Extracellulair DNA (ecDNA) dat vrijkomt bij de celdood is pro-inflammatorium en draagt bij aan ontsteking. Meting van ecDNA op de plaats van letsel kan de werkzaamheid van therapeutische behandeling in het doelorgaan bepalen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een machine learning tool om de meting van ecDNA in nierweefsel te automatiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Glomerulaire celdood is een pathologisch kenmerk van myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV). Extracellulair deoxyribonucleïnezuur (ecDNA) komt vrij tijdens verschillende vormen van celdood, waaronder apoptose, necrose, necroptose, neutrofiele extracellulaire vallen (NETs' s) en pyroptose. Meting van deze celdood is tijdrovend met verschillende biomarkers die nodig zijn om de verschillende biochemische vormen van celdood te identificeren. Meting van ecDNA wordt over het algemeen uitgevoerd in serum en urine als surrogaat voor nierschade, niet in het eigenlijke doelorgaan waar de pathologische schade optreedt. De huidige moeilijkheid bij het onderzoeken van ecDNA in de nier is het gebrek aan methoden voor formaline vast paraffine embedded weefsel (FFPE) zowel experimenteel als in gearchiveerde menselijke nierbiopten. Dit protocol biedt een samenvatting van de stappen die nodig zijn om te vlekken voor ecDNA in FFPE weefsel (zowel menselijke als murine), blus autofluorescentie en meet de ecDNA in de resulterende beelden met behulp van een machine learning tool van de openbaar beschikbare open source ImageJ plugin trainable Weka segmentatie. Trainable Weka segmentatie wordt toegepast op ecDNA binnen de glomeruli waar het programma leert om ecDNA te classificeren. Deze classificatie wordt toegepast op latere verworven nierbeelden, waardoor de noodzaak van handmatige annotaties van elke afzonderlijke afbeelding wordt verminderd. Het aanpassingsvermogen van de trainbare Weka-segmentatie wordt verder aangetoond in nierweefsel van experimentele murineanti-MPO glomerulonephritis (GN), om NET's en ecMPO, gemeenschappelijke pathologische bijdragen aan anti-MPO GN te identificeren. Deze methode biedt objectieve analyse van ecDNA in nierweefsel dat duidelijk de werkzaamheid aantoont waarin het trainbare Weka-segmentatieprogramma ecDNA kan onderscheiden tussen gezond normaal nierweefsel en ziek nierweefsel. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om ecDNA, NETs en ecMPO in andere organen te identificeren.
Inleiding
Myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV) is een auto-immuunziekte die resulteert in nierfalen van pathologische glomerulaire letsel met aanzienlijke celdood en het vrijkomen van deoxyribonucleic zuur (DNA)1,2. DNA kan het immuunsysteem activeren door op te treden als een gevaarssignaal. Onder normale gezonde omstandigheden biedt de nucleaire locatie van DNA bescherming tegen blootstelling aan het immuunsysteem. Zelf-DNA dat extracellulair vrijkomt tijdens pathogene processen of auto-immuniteit wordt door het immuunsysteem gezien als een krachtige proinflam....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze methode maakt detectie van pan ecDNA van alle vormen van celdood mogelijk. Dezelfde methode en antilichamen worden gebruikt voor menselijke nierbiopsieweefsel (vanaf stap 4). Alle dierlijke en menselijke onderwerpen hadden de goedkeuring van de Ethiek van De Universiteit van Monash, en De Gezondheid van Monash, Clayton, Victoria, Australië.
1. Kleuring voor ecDNA met DAPI en β-Actin
- Induceer een 20-daags model van anti-myeloperoxidase glomerulonephritis (anti-MPO-GN) in 8-10 weken oude C57/Bl6 muizen, met controles9.
- Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van een CO2-kamer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze beelden vertegenwoordigen de meerdere stappen die nodig zijn om met succes gebruik te maken van trainbare Weka segmentatie om de arbeidsintensieve handmatige meting van ecDNA in fluorescerend gekleurd FFPE nierweefsel van een muis met geïnduceerde anti-MPO GN te minimaliseren. Deze stappen worden samengevat in figuur 1 en figuur 2 met beelden die rechtstreeks uit het Weka-segmentatieprogramma zijn genomen, waarin elke stap i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er bestaan meerdere protocollen die pro-inflammatoriummarkeringen meten in het serum en de urine van zowel patiënten als muismodellen van glomerulonephritis. Dit beschreven protocol maakt analyse van de producten van celdood (ecDNA, NETs en ecMPO) direct binnen de glomerulus mogelijk. De meest cruciale stappen in dit protocol is de weefselvoorbereiding en beeldvorming. Het belangrijkste beperkende element van het gebruik van een fluorescerende kleuring methode voor analyse is het weefsel autofluorescentie. Formaline vast.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen Monash Micro Imaging voor het gebruik van Nikon C1 rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop en het Monash Histology Platform voor de verwerking van nierweefsel.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% en 1% oplossingen worden gemaakt in PBS, kunnen in bulk worden gemaakt en bevroren- weggooien na ontdooien. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Gemaakt in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 Dit is niet standaard dikte- ontworpen voor gebruik in confocale microscopie |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Voeg TRIS en EDTA samen toe in gedestilleerd water en pH tot 9, voor antigeenretrieval, kan worden gemaakt in een 10x oplossing |
| Ethanol 30%, 70% en 100% | Chem Supply | UN1170 | Wordt geleverd als 100% ontnatuurd ethanol- verdun tot 30% en 70% met behulp van gedestilleerd water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutraal gebufferd Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Nier wordt gedurende 16 uur bij RT in een 5ml buisje met 3ml formaline geplaatst, formaline moet in een afzuiging worden gebruikt |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Het gebruik van positief geladen gecoate slides is essentieel. We raden het gebruik van poly-L-lysine voor het coaten van slides niet aan, aangezien weefsel loskomt van de slides tijdens de antigeenretrieval stap |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Wordt direct gebruikt, in 200ml kleurvaten, gebruik in een afzuiging |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Gebruiken om een cirkel rond nierweefsel te tekenen |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Maak 5L per keer |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Gekocht in lokale huishoudwinkel |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Breng druppels rechtstreeks op de dekglas |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Kleurvat dat wordt gekozen moet in staat zijn om koken onder druk en incubatie in een 60 graden oven te weerstaan |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Voeg 3g toe aan een 1L fles in 70% Ethanol, filter en bescherm tegen licht- stabiel gedurende 6 maanden bij kamertemperatuur |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Voeg TRIS en EDTA samen toe in gedestilleerd water en pH tot 9, voor antigeenretrieval, kan worden gemaakt in een 10x oplossing |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Moet worden gebruikt in een afzuiging |
Referenties
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
