Summary
Presentert her er en protokoll for fabrikasjon av jernoksid nanopartikkelskallede mikrobubbles (NSMs) gjennom selvmontering, synergiserende magnetisk, akustisk og optisk respons i en nanoterapeutisk plattform for magnetisk hypertermi og fototermisk kombinasjon kreftbehandling.
Abstract
Presisjonsleveringen av kreftmidler som tar sikte på målrettet og dypt penetrert levering samt en kontrollert frigjøring på tumorstedet har blitt utfordret. Her fremstiller vi nanopartikkelskall av jernoksid (NSMer) gjennom selvmontering, synergiserende magnetisk, akustisk og optisk respons i en nanoterapeutisk plattform. Jernoksid nanopartikler tjener som både magnetiske og fototermale midler. Når de er intravenøst injisert, kan NSMer styres magnetisk til tumorstedet. Ultralyd utløser frigjøring av jernoksid nanopartikler, noe som letter penetrasjon av nanopartikler dypt inn i svulsten på grunn av kavitasjonseffekten av mikrobobler. Deretter kan magnetisk hypertermi og fototermisk terapi utføres på svulsten for kombinasjonskreftbehandling, en løsning for kreftresistens på grunn av tumor heterogeniteten. I denne protokollen ble syntesen og karakteriseringen av NSMer inkludert strukturelle, kjemiske, magnetiske og akustiske egenskaper utført. I tillegg ble antikrefteffekten ved termisk terapi undersøkt ved hjelp av in vitro cellekulturer. Den foreslåtte leveringsstrategien og kombinasjonsterapien har et stort løfte i kreftbehandlingen om å forbedre både leverings- og anticancer-effekten.
Introduction
Kreft er en av de dødeligste sykdommene, forårsaker millioner av dødsfall hvert år over hele verden og store økonomiske tap1. I klinikker kan konvensjonelle anticancer terapier, som kirurgisk reseksjon, strålebehandling og kjemoterapi fortsatt ikke gi en tilfredsstillende terapeutisk effekt2. Begrensninger ved disse terapiene er høye toksiske bivirkninger, høy tilbakefallshastighet og høy metastasehastighet3. For eksempel lider kjemoterapi av lav leveringseffektivitet av kjemomedisiner nettopp til svulststedet4. Manglende evne til å trenge dypt inn i tumorvevet over de biologiske barrierene, inkludert ekstracellulær matrise og høyt tumorinterstitiellt væsketrykk, er også ansvarlig for den lave terapeutiske effekten5. Dessuten skjer tumormotstanden vanligvis hos pasientene som fikk behandling med enkelt kjemoterapi6. Derfor har teknikker der termisk ablasjon av svulst oppstår, for eksempel fototermisk terapi (PTT) og magnetisk hypertermibehandling (MHT), vist lovende resultater for å redusere tumorresistens og har dukket opp i kliniske studier7,8,9.
PTT utløser termisk ablasjon av kreftceller ved virkningen av fototermale konverteringsmidler under bestråling av laserenergien. Den genererte høye temperaturen (over 50 °C) induserer fullstendig cellenekrose10. Nylig ble jernoksid nanopartikler (IONPer) vist å være et fototermisk konverteringsmiddel som kan aktiveres av nær-infrarødt (NIR) lys11. Til tross for den lave molarabsorpsjonskoeffisienten i nær infrarød region, er IONPer kandidater for lavtemperatur (43 °C) fototermisk terapi, en modifisert terapi for å redusere skaden forårsaket av varmeeksponering for normalt vev og for å initiere antitumorimmunitet mot tumormetastase12. En av begrensningene til PTT er laserens lave penetrasjonsdybde. For dype sittende svulster er vekslende magnetfelt (AFM) indusert oppvarming av jernoksid nanopartikler, også kalt magnetisk hypertermi, en alternativ terapi for PTT13,14. Den største fordelen med MHT er den høye penetrasjonen av magnetfelt15. Imidlertid er den nødvendige relativt høye konsentrasjonen av IONPer fortsatt en stor ulempe for den kliniske anvendelsen. Leveringseffektiviteten til nanomedisin (eller nanopartikler) til faste svulster hos dyr har vært 1-10% på grunn av en rekke hindringer, inkludert sirkulasjon, akkumulering og penetrasjon16,17. Derfor er en kontrollert og målrettet IONPs leveringsstrategi med evnen til å oppnå høy vevsinntrengning av stor interesse for kreftbehandling.
Ultralydmediert nanopartikkellevering har vist sin evne til å lette penetrasjonen av nanopartikler dypt inn i tumorvevet, på grunn av fenomenet kalt mikrobubble kavitasjon18,19. I den nåværende studien fremstiller vi IONPs skallede mikrobubbles (NSMer) gjennom selvmontering, synergiserende magnetisk, akustisk og optisk respons i en nanoterapeutisk plattform. NSM inneholder en luftkjerne og et skall av jernoksid nanopartikler, med en diameter på ca. 5,4 μm. NSM-ene kan magnetisk styres til tumorstedet. Deretter utløses frigjøringen av IONPer ved ultralyd, ledsaget av mikrobubble kavitasjon og mikrostreaming. Momentumet mottatt fra mikrostreamingen letter penetrasjonen av IONPer i tumorvevet. PTT og MHT kan oppnås ved NIR laserbestråling eller AFM-applikasjon, eller med kombinasjonen av begge deler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokollene som er godkjent av OG Pharmaceuticals retningslinjer for dyrepleie og bruk av forsøksdyr. Protokollene fulgte retningslinjene fra Etikkutvalget for forsøksdyr i OG Pharmaceutical.
1. Nanopartikkelskallede mikrobobler (NSMer) syntese
- Disperger magnetiske nanopartikler (Fe3O4, jernoksid) i deionisert vann for å danne en 10 mg / ml lagerløsning.
- Plasser røret som inneholder IONPs-løsningen i en ultralydrengjøringsmaskin i 20 minutter. Få en jevnt dispergert IONPer-løsning før bruk.
- Tilsett 150 μL deionisert vann, 150 μL 10 mM natriumddecylsulfat (SDS) og 400 μL av en lagerløsning av IONPer fra trinn 1.1. i 1,5 ml sentrifugerør.
- Fest homogenisatoren med stillas i et isbad.
- Plasser røret til blandingen i et isbad og plasser homogenisatorsonden nøyaktig for å bli nedsenket i blandingsløsningen.
- Juster homogenisatorhastigheten til 20 000 o/min og slå på homogenisatoren i 3 minutter.
- Slå av homogenisatoren og fjern røret fra isbadet.
- Plasser røret på rørstativet for 12 timers stabilisering ved romtemperatur.
- Adsorber de resulterede NSM-ene til rørveggen med en magnet og fjern supernatanten. Fyll deretter på med 1 ml ferskt deionisert vann.
- Gjenta vaskeprosessen tre ganger og sett NSM-er på nytt i 1 ml ferskt destillert vann.
- Overfør 10 μL NSMs suspensjon til et rent glasssklie etter litt risting.
- Bruk et fluorescensmikroskop ved 20x forstørrelse for å visualisere NSMs morfologi. Sørg for å ta bilder på et tilfeldig område.
- Mål diameteren på NSM-ene fra bildene ved hjelp av en nanomåler 1.2-programvare med åpen tilgang. Tell minst 200 mikrobobler.
- KlikkFilogÅpnefor å velge bildefilen som skal behandles. Når bildet er importert, trykker du linjalen. Tegn en rød linje med samme lengde som linjalen.
- Trykk deretter på "Innstillinger" | Linjal, og angi lengden på linjalen. Tegn linjer av samme lengde som diameterene til de enkelte mikroboblene i bildet. Fullfør alle målene, og klikk deretter på "Rapport" | " Vis rapport.
2. Akustisk respons fra NSMer
- Fortynn 200 μL NSMer med 800 μL deionisert vann, og overfør deretter til et 1,5 ml sentrifugerør for å danne en lagerløsning.
- Koble til funksjonsgeneratoren, forsterkeren, impedansmatching og hjemmelaget fokusert svinger. Plasser svingeren i midten nederst på den kunstige cuboid vasken og koble hydrofonen med et oscilloskop for å overvåke utgangs ultralydintensiteten (Figur 1). Tilsett deionisert vann i vasken for å senke transduseren ned.
- Juster funksjonsgeneratoren til feiemodus, still inn frekvensområdet fra 10 kHz til 900 kHz og sett amplituden til 20 Vpp (Spenningstopp-topp). Juster effekten av ultralyd til 0,1% av forsterkeren. Varigheten for hver syklus er 4 s med et tidsintervall på 1 s.
- Forbered 1 ml NSMs lagerløsningsprøver i røret og fest røret med et stillas på toppen av den hjemmelagde fokuserte svingeren. Fest magneten til bunnen av røret og tiltrekk NSM-ene.
- Slå på kraften til funksjonsgeneratoren og forsterkeren. Slå av funksjonsgeneratoren etter påføring av 5 sykluser (25 s) ultralyd. Fjern magneten og samle 1 ml av løsningen som inneholder de frigjorte IONPene. Tilsett 1 ml deionisert vann til sentrifugerøret.
- Gjenta trinn 2.5. til NSM-er i røret kollapser helt.
- Kvantifisere alle utgitte IONPer ved induktivt koblet plasma optisk utslipp spektrometri (ICP-OES) som beskrevet tidligere13.
3. Optisk respons fra NSMer
MERK: I dette arbeidet brukes et lasersystem som inneholder 808 nm lasereffekt og et infrarødt termisk bildekamera som tidligere er beskrevet av Xu et al.20.
- Klargjøring av lasersystem
- Slå på strømforsyningen til laseren og la den varme i flere minutter. Fest en fiber koblet 808 nm laserdiode på et retort stativ.
- Rett laserstrålen til prøvetrinnet gjennom en optisk fiber og fokuser på prøvetrinnet for å oppnå et 6 mm lyspunkt (i diameter) med en konveks linse.
- Mål utgangseffekten med en lasereffektmåler og juster strømmen til 1 W/cm2.
- Fest det infrarøde termiske bildekameraet på stativet. Slå på kameraet og kontroller om du fungerer (f.eks. overvåke det fokuserte interesseområdet (ROI)-temperaturen). Slå av strømforsyningen og det infrarøde termoavbildningskameraet.
- Fototermisk måling i vandig løsning
- Forbered 1 ml-prøven ved forskjellig IONPs konsentrasjon (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) i et sentrifugerør på 1,5 ml.
- Plasser røret av interesse i det fokuserte området av laserstrålen og registrer grunntemperaturen til prøven.
- Slå på laserkraften og det infrarøde termiske bildekameraet og bestråle prøven i 10 minutter kontinuerlig. Samtidig registrerer du temperaturen i sanntid.
- Slå av laserkraften og det infrarøde termiske bildekameraet etter 10 min bestråling. Vent til temperaturen i regionen går tilbake til grunnlinjen.
- Gjenta 3.2.2 til 3.2.4 for måling av andre prøver.
MERK: Bruk deionisert vann ved 20 °C som kontroll for fototermal måling.
- Fototermisk måling i dyrkede celler
MERK: Murine brystkreftceller (4T1) ble valgt som modell for å undersøke hemmingseffekten ved fototermisk behandling.- Fôr cellene med Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin. Sett modningsmiljøet som 37 °C og 5 % CO2.
- Kultur 4T1 celler i T25 kolber og passasje cellene i et 1: 2 forhold når 90% samløp er nådd.
MERK: Subkulturforholdet kan justeres i henhold til de spesifikke celleforholdene i forskjellige laboratorier. - Fjern og kast kulturmediet. Skyll cellelaget med 1x PBS-oppløsning for å fjerne gjenværende serum som inneholder trypsinhemmer.
- Tilsett 2 ml Trypsin-EDTA-oppløsning (0,25%) i kolben for løsrivelse. Tilsett deretter 3 ml 1640 mellomstore og aspirerte celler ved forsiktig pipettering.
- Samle 5 ml av cellefjæringen og sentrifugen ved 500 x g i 3 minutter.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml friskt 1640 medium for å danne en celleoppheng.
- Tilsett 100 μL av cellefjæringen til en konfokal tallerken som inneholder 1 ml av kulturmediet. Forsikre deg om at konsentrasjonen av celleoppheng er 9 x 105/ ml, og den endelige cellekonsentrasjonen i cellekultur konfektfat er 8,1 x 104/ ml.
- Plasser den inokulerte cellekulturen konfektrett i en inkubator i 24 timer.
- Fortynn forskjellig konsentrasjon (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) av IONP-prøven for å lage 1 ml oppløsning med serumfri 1640 medium.
- Aspirer kulturmediet fra den konfokale parabolen og tilsett den tilberedte prøveløsningen.
- Slå på laserkraften. Fokuser laserstrålen midt på fatet og juster utgangseffekten til 1 W/cm2. Slå på det infrarøde termiske bildekameraet, bestråle cellene i den konfiskere parabolen i 10 minutter kontinuerlig. Registrer temperaturen i sanntid for den fokuserte regionen.
- Slå av laserkameraet og det infrarøde termoavbildningskameraet. Overfør den bestrålede parabolen til inkubatoren i ytterligere 24 timer.
- Fjern og kast kulturmediet, tilsett 1 ml av det friske kulturmediet i den konfølale parabolen. Tilsett 5 μL Calcein-AM-oppløsning (1 mg/ml) i retten.
- Inkuber den konfiskere konfektretten ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter. Skyll cellelaget med 1x PBS-oppløsning to ganger.
- Observer og avbilde cellene ved et konfokalt fluorescensmikroskop med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og en utslippsbølgelengde på 500-540 nm.
- Velg 5 områder i de konfiske bildene tilfeldig og telle antall levende 4T1 celler i hvert område manuelt. Kvantifisere levedyktigheten til 4T1 celler ved å sammenligne antall levende celler i alle eksperimentelle grupper med kontrollgruppen.
MERK: Bruk det serumfrie 1640-mediet ved 20 °C som en kontroll for det fototermale tiltaket. Bruk prøven uten laserbestråling som kontrollgruppe for celle levedyktighet.
- Fototermisk måling in vivo
- Forbered 3 av 8 uker gamle ICR hannmus med en gjennomsnittlig vekt på 25 ± 2 g.
- Tilsett 2 g gelatinpulver til 20 ml deionisert vann. Varm oppløsningen til 40 - 50 °C, oppløs gelatingelen helt for å danne en gjennomsiktig og klar løsning.
- Tilsett 100 mg IONPer i oppløsningen fra 3,4,2.
- Varm gelen til 40 – 50 °C, injiser umiddelbart 500 μL gelatinoppløsningen i musens høyre brystpute.
- Slå på laserkraften og fokuser laserstrålen på interesseområdet (musenes høyre brystpute). Juster utgangseffekten til 1 W/cm2. Slå på det infrarøde termiske bildekameraet, bestråle interesseområdet i 10 minutter kontinuerlig. Registrer temperaturen i regionen av interesse i sanntid.
- Slå av laserkameraet og det infrarøde termoavbildningskameraet.
- Avlive mus ved CO 2-kvelning og livmorhalsvirvelforskyvning eller en hvilken som helst metode godkjent av instituttets dyreforskningskomité.
4. Magnetisk hypertermimåling
MERK: Her brukes et magnetisk hypertermisystem som tidligere er beskrevet av Wu et al. (21).
- Klargjør et magnetisk hypertermisystem, inkludert en alternerende magnetfeltgenerator (AFM) og et infrarødt termisk bildekamera.
- Slå på kjøleren i 10 minutter og slå deretter på den moderate radiofrekvensvarmemaskinen (dvs. AFM-generator).
- Angi parametrene til maskinen på følgende måte: frekvens (f) = 415 kHz, magnetfeltintensitet = 1,8 kA/m.
- Magnetisk hypertermimåling i vandig oppløsning
- Forbered 1 ml av prøven ved forskjellig IONPs konsentrasjon (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) i et sentrifugerør på 1,5 ml.
- Plasser røret i midten av en vannkjølt magnetisk induksjons kobberspole.
- Slå på det vekslende magnetfeltet (AFM) og det infrarøde termiske bildekameraet. Induser prøven i 10 min kontinuerlig og registrer temperaturen i sanntid.
MERK: Kameraet er plassert øverst i prøven, og gir en tverrsnittsvisning av prøven. - Slå av AFM og det infrarøde termiske bildekameraet. Vent til temperaturen på kobberspolen kommer tilbake til grunnlinjen i 10 minutter.
MERK: Vær forsiktig med høy temperatur, unngå direkte kontakt med hendene og vent på kjøling før du fjerner prøver. - Gjenta 4.2.2 til 4.2.4 for måling av de andre prøvene.
- Slå av den moderate radiofrekvensoppvarmingsmaskinen (AFM) og kjøleren.
MERK: Bruk det avioniserte vannet ved 20 °C som kontroll for magnetisk hypertermimåling.
- Magnetisk hypertermi måling in vivo
- Forbered 3 av 8 uker gamle ICR hannmus med en gjennomsnittlig vekt på 25 ± 2 g.
- Forbered 20 ml 10 % gelatingel som inneholder 5 mg/ml IONPs oppløsning.
- Varm gelatingelen til 40 - 50 °C, injiser umiddelbart 500 μL av gelatinoppløsningen i dyrets høyre brystpute.
MERK: Magnetisk-induserte hypertermiforsøk ble utført med varmemaskinen ved hjelp av de samme parametrene som in vitro-testen. - Slå på det vekslende magnetfeltet (AFM) og det infrarøde termiske bildekameraet. Plasser musens høyre brystpute i midten av en vannkjølt magnetisk induksjons kobberspole.
- Slå på det infrarøde termiske bildekameraet, bilde interesseområdet (musenes høyre brystpute) i 10 minutter kontinuerlig og registrer temperaturen i interesseområdet i sanntid.
- Slå av strømbryteren på maskinen og det infrarøde termiske bildekameraet etter 10 min med induksjon. Vent til temperaturen på kobberspolen går tilbake til grunnlinjen i 10 minutter.
- Gjenta 4.3.4 til 4.3.6 for måling av andre prøver.
- Slå av den moderate radiofrekvensoppvarmingsmaskinen (AFM) og kjøleren.
MERK: Vær forsiktig med høy temperatur, unngå direkte kontakt med hendene og vent på kjøling før du fjerner prøver. - Avlive mus ved CO 2-kvelning og livmorhalsvirvelforskyvning eller en hvilken som helst metode godkjent av instituttets dyreforskningskomité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De trippelresponsive nanopartikkelskallede mikrobubbles (NSM-ene) som ble brukt i denne studien, ble utarbeidet ved å agitere blandingen av overflateaktive og IONPer. IONPene (50 nm) selvmontert ved grensesnitt av væske- og gasskjerne, for å danne et tettpakket magnetisk skall. Morfologien til NSMer er vist i figur 1A. De resulterte NSM-ene presenterte en sfærisk form og med en gjennomsnittlig diameter på 5,41 ± 1,78 μm (figur 1B). Resultatene indikerte at NSM-ene var forberedt. Når de ble lagret i vann, forble mikroboblene intakte i mer enn 1 år, og var stabile i buffere og cellekulturmedium i minst 10 dager19. Som vist i figur 1D, ble en trinnvis frigjøring av Fe oppnådd med å øke antall sykluser med anvendt ultralyd. Etter 10 sykluser ble omtrent 20% av Fe utgitt. Inntil 50 ultralydsykluser nådde mengden frigjort Fe et platå til rundt 80%. Disse resultatene foreslo behovsbetinget frigjøring av IONPer ved en ekstern ultralydutløser.
IONPer-mediert fototermisk måling i vandig oppløsning er vist i figur 2. Temperaturen på IONPene økte raskt med økende bestrålingstid som vist i figur 2A,B. En temperaturøkning på 30 °C kan oppnås når den utsettes for en NIR-laser (808 nm,1 W/cm2) i 10 minutter ved Fe-konsentrasjonen på 5 mg/ml.
Varmen generert av PTT kan drepe kreftcellene. Levedyktigheten til 4T1 celle av PTT ble evaluert av NIR laser (808 nm, 1 W / cm2) behandling i 10 min. Som vist i figur 3A,B, i forhold til kontrollgruppen, var det ingen forskjell i morfologi og levende cellenummer når det inkuberes med en høy konsentrasjon av Fe (5 mg / ml), noe som tyder på god biotilgjengelighet av IONPer. Når de ble bestrålet av NIR-laser, ble cellene rund form, noe som indikerer apoptose. Kvantifiseringen av det levende cellenummeret, det vil si levedyktigheten til celler, er vist i figur 3C. Cellene inkubert med høy IONPs konsentrasjon (3,65 mg/ml og 5 mg/ml) under NIR-bestråling hadde den høyeste dødsraten, som er henholdsvis rundt 80 % og 100 %. Den lave IONPs konsentrasjonen (1,025 mg/ml og 1,35 mg/ml) viste en tilsvarende drapseffektivitet som ca. 40 %. Resultatene viser at den fototermale effekten av NSMS effektivt kan behandle kreft.
Som vist i figur 4A,B, økte temperaturen på gelatininjeksjonsområdet raskt med ca. 20 °C etter 5 min NIR-bestråling. Den virkelige overflatetemperaturen i interesseområdet for mus kan nås til rundt 57 °C. Som vist i figur 5, når den ble eksponert for AFM, ble den termiske avbildningen av forskjellige konsentrasjoner av IONPer (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) overvåket av et infrarødt termisk kamera (figur 5A), og de forhøyede temperaturkurvene ble registrert og plottet på forskjellige tidsintervaller (figur 5B). Blant dem kan 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml og 5 mg/ml IONPer raskt varme opp oppløsningen og øke temperaturen (henholdsvis 20 °C, 30 °C, 40 °C) etter 10 min induksjon. Resultatene viser en vekslende magnetfeltrespons som er karakteristisk for NSMS.
I in vivo magnetisk hypertermi eksperiment ble mus utsatt for AFM med en frekvens på 415 kHz og den magnetiske amplituden på 1,8 kA / m i 10 minutter. Oppvarmingsprosessen ble overvåket av et infrarødt termisk bildekamera i sanntid (Figur 6A, 6B). Det ble observert betydelige temperaturendringer i interesseområdet (figur 6). Temperaturen økte raskt med tiden, med en økning på 50 °C i 10 min induksjon.
Figur 1: Karakterisering og kontrollerte IONPer-utgivelse av NSM-ene (A) Representativt mikroskopibilde av NSMer. Skalalinje: 20 μm. (B) Diameterfordelingen til NSM-ene, n = 200. (C) Diagrammet over ultralydutstyr som brukes i eksperimentet. (D) Kumulative utgivelsesprofiler for IONPer fra NSM-er under ultralydstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: IONPer-mediert fototermisk måling i vandig. (A) Infrarøde termiske bilder av forskjellige konsentrasjoner av IONPer etter 10 min laserbestråling ved 808 nm for 1 W/cm2. (B) Typiske temperaturhøydekurver av forskjellige konsentrasjoner av IONPer (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: IONPer-mediert fototermisk måling i 4T1 celler. (A) Konfokal fluorescensmikroskopibilder av levende 4T1 celler etter 24h inkubasjon med forskjellige konsentrasjoner av IONPer (farget med Calcein-AM, grønn). NIR-behandlede celler ble eksponert for 808 nm laser i 10 min (1 W/cm2). Skala bar: 50 μm. (B) Typiske temperaturforhøyningskurver av forskjellige konsentrasjoner av IONPer behandlet 4T1 celler i 10 min NIR bestråling (1 W /cm2). (C) Kvantifisering av levedyktigheten til 4T1 celler inkubert med IONPer ved forskjellige konsentrasjoner med eller uten NIR-behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: IONPer-mediert fototermisk måling in vivo. (A) Infrarøde termiske bilder av interesseområdet til musen som er eksponert for NIR-laseren (808 nm, 1 W/cm2, 10 min) tatt med forskjellige tidsintervaller. (B) Forhøyede temperaturkurver ved ulike tidsintervaller etter NIR-laser (808 nm, 1 W/cm2, 10 min) behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: IONPer-mediert magnetisk hypertermimåling i vandig. (A) Infrarøde termiske bilder av forskjellige konsentrasjoner av IONP-oppløsning under AFM med en frekvens på 415 kHz og den magnetiske amplituden på 1,8 kA/m i 10 minutter. (B) Typiske temperaturkurver av forskjellige konsentrasjoner av IONPs løsning under AFM med en frekvens på 415 kHz og den magnetiske amplituden på 1,8 kA/m. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: IONPer-mediert magnetisk hypertermi in vivo. (A) Infrarøde termiske bilder av musenes interesseområde tatt med forskjellige tidsintervaller under AFM med en frekvens på 415 kHz og den magnetiske amplituden på 1,8 kA/m i 10 minutter. (B) Forhøyede temperaturkurver ved forskjellige tidsintervaller under AFM med en frekvens på 415 kHz og den magnetiske amplituden på 1,8 kA/m. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterte vi en protokoll for fabrikasjon av jernoksid nanopartikkelskallede mikrobubbles (NSMer) gjennom selvmontering, synergiserende magnetisk, akustisk og optisk respons i en nanotherapeutisk plattform. IONPene var tett pakket rundt luftkjernen for å danne et magnetisk skall, som kan styres av det eksterne magnetfeltet for målretting. Når den er levert, kan utgivelsen av IONPer oppnås ved ultralydutløser. De utgitte IONPene kan aktiveres av både NIR-lys og AFM for PTT og MHT, eller kombinasjonen av begge deler.
Under hele protokollen spiller syntesetrinnene til NSMer en viktig rolle, som er grunnlaget for hele protokollen. Samtidig validerte den kontrollerte utgivelsen av IONPs in vitro den akustiske responsen til NSMer. Protokollen for fototermisk måling i vandig løsning og magnetisk hypertermimåling i vandig løsning validerte også henholdsvis den magnetiske og optiske responsen til NSMer.
For å forberede NSM-ene vellykket, må løsningen av IONPer sonikeres i 20 minutter før bruk for å sikre jevn spredning av IONPer i vannet. Når agitasjonen ble utført, må homogenisatorsonden nedsenkes helt i løsningen. Når du studerer akustisk respons fra NSMer, må prøverøret plasseres på toppen av svingeren direkte og tiltrekke NSM-ene til bunnen av røret ved magneten for å forhindre demping av ultralydintensiteten. Dessuten, hvis temperaturøkningen ikke var signifikant under fototermisk måling eller magnetisk hypertermimåling, kan det skyldes at prøven verken var i fokus for laserstrålen eller i midten av en vannkjølt magnetisk induksjon kobberspole.
Det skal bemerkes at protokollen fortsatt har noen begrensninger. For eksempel, selv om gjennomsnittsdiameteren til de forberedte NSM-ene lignet diameteren på noen klinisk brukte mikrobobler22 (for ultralydavbildning), må imidlertid ensartetheten til NSMs størrelse forbedres. I tillegg bør sirkulasjonen av NSMer i blod forbedres ved modifikasjon av mikrobubble overflaten. Bortsett fra dette har synergiserende terapi ikke blitt verifisert in vivo, og den terapeutiske effekten in vivo er fortsatt ukjent.
Den foreslåtte IONPs leveringsstrategi oppnår ikke bare den behovsbetingede utgivelsen av IONPer, men fremmer også penetrasjon av IONPer i tumorvevet. For tiden begrenser det økte interstitielle væsketrykket i svulsten og den tette svulsten stroma i stor grad nanopartikkelleveringseffektiviteten5. Derfor gir denne protokollen en vevgjennomtrengende strategi for nanomedisinsk levering og er av stor interesse for kreftbehandling.
Vi viste også at IONPer-medierte PTT og MHT er effektive både in vitro og in vivo. Resultatene viste at IONPene hadde en god fototermisk konvertering og magnetiske termiske konverteringsevner og kunne fyre opp svulst effektivt. Kombinasjonen av både PTT og MHT var tilstrekkelig til å sikre fullstendig kreftcelledød og forbedre anticancer-effekten. I fremtiden vil dobbel termisk terapi (dvs. PTT og MHT) av NSMer gi et nytt alternativ for behandling av dyptliggende solid svulst i klinikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81601608) og NUPTSF (NY216024).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
- Kievit, F. M., Zhang, M. Cancer nanotheranostics: improving imaging and therapy by targeted delivery across biological barriers. Advanced Materials. 23 (36), 217-247 (2011).
- Wu, H., et al. Fe3O4-Based Multifunctional Nanospheres for Amplified Magnetic Targeting Photothermal Therapy and Fenton Reaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (2), 1045-1056 (2018).
- Thorat, N. D., et al. Physically stimulated nanotheranostics for next generation cancer therapy: Focus on magnetic and light stimulations. Applied Physics Reviews. 6 (4), 041306 (2019).
- Sun, Q., Zhou, Z., Qiu, N., Shen, Y. Design of Cancer Nanomedicine: Nanoproperty Integration and Synchronization. Advanced Materials. 29 (14), 1606628 (2017).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Anchordoquy, T. J., et al. Mechanisms and Barriers in Cancer Nanomedicine: Addressing Challenges, Looking for Solutions. ACS Nano. 11 (1), 12-18 (2017).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. of Iron Oxide Nanoparticles in Cancer Therapy: Amplification of Heating Efficiency by Magnetic Hyperthermia and Photothermal Bimodal Treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Rastinehad, A. R., et al. Gold nanoshell-localized photothermal ablation of prostate tumors in a clinical pilot device study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18590-18596 (2019).
- Sharma, S. K., Shrivastava, N., Rossi, F., Tung, L. D., Thanh, N. T. K. Nanoparticles-based magnetic and photo induced hyperthermia for cancer treatment. Nano Today. 29, 100795 (2019).
- Das, R., Rinaldi-Montes, N. Boosted Hyperthermia Therapy by Combined AC Magnetic and Photothermal Exposures in Ag/Fe3O4 Nanoflowers. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25162-25169 (2016).
- Yang, Y., et al. 1D Coordination Polymer Nanofibers for Low-Temperature Photothermal Therapy. Advanced Materials. 29 (40), 1703588 (2017).
- Curcio, A., et al. Iron Oxide Nanoflowers CuS Hybrids for Cancer Tri-Therapy: Interplay of Photothermal Therapy, Magnetic Hyperthermia and Photodynamic Therapy. Theranostics. 9 (5), 1288-1302 (2019).
- Espinosa, A., et al. Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and In Vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Xu, C., et al. Magnetic Hyperthermia Ablation of Tumors Using Injectable Fe(3)O(4)/Calcium Phosphate Cement. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (3), 13866-13875 (2015).
- Wilhelm, S., et al. Analysis of nanoparticle delivery to tumours. Nature Reviews Materials. 1, 16014 (2016).
- Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J., Chen, X.
- Rapoport, N. Y., Kennedy, A. M., Shea, J. E., Scaife, C. L., Nam, K. H. Controlled and targeted tumor chemotherapy by ultrasound-activated nanoemulsions/microbubbles. Journal of Controlled Release : The Official Journal of the Controlled Release Society. 138 (3), 268-276 (2009).
- Gao, Y., et al. Controlled nanoparticle release from stable magnetic microbubble oscillations. NPG Asia Materials. 8 (4), 260 (2016).
- Bao, B., et al. Mussel-inspired functionalization of semiconducting polymer nanoparticles for amplified photoacoustic imaging and photothermal therapy. Nanoscale. 11 (31), 14727-14733 (2019).
- Wu, H., et al. Enhanced Tumor Synergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation of Hyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species. ACS Nano. 13 (12), 14013-14023 (2019).
- Alzaraa, A., et al. Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting. American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).
