e a duração do período de branqueamento devem ser ajustadas de acordo para o fluorohore específico, estágio animal e célula ou tecido em exame. A duração adequada da irradiação necessária para atingir uma extensão adequada do fotobleaching, para diferentes espécimes deve ser determinada experimentalmente. - Capture uma imagem após fotobleaching (alvejante).
- Mantenha os animais em placas de GNM individuais e deixe-os se recuperar.
- Imagem e registro da recuperação de cada repórter fluorescente a cada 1 hora por pelo menos 6 horas em um estereóscópio fluorescência.
- Alternativamente, realize a avaliação de recuperação fluorescente usando um microscópio de epifluorescência (por exemplo, AxioImager Z2).
- Avalie cuidadosamente a expectativa de saúde animal por animal monitorando sua locomoção, sensibilidade ao toque, capacidade reprodutiva e sobrevivência nos próximos 3 dias. Nematoides que apresentavam sinais de dano após fotobleaching foram excluídos de análises posteriores.
3. Montagem das amostras e realização de ensaio FRAP utilizando nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmático pan-neuronal, punc-119GFP
NOTA: Monitore a síntese de proteína pan-neuronal por fotobleaching direcionado na região da cabeça, onde o anel nervoso está localizado.
- Prepare 2% de almofadas de agarose.
- Adicione uma gota de 10 μL de tampão M9 ao centro da almofada agarose.
- Transfira 5 nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmica pan-neuronalmente em uma gota de tampão M9.
- Use um cílio para espalhar o líquido.
NOTA: Os animais exibem movimentos reduzidos em 2 minutos devido à absorção de M9 no ágar. - Altere a posição do nematoide para evitar sobreposição usando uma picareta "cílios".
- Coloque a amostra sob uma lente objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência.
NOTA: Não use um tapa-tampa. - Concentre-se e capture uma imagem de referência (pré-alvejante).
- Fotobleach a área de interesse alvo por 90 segundos.
NOTA: Pare de fazer fotobásma quando o sinal fluorescente for extinto para 30 – 50% de intensidade em relação à imagem pré-branqueamento. A intensidade da luz e a duração do período de branqueamento devem ser ajustadas de acordo para o fluorohore específico, estágio animal e célula ou tecido em exame. A duração adequada da irradiação necessária para atingir uma extensão adequada do fotobleaching, para diferentes espécimes deve ser determinada experimentalmente. - Capture uma imagem após fotobleaching (alvejante).
- Adicione uma gota de 10 μL de tampão M9 em nematoides fotobleachados.
- Deixe os animais se recuperarem por 5 minutos.
- Use a picareta "cílios" ou uma pipeta para transferir os nematoides para placas NGM individuais semeadas com 20 μL OP50 drop no centro.
- Capture uma imagem de cada amostra a cada 1 hora sob um estereóscópio de epifluorescência.
NOTA: Conte t=0 para o tempo de recuperação após fotobleaching.
4. Análise de dados da captura de imagens durante o ensaio FRAP
- Analise as imagens adquiridas usando software (por exemplo, Fiji).
- Abra imagens com o software.
- Selecione o comando Canais divididos através do menu suspenso imagem e cor.
NOTA: Mantenha a imagem do canal verde. - Use a ferramenta Seleção à mão livre para definir manualmente a região fluorescente de interesse (por exemplo, corpo inteiro, cabeça, intestino).
- Selecione o comando Medição através do menu 'Analisar's's para medir a intensidade média do pixel da área de interesse para cada ponto de partida.
NOTA: A porcentagem de recuperação da fluorescência é calculada usando as imagens de referência capturadas após o fotobleachamento.
5. Relatório de análise estatística
- Use pelo menos 20 a 25 nematoides de cada cepa e/ou condição.
NOTA: Três réplicas biológicas devem ser realizadas. - Realizar teste t-estudantis(comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com P < 0,05 como significativo utilizando software de análise estatística.
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Representative Results
Utilizando o procedimento aqui apresentado, foram utilizados nematoides transgênicos de tipo selvagem e mutantes expressando os seguintes repórteres somáticos, pife-22GFP, psod-3GFP e punc-119GFP, para avaliar as taxas de síntese proteica de acordo com os respectivos protocolos. Particularmente, vermes mutantes do tipo selvagem e ife-2 expressando GFP citoplasmático em seus tecidos somáticos usando o promotor ife-2 foram comparados antes, imediatamente após fotobleaching e 5 horas pós-recuperação. Imagens representativas e quantificação mostram que animais do tipo selvagem se recuperam totalmente enquanto os mutantes ife-2 têm capacidade de recuperação reduzida(Figura 1A). Assim, os vermes do tipo selvagem iniciam a biossíntese de proteínas de novo após o fotobleachamento, enquanto os vermes que não possuem fator de iniciação de tradução mRNA IFE-2 são incapazes de fazê-lo, indicando que a taxa de recuperação da fluorescência ilustra a taxa de síntese proteica in vivo7. Além disso, o cicloheximida, um inibidor específico da tradução de mRNA, pode ser usado como um controle positivo para a inibição da tradução de proteínas. De fato, animais transgênicos tratados com cicloheximida que expressam GFP citoplasmica sob o promotor sod-3, não recuperam sua fluorescência ao fotobleaching(Figura 1B).
Também aplicamos este método para detectar como os corpos de processamento de mRNA (corpos P) afetam a taxa de tradução deproteínas 8. Nematoides mutantes e edc-3(ok1427) que expressavam GFP pan-neuronalmente foram examinados para sua capacidade de recuperação após fotobleaching direcionado na região da cabeça. A recuperação da fluorescência é muito mais lenta em animais deficientes de EDC-3 em comparação com o tipo selvagem(Figura 1C). Isso indica que o volume de negócios mRNA mediado pelo EDC-3 dificulta a síntese de proteínas novas e, em última instância, suprime a iniciação da tradução proteica9.
Figura 1: Avaliação in vivo da síntese de proteínas de novo em C. elegans. (A) Análise FRAP em ambos os tipos selvagens e nematoides deficientes IFE-2 expressando GFP citoplasmica sob o promotor do ife-2. Animais transgênicos são submetidos a fotobleaching animal inteiro. O sinal GFP é reduzido a 30-50% da intensidade inicial. A fluorescência é registrada antes do fotobleaching (pré-alvejante), após o término do período de fotobleaching (10 min; alvejante) e 5 horas após a recuperação. (B) O tratamento de cicloheximida inibe a recuperação da fluorescência de animais transgênicos expressando GFP citoplasmático sob o promotor do sod-3. Animais transgênicos são submetidos a fotobleaching animal inteiro. O sinal GFP é reduzido a 30-50% da intensidade inicial. A fluorescência é registrada antes do fotobleaching (pré-alvejante), após o término do período de fotobleaching (10 min; alvejante) e 5 horas após a recuperação (A, B: microscópio AxioImager Z2; lente objetiva: 20x, abertura numérica 0.8; fonte de luz de alta potência, HBO 100; lâmpada de arco de mercúrio de 100 Watts; conjuntos de filtros de excitação/emissão, Zeiss Set 38 Doow GFP livre). Barras de escala, 500μm. (C) Os nematoides deficientes EDC-3 apresentam diminuição das taxas de síntese de proteínas de novo em células neuronais. O sinal de fluorescência de ambos os animais do tipo selvagem e edc-3(ok1427) expressando GFP citoplasmica pan-neuronal é medido antes do fotobleaching (pré-branqueamento) bem como seguindo o período de fotobleaching (90seg; alvejante). Animais transgênicos são submetidos a fotobleaching na região da cabeça (anel nervoso). O sinal GFP é reduzido a 30-50% da intensidade inicial (AxioImager Z2; lente objetiva: 40x, abertura numérica 0,75; potência luminescente de 30% da fonte de iluminação fluorescente (Sistema de iluminação FI X-Cite 120 XL FL PC, lâmpada halógena metálica de 120W) e íris totalmente aberta). A intensidade média dos pixels de recuperação da fluorescência é medida em intervalos de uma hora. 20 animais foram quantificados por cepa em cada um dos três experimentos independentes. Os dados representam média S.E.M., ***P < 0,05, teste tnão pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Receita | |
| 2% almofadas Agarose | 1. Pesar 0,5 g o fagarose em um copo cilíndrico | |
| 2. Adicione 25 mL de tampão M9 | ||
| 3. Aqueça em um micro-ondas até perto de ferver. Tire, mexa com uma ponta de pipeta e ferva novamente. Repita até que a ágarose seja dissolvida. | ||
| 4. Coloque um deslizamento de microscópio vazio no banco. | ||
| 5. Coloque uma gota (~ 50 μL) de solução fresca de 2% de agarose no meio do slide. | ||
| 6. Pegue um segundo slide de microscópio e coloque-o em cima da gota de agarose. Pressione suavemente para baixo para achatar a gota. | ||
| 7. Deixe a agarose endurecer por 30 segundos e remova suavemente o slide do microscópio superior. | ||
| 8. Proceda imediatamente com a preparação da amostra, uma vez que as almofadas de agarose começarão a secar em aproximadamente 5 minutos. | ||
| Dica: Deixe o slide do microscópio superior como uma tampa para preservar a umidade por mais tempo (~ 1 hora). Assim, várias almofadas de agarose podem ser preparadas e usadas rapidamente durante os experimentos. | ||
| Meio líquido LB | 1. Dissolva 10 g de Bactotryptone, 5 g de Extrato de Levedura Bacto, 5 g de NaCl em 1 L destilada e autoclave. | |
| Tampão M9 | 1. Dissolva 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, e 5 g NaCl em 1 L destilada água e autoclave. | |
| 2. Deixe esfriar e adicione 1 mL de 1 M MgSO4 (estéril). | ||
| 3. Armazene o buffer M9 a 4 °C. | ||
| Placas de ágar de médio crescimento de nematoides (GNM) | 1. Misture 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopepton, 0,2 g de estreptomicina, 17 g de ágar e adicione 900 mL de água destilada. Autoclave. | |
| 2. Deixe esfriar a 55-60 °C. | ||
| 3. Adicione 1 mL de solução de estoque de colesterol, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de solução de estoque de ninstatina, 25 mL de tampão fosfato estéril de 1 M, pH 6.0, e água estéril destilada até 1 L. | ||
| 4. Pipeta 10 mL de média por placa de Petri e deixe solidificar. | ||
| 5. Armazene as placas a 4 °C até que usem. | ||
Tabela 1: Receitas recomendadas para reagentes utilizados. Todas as receitas de reagentes utilizadas no protocolo apresentado estão aqui descritas.
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Discussion
A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. Estudos recentes revelam que o equilíbrio da tradução proteica controla diretamente a senescência e o envelhecimento não é meramente um subproduto do processo de envelhecimento. Em particular, componentes centrais da máquina de tradução, como o fator de iniciação eucariótica 4E (eIF4E), que facilita o capping de mRNA durante a iniciação da tradução, e, portanto, a taxa de tradução de proteína dependente da tampa, induz o estresse oxidativo e acelera o processo de envelhecimento1. Além disso, o EDC-3 específico para neurônios, que interage com corpos de processamento de mRNA, corpos P e aumenta a taxa de descavamento de mRNA, também acelera o processo de envelhecimento8. Especificamente, a supressão do EDC-3 permite o sequestro do IFE-2 em corpos P, reduzindo os níveis de tradução de proteínas, atrasando o envelhecimento neuronal9.
FRAP é uma técnica inicialmente desenvolvida para investigar a dinâmica proteica, localização, interações e atividade com marcação fluorescente não invasiva utilizando imagens vivas in vivo, tornando-se uma ferramenta poderosa para estudar as taxas de síntese proteica em tempo real8,,10. No entanto, existem certas etapas críticas que requerem atenção e solução de problemas. Fornecemos soluções alternativas para esses potenciais obstáculos ou limitações encontrados durante o procedimento experimental.
Uma questão diz respeito ao movimento dos vermes, pois o verme pode escapar da fonte de luz durante o fotobleaching. Esta questão pode ser parcialmente superada usando animais transgênicos expressando o alelo rol-6(su1006), que faz com que os animais se movam de forma sinusoidal. Dessa forma, o fotobleaching animal pode ser realizado continuamente. Além disso, o experimentador pode acompanhar o movimento do verme que se move fora do plano de visão muito mais lento. No entanto, as almofadas de ágar também podem ser usadas como uma alternativa para imobilizar totalmente os animais.
A duração ideal do fotobleaching é um fator crítico adicional que deve ser determinado e mantido estável durante todos os experimentos. Fotobleaching insuficiente devido a fotobleaching não-alvo ou curta duração pode ser encontrado. Isso pode ser superado aumentando (a) o objetivo de ampliação e abertura numérica, (b) a intensidade da luz e/ou (c) duração do fotobleaching.
Se não for detectada uma recuperação significativa da fluorescência, existem parâmetros potenciais que podem ser alterados. Se o fotobleaching for excessivo, reduza a duração do fotobleaching à medida que ocorreu o dano da amostra. Os danos ao verme podem ser avaliados observando traços de vida como sensibilidade ao toque, locomoção, colocação de ovos, bombeamento faringeal e capacidade reprodutiva. Se a cinética da recuperação da tradução de proteínas for lenta, permita um período de recuperação mais longo. A recuperação da síntese proteica varia entre diferentes famílias de proteínas e depende do comprimento das fusões derepórteres 7.
A atividade do promotor pode influenciar a cinética da síntese proteica. Se o promotor estiver inativo durante a recuperação, mude o promotor utilizado. A atividade do promotor pode ser alterada em condições de estresse, como fotodamagem. Use promotores de atividade estáveis para monitorar os músculos globais (por exemplo, let-858, ife-2, sod-3) ou específicos de tecido (por exemplo, músculos da parede corporal; myo-3, unc-54; faringex: mio-2; pan-neuronal: unc-119, rab-3; neurônios mecanosensoriais: mec-4; intestino: vha-6, ges-1) taxas de tradução de proteínas.
Se ocorrer inibição inadequada da tradução proteica por cicloheximida, o aumento do tempo de pré-incubação dos nematoides superaria esse problema. Uma ressalva que deve ser levada em consideração é o uso de vermes transgênicos superexpressando proteínas. O uso de nematoides transgênicos gerados pelo CRISPR/Cas9 expressando as proteínas fluorescentes marcadas de interesse em níveis fisiológicos fornecerá uma imagem mais precisa da cinética proteica e da rotatividade.
Os níveis totais de proteína detectados são o resultado de suas taxas de degradação e síntese de proteínas. A degradação proteica invariavelmente ocorre em níveis basais em todas as células eucarióticas. Assim, as taxas de recuperação da fluorescência proteica, que são medidas neste protocolo, não são absolutas, mas relativas às condições que estão sendo comparadas. Em essência, a recuperação da fluorescência na presença de degradação proteica é medida. Portanto, supõe-se que todas as condições têm taxas de degradação de proteínas iguais após o fotobleaching. Para medir as taxas absolutas de tradução de proteínas, devem ser usadas cepas de vermes mutantes deficientes em termos de degradação proteica. Especificamente, mutações em genes como rpn-10 do proteasome ou lgg-2 para autofagia podem ser usadas como um controle11. Alternativamente, pode-se realizar uma derrubada rnai de proteínas proteassômicas e autofágicas. Além disso, substratos autofárgicos como SQST-1::GFP podem ser usados para detectar a contribuição da degradação autofágica nas condições experimentais selecionadas12.
Em ambos os cenários experimentais, esta técnica FRAP é não radioativa, não invasiva, que detecta taxas de síntese de proteínas de novo in vivo em diferentes tecidos em C. elegans. Permite imagens vivas antes e durante a fotobleaching em um ambiente in vivo e posterior monitoramento dos animais durante toda a sua vida. A perturbação da iniciação da tradução desacelera o envelhecimento, portanto, medir as taxas globais de síntese de proteínas pelo FRAP poderia ser usada como uma leitura direta do processo de envelhecimento. Este protocolo pode ser otimizado e usado em maior escala para tela de genes e/ou produtos químicos relacionados ao processo de envelhecimento ou doença relacionada à idade. Alternativamente, as taxas de degradação total ou específica da proteína podem ser medidas por fotobleaching em diferentes origens genéticas usando o mesmo protocolo em combinação com cicloheximida. Como a tradução de proteínas é inibida por cicloheximida, a taxa de degradação proteica será detectada. Este protocolo ajudará na melhor compreensão das vias de degradação da proteína em modelos genéticos de doenças de agregação de proteínas13.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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