Summary
Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av järnoxid nanopartiklar-skalade mikrobubblor (NSMs) genom självmontering, synergizing magnetisk, akustisk och optisk lyhördhet i en nanoterapeutisk plattform för magnetisk hypertermi och fototermisk kombination cancer terapi.
Abstract
Precisionsleveransen av cancerläkemedel som syftar till riktad och djupt penetrerad leverans samt en kontrollerad frisättning på tumörplatsen har ifrågasatts. Här tillverkar vi järnoxidnanopartiklar skalade mikrobubblor (NSMs) genom självmontering, synergisering av magnetisk, akustisk och optisk lyhördhet i en nanoterapeutisk plattform. Järnoxidnanopartiklar fungerar som både magnetiska och fototermiska medel. När intravenöst injiceras kan NSMs magnetiskt styras till tumör platsen. Ultraljud utlöser frisättningen av järnoxidnanopartiklar, vilket underlättar penetrationen av nanopartiklar djupt in i tumören på grund av kavitationseffekten av mikrobubblor. Därefter kan magnetisk hypertermi och fototermisk terapi utföras på tumören för kombinationscancerbehandling, en lösning för cancerresistens på grund av tumör heterogeniteten. I detta protokoll utfördes syntes och karakterisering av NSMs inklusive strukturella, kemiska, magnetiska och akustiska egenskaper. Dessutom undersöktes anti-cancereffekten genom termisk terapi med hjälp av in vitro-cellkulturer. Den föreslagna leveransstrategin och kombinationsbehandlingen har stora löften inom cancerbehandling för att förbättra både leverans- och cancereffekten.
Introduction
Cancer är en av de dödligaste sjukdomarna och orsakar miljontals dödsfall varje år över hela världen och enorma ekonomiska förluster1. På kliniker kan konventionella cancerbehandlingar, såsom kirurgisk samband, strålbehandling och kemoterapi fortfarande inte ge en tillfredsställande terapeutisk effekt2. Begränsningar av dessa terapier är höga toxiska biverkningar, hög återkommande hastighet och hög metastaseringshastighet3. Till exempel lider kemoterapi av den låga leveranseffektiviteten hos kemoläkemedel exakt till tumörstället4. Oförmågan hos läkemedel att tränga djupt in i tumörvävnaden över de biologiska barriärerna, inklusive extracellulär matris och högt tumörinterstitiellt vätsketryck, är också ansvarig för den låga terapeutiska effekten5. Dessutom sker tumörresistensen vanligtvis hos de patienter som fick behandling med enstaka kemoterapi6. Därför har tekniker där termisk ablation av tumör uppstår, såsom fototermisk terapi (PTT) och magnetisk hypertermibehandling (MHT), visat lovande resultat för att minska tumörresistens och har dykt upp i kliniska prövningar7,8,9.
PTT utlöser termisk ablation av cancerceller genom verkan av fototermiska omvandlingsmedel under bestrålning av laserenergin. Den genererade höga temperaturen (över 50 °C) inducerar fullständig cellnekros10. Helt nyligen visades järnoxidnanopartiklar (IONPs) vara ett fototermiskt omvandlingsmedel som kan aktiveras av nära infraröd (NIR) ljus11. Trots den låga molar absorptionskoefficienten i den nära infraröda regionen, är IONPs kandidater för låg temperatur (43 °C) fototermisk terapi, en modifierad terapi för att minska skadorna orsakade av värmeexponering för normala vävnader och för att initiera antitumör immunitet mot tumör metastasering12. En av begränsningarna med PTT är laserns låga penetrationsdjup. För djupt rotade tumörer är alternerande magnetfält (AFM) inducerad uppvärmning av järnoxidnanopartiklar, även kallad magnetisk hypertermi, en alternativ terapi för PTT13,14. Den största fördelen med MHT är den höga penetrationen av magnetfält15. Den erforderliga relativt höga koncentrationen av IONP är dock fortfarande en stor nackdel för dess kliniska tillämpning. Leveranseffektiviteten hos nanomedicin (eller nanopartiklar) till fasta tumörer hos djur har varit 1-10% på grund av en rad hinder inklusive cirkulation, ackumulering och penetration16,17. Därför är en kontrollerad och riktad IONPs leveransstrategi med förmågan att uppnå hög vävnadspenetration av stort intresse för cancerbehandling.
Ultraljud medierad nanopartikel leverans har visat sin förmåga att underlätta penetration av nanopartiklar djupt in i tumörvävnaden, på grund av fenomenet kallas mikrobubble kavitation18,19. I den aktuella studien tillverkar vi JONP:er skalade mikrobubblor (NSMs) genom självmontering, synergisering av magnetisk, akustisk och optisk lyhördhet i en nanoterapeutisk plattform. NSM innehåller en luftkärna och ett skal av järnoxidnanopartiklar, med en diameter på cirka 5,4 μm. NSMs kan magnetiskt styras till tumör platsen. Sedan utlöses frisättningen av JONP: er av ultraljud, åtföljd av mikrobubble kavitation och mikroström. Den fart som erhållits från mikroströmmen underlättar penetrationen av JONP: er i tumörvävnaden. PTT och MHT kan uppnås genom NIR laser bestrålning eller AFM-applicering, eller med kombinationen av båda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med de protokoll som godkänts av OG Pharmaceuticals riktlinjer för djurvård och användning av laboratoriedjur. Protokollen följde riktlinjerna från etikkommittén för laboratoriedjur från OG Pharmaceutical.
1. Nanopartikelskalade mikrobubblor (NSMs) syntes
- Sprid magnetiska nanopartiklar (Fe3O4, järnoxid) i avjoniserat vatten för att bilda en 10 mg / ml stamlösning.
- Placera röret som innehåller IONPs-lösningen i en ultraljudsrengöringsmaskin i 20 minuter. Skaffa en jämnt spridd IONPs-lösning före användning.
- Tillsätt 150 μL avjoniserat vatten, 150 μL 10 mM natriumdidcylsulfat (SDS) och 400 μL av en stamlösning av JONP:er från steg 1.1. i 1,5 ml centrifugeringsrör.
- Fixera homogeniseraren med en byggnadsställning i ett isbad.
- Placera blandningens rör i ett isbad och placera homogenisatorsonden exakt för att fördjupas i blandningslösningen.
- Justera homogeniseringshastigheten till 20 000 varv/min och slå på homogenisatorn i 3 minuter.
- Stäng av homogenisatorn och ta bort röret från isbadet.
- Placera röret i rörstället för 12 h stabilisering vid rumstemperatur.
- Adsorbera de resulterande NSMs till rörväggen med en magnet och ta bort supernatanten. Fyll sedan på med 1 ml färskt avjoniserat vatten.
- Upprepa tvättprocessen i tre gånger och suspendera upp NSMs i 1 ml färskt destillerat vatten.
- Överför 10 μL NSMs-fjädring till en ren glasrutschbana efter att ha skakat något.
- Använd ett fluorescensmikroskop vid 20x förstoring för att visualisera NSMs morfologi. Se till att ta bilder på slumpmässigt område.
- Mät diametern på NSMs från bilderna med hjälp av en nano measurer 1.2-programvara med öppen åtkomst. Räkna minst 200 mikrobubblor.
- Klicka på "Arkiv" och "Öppna" för att välja den bildfil som ska bearbetas. När bilden har importerats trycker du på "linjalen". Rita en röd linje med samma längd som linjalen.
- Tryck sedan på "Inställningar" | "Linjal" och ange linjalens längd. Rita linjer av samma längder som diametern på de enskilda mikrobubblorna i bilden. Slutför alla mätningar och klicka sedan på "Rapportera" | " Visa rapport".
2. Akustisk respons av NSMs
- Späd 200 μL NSMs med 800 μL avjoniserat vatten och överför sedan till ett 1,5 ml centrifugeringsrör för att bilda en stamlösning.
- Anslut funktionsgeneratorn, förstärkaren, impedansmatchningen och den hemlagade fokuserade givaren. Placera givaren i mitten längst ner på den konstgjorda kubiska diskbänken och anslut hydrofonen med ett oscilloskop för att övervaka den utmatade ultraljudsintensiteten (Figur 1). Tillsätt avjoniserat vatten i diskbänken för att sänka ner givaren.
- Justera funktionsgeneratorn till svepläget, ställ in frekvensområdet från 10 kHz till 900 kHz och ställ in amplituden på 20 Vpp (Spänningstopp). Justera ultraljudets effekt till 0,1% av förstärkaren. Varje cykels varaktighet är 4 s med ett tidsintervall på 1 s.
- Förbered 1 ml NSMs lagerlösningsprover i röret och fixera röret med en byggnadsställning på toppen av den hemlagade fokuserade givaren. Fäst magneten på botten av röret och locka till dig NSMs.
- Slå på kraften hos funktionsgeneratorn och förstärkaren. Stäng av funktionsgeneratorn efter applicering av 5 cykler (25 s) ultraljud. Ta bort magneten och samla 1 ml av lösningen som innehåller de frisläppta JONP: erna. Tillsätt 1 ml avjoniserat vatten i centrifugröret.
- Upprepa steg 2.5. tills NSMs i röret kollapsar helt.
- Kvantifiera alla utsläppta JONP:er med den induktivt kopplade plasmaoptiska emissionsspektrometrin (ICP-OES) enligt beskrivningen tidigare13.
3. Optisk respons från NSMs
OBS: I detta arbete används ett lasersystem som innehåller 808 nm laserkraft och en infraröd värmekamera som tidigare beskrivits av Xu et al.20.
- Förberedelse av lasersystem
- Slå på laserns strömförsörjning och låt den värma i flera minuter. Fixa en fiber i kombination med 808 nm laserdiod på ett retortställ.
- Rikta laserstrålen till provstadiet genom en optisk fiber och fokusera på provsteget för att uppnå en 6 mm ljuspunkt (i diameter) med en konvex lins.
- Mät uteffekten med en lasereffektmätare och justera effekten till 1 W/cm2.
- Fäst den infraröda värmekameran på stativet. Slå på kameran och kontrollera om den fungerar (t.ex. övervaka den fokuserade intresseområdet (ROI) temperatur). Stäng av strömförsörjningen och den infraröda värmekameran.
- Fototermisk mätning i vattenlösning
- Förbered 1 ml-provet vid olika IONPs-koncentration (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) i ett 1,5 ml centrifugrör.
- Placera röret av intresse i laserstrålens fokuserade region och registrera provet.
- Slå på lasereffekten och den infraröda värmekameran och bestråla provet i 10 minuter kontinuerligt. Samtidigt registrerar du temperaturen i realtid.
- Stäng av lasereffekten och den infraröda värmekameran efter 10 minuters bestrålning. Vänta tills temperaturen i regionen återgår till baslinjen.
- Upprepa 3.2.2-3.2.4 för mätning av andra prover.
OBS: Använd avjoniserat vatten vid 20 °C som manöver för fototermisk mätning.
- Fototermisk mätning i odlade celler
OBS: Murin bröstcancerceller (4T1) valdes som en modell för att undersöka hämningseffekten genom fototermisk behandling.- Mata cellerna med Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin. Ställ in odlingsmiljön som 37 °C och 5 % CO2.
- Kultur 4T1 celler i T25 flaskor och passage cellerna i ett 1:2 förhållande när 90% sammanflöde uppnås.
OBS: Subkulturförhållandet kan justeras enligt de specifika cellförhållandena i olika laboratorier. - Ta bort och kassera odlingsmediet. Skölj cellskiktet med 1x PBS-lösning för att ta bort det kvarvarande serumet som innehåller trypsinhämmare.
- Tillsätt 2 ml Trypsin-EDTA-lösning (0,25 %) till kolven för lossning. Tillsätt sedan 3 ml 1640 medium och aspirera celler genom att försiktigt pipetting.
- Samla 5 ml av cellfjädringen och centrifugera vid 500 x g i 3 min.
- Ta bort supernaten och tillsätt 1 ml färskt 1640 medium för att bilda en cellupphängning.
- Tillsätt 100 μL av cellfjädringen i en konfokal skål som innehåller 1 ml av odlingsmediet. Se till att cellfjädringens koncentration är 9 x 105/ml och att den slutliga cellkoncentrationen i cellkulturens konfokala maträtt är 8,1 x 104/ml.
- Placera den inokulerade cellkulturens konfokala maträtt i en inkubator i 24 timmar.
- Späd ut olika koncentration (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) av IONPs-provet för att göra 1 ml lösning med serumfritt 1640 medium.
- Aspirera odlingsmediet från konfokal skålen och tillsätt den beredda provlösningen.
- Slå på lasereffekten. Rikta laserstrålen i mitten av skålen och justera utgångseffekten till 1 W/cm2. Slå på den infraröda värmekameran, bestråla cellerna i den konfokala skålen i 10 minuter kontinuerligt. Registrera temperaturen i realtid för den fokuserade regionen.
- Stäng av laser- och infraröd värmekamera. Överför den bestrålade skålen till inkubatorn i ytterligare 24 timmar.
- Ta bort och kassera odlingsmediet, tillsätt 1 ml av det färska odlingsmediet i den konfokala skålen. Tillsätt 5 μL Calcein-AM-lösning (1 mg/ml) i skålen.
- Inkubera konfokal skålen vid 37 °C och 5 % CO2 i 15 min. Skölj cellskiktet med 1x PBS-lösning två gånger.
- Observera och avbilda cellerna med ett konfokalt fluorescensmikroskop med en excitationsvåglängd på 488 nm och en emissionsvåglängd på 500-540 nm.
- Välj 5 områden i de konfokala bilderna slumpmässigt och räkna antalet levande 4T1-celler i varje område manuellt. Kvantifiera livskraften hos 4T1-celler genom att jämföra antalet levande celler i alla experimentella grupper med kontrollgruppen.
OBS: Använd det serumfria 1640-mediet vid 20 °C som kontroll för det fototermiska måttet. Använd provet utan laser bestrålning som cellens livskraftskontrollgrupp.
- Fototermisk mätning in vivo
- Förbered 3 av 8 veckor gamla ICR hanmöss med en medelvikt på 25 ± 2 g.
- Tillsätt 2 g gelatinpulver till 20 ml avjoniserat vatten. Värm lösningen till 40 - 50 °C, lös upp gelatingelen helt för att bilda en transparent och tydlig lösning.
- Tillsätt 100 mg JONP:er till lösningen från 3.4.2.
- Värm gelén till 40 – 50 °C, injicera omedelbart 500 μL av gelatinlösningen i musens högra bröstkudde.
- Slå på laserkraften och fokusera laserstrålen på intresseområdet (mössens högra bröstplatta). Justera utgångseffekten till 1 W/cm2. Slå på den infraröda värmekameran, bestråla intresseområdet i 10 minuter kontinuerligt. Registrera temperaturen i den region där det finns intresse för realtid.
- Stäng av laser- och infraröd värmekamera.
- Avliva möss med CO2-kvävning och förskjutning av livmoderhalskotor eller någon metod som godkänts av institutets djurforskningskommitté.
4. Magnetisk hypertermimätning
OBS: Här används ett magnetiskt hypertermisystem som tidigare beskrivits av Wu et al. (21).
- Förbered ett magnetiskt hypertermisystem inkluderar en växel generator för magnetfält (AFM) och en infraröd värmekamera.
- Slå på kylaggregatet i 10 minuter och slå sedan på den måttliga radiofrekvensvärmemaskinen (dvs. AFM-generatorn).
- Ställ in maskinens parametrar på följande sätt: frekvens (f) = 415 kHz, magnetfältsintensitet = 1,8 kA/m.
- Magnetisk hypertermimätning i vattenlösning
- Bered 1 ml av provet vid olika IONPs-koncentration (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) i ett 1,5 ml centrifugeringsrör.
- Placera röret i mitten av en vattenkyld magnetisk induktionskoppspole.
- Slå på det alternerande magnetfältet (AFM) och den infraröda värmekameran. Inducera provet i 10 minuter kontinuerligt och registrera temperaturen i realtid.
OBS: Kameran är placerad högst upp i provet och tillhandahåller en tvärsnittsvy av provet. - Stäng av AFM och den infraröda värmekameran. Vänta tills temperaturen på kopparspolen kommer tillbaka till baslinjen i 10 minuter.
OBS: Var försiktig med hög temperatur, undvik direkt kontakt med händerna och vänta på kylning innan du tar bort proverna. - Upprepa 4.2.2-4.2.4 för mätning av de andra proverna.
- Stänga av den måttliga radiofrekvensvärmemaskinen (AFM) och kylaggregatet.
OBS: Använd det avjoniserade vattnet vid 20 °C som en kontroll för magnetisk hypertermimätning.
- Magnetisk hypertermimätning in vivo
- Förbered 3 av 8 veckor gamla ICR hanmöss med en medelvikt på 25 ± 2 g.
- Bered 20 ml 10 % gelatingel som innehåller 5 mg/ml IONP-lösning.
- Värm gelatingelen till 40 - 50 °C, injicera omedelbart 500 μL av gelatinlösningen i djurets högra bröstdyna.
OBS: Magnetiskt inducerade hypertermi experiment utfördes med värmemaskinen med samma parametrar som in vitro-testet. - Slå på det alternerande magnetfältet (AFM) och den infraröda värmekameran. Placera mössens högra bröstkudde i mitten av en vattenkyld magnetisk induktionskoppspole.
- Slå på den infraröda värmekameran, avbilda intresseområdet (mössens högra bröstplatta) i 10 minuter kontinuerligt och registrera temperaturen i intresseregionen i realtid.
- Stäng av maskinens strömbrytare och infraröd värmekamera efter 10 minuters induktion. Vänta tills kopparspolens temperatur återgår till baslinjen i 10 minuter.
- Upprepa 4.3.4 till 4.3.6 för mätning av andra prover.
- Stänga av den måttliga radiofrekvensvärmemaskinen (AFM) och kylaggregatet.
OBS: Var försiktig med hög temperatur, undvik direkt kontakt med händerna och vänta på kylning innan du tar bort proverna. - Avliva möss med CO2-kvävning och förskjutning av livmoderhalskotor eller någon metod som godkänts av institutets djurforskningskommitté.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De trippelresponsiva nanopartikelskalade mikrobubblor (NSMs) som används i denna studie utarbetades genom att agitera blandningen av tensiden och JONP: er. Jonerna (50 nm) är självmonterade vid gränssnittet mellan vätske- och gaskärnan, för att bilda ett tätt packat magnetiskt skal. NSMs morfologi visas i figur 1A. De resulterande NSMs presenterade en sfärisk form och med en genomsnittlig diameter på 5,41 ± 1,78 μm (Figur 1B). Resultaten visade att NSMs förbereddes framgångsrikt. När de lagrades i vatten förblev mikrobubblorna intakta i mer än 1 år och var stabila i buffertar och cellkulturmedium i minst 10 dagar19. Som visas i figur 1Duppnåddes en stegvis frisättning av Fe med ökande antalet cykler av tillämpat ultraljud. Efter 10 cykler släpptes cirka 20% av Fe. Fram till 50 ultraljudscykler nådde mängden utsläppt Fe en platå till cirka 80%. Dessa resultat föreslog on-demand release av IONPs av en extern ultraljud utlösare.
IONPs-medierad fototermisk mätning i vattenlösning visas i figur 2. Temperaturen på JONP:er ökade snabbt med ökande bestrålningstid enligt figur 2A,B. En temperaturökning på 30 °C skulle kunna uppnås när den utsätts för en NIR-laser (808 nm,1 W/cm2)i 10 minuter vid Fe-koncentrationen på 5 mg/ml.
Den värme som PTT alstrar kan döda cancercellerna. Livskraften hos 4T1 cell av PTT utvärderades av NIR laser (808 nm, 1 W/cm2)behandling i 10 min. Som visas i figur 3A,B, i jämförelse med kontrollgruppen, fanns det ingen skillnad i morfologi och levande cellnummer när inkuberades med en hög koncentration av Fe (5 mg/ml), vilket tyder på att IONPs är bra biotillgänglighet. När bestrålades av NIR laser, celler blev runda form, vilket indikerar apoptos. Kvantifieringen av det levande cellnumret, dvs. Cellerna inkuberade med hög IONPs koncentration (3,65 mg/mL och 5 mg/mL) under NIR bestrålning hade den högsta dödstalen, vilket är cirka 80% respektive 100%. Den låga IONPs koncentrationen (1.025 mg/mL och 1.35 mg/mL) behandlade gruppen visade en liknande avlivning effektivitet som cirka 40%. Resultaten visar att den fototermiska effekten av NSMS effektivt kan behandla cancer.
Som visas i figur 4A,B, ökade temperaturen i gelatinjektionsområdet snabbt med ca 20 °C efter 5 min NIR-bestrålning. Den verkliga yttemperaturen i det område där det finns intresse för möss kan uppnås till omkring 57 °C. Som visas i figur 5övervakades värmeavbildningen av olika koncentrationer av JONP(1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) av en infraröd värmekamera (figur 5A) och de förhöjda temperaturkurvorna registrerades och ritades med olika tidsintervall (figur 5B). Bland dem kan 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml och 5 mg/ml IONP:er snabbt värma upp lösningen och öka temperaturen (20 °C, 30 °C, 40 °C) efter 10 min induktion. Resultaten visar en alternerande magnetisk fältrespons som är karakteristisk för NSMS.
I in vivo magnetisk hypertermi experiment, möss utsattes för AFM med frekvensen 415 kHz och den magnetiska amplituden på 1,8 kA/m i 10 min. Uppvärmningsprocessen övervakades av en infraröd värmekamera i realtid (figur 6A, 6B). Betydande temperaturförändringar i intresseområdet observerades(figur 6). Temperaturen ökade snabbt med tiden, med en ökning av 50 °C för 10 minuters induktion.
Figur 1: Karakterisering och kontrollerad IONP-utgåva av NSMs. (A) Representativ ljusfältsmikroskopibild av NSMs. Skalstreck: 20 μm. B) NSM:ns diameterfördelning, n = 200. C) Diagrammet över ultraljudsutrustning som används i försöket. (D) Kumulativa frisättningsprofiler av JONP:er från NSMs under ultraljudsstimulering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Jonpsmedierad fototermisk mätning i vattenhaltig. a) Infraröda termiska bilder av olika koncentrationer av JONP efter 10 min laser bestrålning vid 808 nm för 1 W/cm2. b) Typiska temperaturhöjdskurvor av olika koncentrationer av JONP:er (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Jonpsmedierad fototermisk mätning i 4T1-celler. a) Konfokal fluorescensmikroskopi bilder av levande 4T1 celler efter 24h inkubation med olika koncentrationer av JONP (färgat med Calcein-AM, grön). NIR-behandlade celler exponerades för 808 nm laser i 10 min (1 W/cm2). Skalstång: 50 μm. b) Typiska temperaturhöjdskurvor av olika koncentrationer av JONP behandlade 4T1 celler i 10 min NIR-bestrålning (1 W/cm2). c) Kvantifiering av livskraften hos 4T1 celler som inkuberats med JONP i olika koncentrationer med eller utan NIR-behandling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Jonpsmedierad fototermisk mätning in vivo. A) Infraröda termiska bilder av musens intresseområde som utsätts för NIR-lasern (808 nm, 1 W/cm2, 10 min) som tagits med olika tidsintervall. B) Förhöjda temperaturkurvor med olika tidsintervall efter NIR-laserbehandling (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Jonepar-medierad magnetisk hypertermimätning i vattenhaltig. a) Infraröda termiska bilder av olika koncentrationer av IONP-lösning under AFM med frekvensen 415 kHz och den magnetiska amplituden på 1,8 kA/m i 10 minuter. (B) Typiska temperaturkurvor för olika koncentrationer av IONPs-lösning under AFM med frekvensen 415 kHz och den magnetiska amplituden på 1,8 kA/m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Jonepar-medierad magnetisk hypertermi in vivo. a) Infraröda termiska bilder av mössens intresseområde som fångats med olika tidsintervall under afm med frekvensen 415 kHz och den magnetiska amplituden på 1,8 kA/m i 10 minuter. (B) Förhöjda temperaturkurvor med olika tidsintervall under AFM med frekvensen 415 kHz och den magnetiska amplituden på 1,8 kA/m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterade vi ett protokoll för tillverkning av järnoxidnanopartiklarskalade mikrobubblor (NSMs) genom självmontering, synergisering av magnetisk, akustisk och optisk lyhördhet i en nanoterapeutisk plattform. IONPsna packades tätt runt lufta kärnar ur för att bilda ett magnetiskt beskjuter, som kan kontrolleras av det yttre magnetiskt sätter in för att uppriktningen. När de har levererats kan frisättningen av JONP: er uppnås genom ultraljudsutlösare. De frisläppta JONP:erna kan aktiveras av både NIR-ljus och AFM för PTT och MHT, eller kombinationen av båda.
Under hela protokollet spelar de syntesstegen i NSMs en viktig roll, vilket är grunden för hela protokollet. Samtidigt validerade den kontrollerade frisättningen av JONP:er in vitro det akustiska svaret hos NSMs. Protokollet för fototermisk mätning i vattenlösning och magnetisk hypertermimätning i vattenlösning validerade också den magnetiska respektive optiska reaktionen hos NSMs.
För att NSMs ska kunna förberedas framgångsrikt måste lösningen av JONP:er ljudas i 20 minuter före användning för att säkerställa jämn spridning av JONP:er i vattnet. När agitationen utfördes måste homogenisatorsonden sänkas ned helt i lösningen. När du studerar NSMs akustiska respons måste provröret placeras direkt ovanpå givaren och locka NSMs till botten av röret av magneten för att förhindra dämpning av ultraljudsintensiteten. Dessutom, om temperaturökningen inte var signifikant under fototermisk mätning eller magnetisk hypertermimätning, kan det bero på att provet varken var i fokus för laserstrålen eller i mitten av en vattenkyld magnetisk induktionskoppspole.
Det bör noteras att protokollet fortfarande har vissa begränsningar. Till exempel, även om medeldiametern för de beredda NSMs liknade diametern på vissa kliniskt använda mikrobubblor22 (för ultraljudsavbildning), måste dock enhetligheten i NSMs storlek förbättras. Dessutom bör cirkulationen av NSMs i blod förbättras genom modifiering av mikrobubbleytan. Bortsett från detta har synergizing terapi inte verifierats in vivo, och den terapeutiska effekten in vivo är fortfarande okänd.
Den föreslagna IONPs leverans strategi inte bara uppnå on-demand release av IONPs men också främja penetration av IONPs i tumör vävnaden. För närvarande begränsar det ökade interstitiella vätsketrycket i tumören och den täta tumör stromen kraftigt nanopartikelns leveranseffektivitet5. Därför ger detta protokoll en strategi för vävnadsgenomträngande för nanomedicinsk leverans och är av stort intresse för cancerbehandling.
Vi visade också att IONPs-medierad PTT och MHT är effektiva både in vitro och in vivo. Resultaten visade att IONPs hade en bra fototermisk omvandling och magnetiska termisk omvandling förmågor och kan brinna tumör effektivt. Kombinationen av både PTT och MHT var tillräcklig för att säkerställa fullständig cancercellsdöd och förbättra effekten av cancer. I framtiden kommer dubbel värmebehandling (dvs. PTT och MHT) av NSMs att ge ett nytt alternativ för behandling av djupt rotad solid tumör på kliniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81601608) och NUPTSF (NY216024).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
- Kievit, F. M., Zhang, M. Cancer nanotheranostics: improving imaging and therapy by targeted delivery across biological barriers. Advanced Materials. 23 (36), 217-247 (2011).
- Wu, H., et al. Fe3O4-Based Multifunctional Nanospheres for Amplified Magnetic Targeting Photothermal Therapy and Fenton Reaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (2), 1045-1056 (2018).
- Thorat, N. D., et al. Physically stimulated nanotheranostics for next generation cancer therapy: Focus on magnetic and light stimulations. Applied Physics Reviews. 6 (4), 041306 (2019).
- Sun, Q., Zhou, Z., Qiu, N., Shen, Y. Design of Cancer Nanomedicine: Nanoproperty Integration and Synchronization. Advanced Materials. 29 (14), 1606628 (2017).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Anchordoquy, T. J., et al. Mechanisms and Barriers in Cancer Nanomedicine: Addressing Challenges, Looking for Solutions. ACS Nano. 11 (1), 12-18 (2017).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. of Iron Oxide Nanoparticles in Cancer Therapy: Amplification of Heating Efficiency by Magnetic Hyperthermia and Photothermal Bimodal Treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Rastinehad, A. R., et al. Gold nanoshell-localized photothermal ablation of prostate tumors in a clinical pilot device study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18590-18596 (2019).
- Sharma, S. K., Shrivastava, N., Rossi, F., Tung, L. D., Thanh, N. T. K. Nanoparticles-based magnetic and photo induced hyperthermia for cancer treatment. Nano Today. 29, 100795 (2019).
- Das, R., Rinaldi-Montes, N. Boosted Hyperthermia Therapy by Combined AC Magnetic and Photothermal Exposures in Ag/Fe3O4 Nanoflowers. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25162-25169 (2016).
- Yang, Y., et al. 1D Coordination Polymer Nanofibers for Low-Temperature Photothermal Therapy. Advanced Materials. 29 (40), 1703588 (2017).
- Curcio, A., et al. Iron Oxide Nanoflowers CuS Hybrids for Cancer Tri-Therapy: Interplay of Photothermal Therapy, Magnetic Hyperthermia and Photodynamic Therapy. Theranostics. 9 (5), 1288-1302 (2019).
- Espinosa, A., et al. Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and In Vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Xu, C., et al. Magnetic Hyperthermia Ablation of Tumors Using Injectable Fe(3)O(4)/Calcium Phosphate Cement. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (3), 13866-13875 (2015).
- Wilhelm, S., et al. Analysis of nanoparticle delivery to tumours. Nature Reviews Materials. 1, 16014 (2016).
- Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J., Chen, X.
- Rapoport, N. Y., Kennedy, A. M., Shea, J. E., Scaife, C. L., Nam, K. H. Controlled and targeted tumor chemotherapy by ultrasound-activated nanoemulsions/microbubbles. Journal of Controlled Release : The Official Journal of the Controlled Release Society. 138 (3), 268-276 (2009).
- Gao, Y., et al. Controlled nanoparticle release from stable magnetic microbubble oscillations. NPG Asia Materials. 8 (4), 260 (2016).
- Bao, B., et al. Mussel-inspired functionalization of semiconducting polymer nanoparticles for amplified photoacoustic imaging and photothermal therapy. Nanoscale. 11 (31), 14727-14733 (2019).
- Wu, H., et al. Enhanced Tumor Synergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation of Hyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species. ACS Nano. 13 (12), 14013-14023 (2019).
- Alzaraa, A., et al. Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting. American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).
