Summary
El objetivo del protocolo es comparar diferentes condiciones de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) para evaluar cómo el recubrimiento diferencial afecta la tasa de crecimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En particular, nuestro objetivo es establecer las condiciones para obtener un crecimiento óptimo de los cultivos iPSC.
Abstract
Este estudio se centra en comprender cómo el cultivo de iPSC en diferentes sustratos de recubrimiento ECM puede afectar la confluencia celular. Se ha establecido un protocolo para evaluar la confluencia de iPSC en tiempo real sin necesidad de contar células en suspensión unicelular para evitar cualquier perturbación del crecimiento. Se utilizó un sistema de análisis de imágenes de alto contenido para evaluar la confluencia de iPCS en 4 ECM diferentes a lo largo del tiempo de manera automatizada. Se utilizaron diferentes entornos de análisis para evaluar la confluencia celular de las iPSCs adherentes y solo se observó una ligera diferencia (a las 24 y 48 horas con laminina) si se aplicó una máscara al 60, 80 o 100%. También mostramos que la laminina conduce a la mejor confluencia en comparación con Matrigel, vitronectina y fibronectina.
Introduction
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtienen de células somáticas y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. A menudo se utilizan como un sistema para modelar la patogénesis de la enfermedad o realizar la detección de drogas, y también ofrecen el potencial de ser utilizados en el contexto de la medicina personalizada. Dado que las iPSC tienen un gran potencial, es importante caracterizarlas completamente para su uso como un sistema modelo confiable. Anteriormente mostramos la importancia de cultivar iPSCs en un ambiente hipóxico, ya que estas células dependen de la glucólisis y un ambiente aeróbico puede causar desequilibrio redox1. Las iPSC también son vulnerables a otras condiciones de cultivo, particularmente al entorno extracelular. La optimización de las condiciones de cultivo es un tema clave para mantenerlas sanas y proliferantes. Un cultivo saludable de iPSC conducirá a células sanas diferenciadas que generalmente son el punto final del modelo utilizado para comprender las características moleculares, celulares y funcionales de trastornos humanos específicos o procesos celulares.
En este estudio, se ha utilizado un protocolo simple para probar la confluencia de iPSCs utilizando diferentes condiciones de recubrimiento en pozos separados. Las iPSC requieren una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) para adherirse correctamente, pero la coexistencia de iPSCs y MEF dificulta la realización de análisis como ARN o extracción de proteínas, ya que hay dos poblaciones de células. Para evitar la capa de alimentación, se han utilizado diferentes proteínas pertenecientes a la matriz extracelular (ECM) para recrear el nicho celular natural y tener un cultivo de iPSC libre de alimentador. En particular, Matrigel es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que está enriquecida en proteínas de la matriz extracelular (es decir, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato, entactina/nidógeno y factores de crecimiento)2,3. Las otras condiciones de recubrimiento utilizadas son, en cambio, proteínas purificadas con relevancia conocida en la construcción de las ECM: se sabe que la laminina-521 es secretada por células madre pluripotentes humanas (hPSC) en la masa celular interna del embrión y es una de las lamininas más comunes en el cuerpo después del nacimiento 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina es una matriz de cultivo celular libre de xeno-conocida por apoyar el crecimiento y la diferenciación de hPSC 12,13,14,15,16; La fibronectina es una proteína ECM importante para el desarrollo de vertebrados y la unión y mantenimiento de células madre embrionarias en estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dado que existen diferentes condiciones de recubrimiento, las comparamos en términos de su efecto sobre la confluencia de las iPSC.
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Protocol
1. Recubrimiento de placas de 96 pozos
NOTA: Se probaron diferentes recubrimientos en la misma placa pero en pocillos separados (consulte el Archivo suplementario).
- Diluir el Matrigel 1:100 en DMEM. Añadir 100 μL por pocillo a las placas de 96 pocillos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, retire la solución y lave los pocillos con 100 μL de DMEM dos veces.
- Laminina diluida (20 μg/mL, LN-521) en PBS (con calcio y magnesio). Añadir 100 μL al pozo e incubar a 4 °C durante la noche. Al día siguiente realizar dos lavados con DMEM antes de sembrar las células.
- Vitronectina diluida (10 μg/mL) en tampón de dilución. Agregue 100 μL por pocillo a la placa de 96 pocillos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave los pocillos con PBS (sin calcio y magnesio) antes de colocar las células.
- Diluir HU-fibronectina (30 μg/mL) en ddH2O. Añadir 100 μL a los pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de esto, lave los pocillos con el medio antes de sembrar las células.
2. Mantenimiento de iPSCs en cultivo
NOTA: Las iPSC se compraron comercialmente. Las iPSCs se derivaron de fibroblastos humanos sanos y se reprogramaron utilizando tecnología episomal.
- Desde el congelador de -80 °C o nitrógeno líquido, descongelar las iPSC criopreservadas en un baño maría a 37 °C. Limpie el vial que contiene las células con etanol al 70% antes de moverlo al gabinete de seguridad biológica.
- Agregue la suspensión celular a 5 ml de medios de cultivo celular precalentados (p. ej., mTeSR1) gota a gota con una pipeta de 1000 μL en un tubo cónico estéril de 15 ml.
- Centrifugar las células a 304 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Retire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de medio de cultivo celular.
- Colocar la suspensión celular en dos pocillos de las placas de 6 pocillos (105 iPSCs por placa de cultivo celular de 6 pocillos), donde los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) han sido chapados previamente. Semillas MEFs dos días antes de emplatar iPSCs a una densidad de 2.4 x 104/cm2 en DMEM (que contiene 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina).
- Después de la siembra, complemente los medios celulares con 10 μM del inhibidor de ROCK Y-27632.
- Cultive las iPSC en MEF durante las primeras 4-5 semanas y luego en condiciones libres de alimentador (condición libre de MEF), utilizando uno de los recubrimientos de interés (consulte el paso 1 y la Tabla 1) en mTeSR1.
- Cuando las iPSCs son 70-80% confluentes, paso 1:4 usando 0,5 mM de tratamiento EDTA durante 3-5 min a RT. Añadir 1 mL de 0,5 mM EDTA para una placa de 6 pocillos (o cantidades proporcionales para otros tipos de placas). Transferir a nuevos pozos en condiciones libres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% CO2, 20%O2.
- Cambie el medio con mTeSR1 nuevo todos los días y divida las celdas cada 2 días.
3. Caracterización de la confluencia celular
- Use 96 placas de pocillos para los experimentos.
- Sembrar 10,000 células por pocillo después de al menos 1 mes de cultivo en condiciones libres de alimentador para asegurarse de que los MEF no fueron pasados. Use portaobjetos de conteo desechables para contar las células con el microscopio óptico.
- Realizar los experimentos por triplicado. Por lo tanto, pruebe cada condición de siembra en tres pozos.
- Realice la adquisición automatizada de imágenes desde el día 1 después de la siembra utilizando un citómetro en modo de campo claro. Realice la adquisición automatizada de imágenes cada 24 h durante 5 días. Para obtener información detallada sobre los parámetros experimentales, consulte el Archivo complementario.
- Utilice el contraste automático y la exposición automática para visualizar mejor las células.
- Establezca la configuración de análisis (consulte Archivo suplementario) para el análisis de confluencia para aplicar una máscara de 60%, 80% y 100% por pozo, con el fin de evaluar los cambios de enfoque debidos a la refracción de la luz en el borde de los pozos. Utilice la configuración de análisis de máscara diferente mencionada anteriormente para analizar la confluencia celular en cada punto de tiempo.
4. Análisis estadísticos
- Reporte los resultados cuantitativos como medias ± error estándar de la media (SEM).
- Para comparar las diferencias generales de las diferentes condiciones de recubrimiento, obtenga datos utilizando las mismas muestras y realice la prueba t de muestra pareada de Student. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos, y todos los valores de p informados son bilaterales.
5. Caracterización de los microfilamentos citoesqueléticos
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA al 4%) en PBS durante 10 min en RT, seguido de dos lavados en PBS (10 min en total).
- Añadir 100 μL de solución de bloqueo (compuesta por 5% BSA, 0,1% Triton en PBS) a cada pocillo durante 1 h a RT.
- Retire la solución de bloqueo y lave las muestras dos veces con PBS durante 10 minutos.
- Añadir 100 μL de la solución de trabajo conjugada con faloidina por muestra e incubar durante 1 h a RT.
- Lave las células dos veces con PBS (10 min en RT).
- Núcleos de tinción con Hoechst 33342 diluidos 1:10000 en PBS durante 10 min a RT.
- Retire la solución de Hoechst y lave las células dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
- Lave la muestra conH2Oy deje secar bajo una campana química.
- Añadir 100 μL de medios de montaje (es decir, PBS:glicerol, 1:1) para cubrir las células y preservar la fluorescencia de las muestras.
- Observe la celda a Ex/Em 493/517 nm en un microscopio confocal de barrido láser equipado con una fuente láser de luz blanca (WLL) y un láser de diodo de 405 nm. Adquiera imágenes confocales secuenciales utilizando un objetivo de inmersión en aceite HC PLAPO 40x. Utilice la misma potencia láser, divisores de haz, ajustes de filtro, diámetros de agujero de alfiler y modo de escaneo para todas las muestras examinadas.
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Representative Results
En este estudio, investigamos la confluencia de iPSCs cuando se cultivan en diferentes condiciones de recubrimiento. Usando un citómetro, pudimos obtener resultados fácilmente informativos en triplicados en 5 días. Dado que las iPSC apenas se adhieren a recipientes de plástico y es necesario un recubrimiento para apoyar su proliferación, decidimos monitorear la confluencia de iPSCs humanas, ya que es indicativo de la salud del cultivo celular y puede reflejar su potencial de diferenciación. Después de la expansión in vitro, sembramos las iPSCs en diferentes sustratos de ECM y analizamos células mediante la observación de las imágenes de muestra adquiridas en campo claro y utilizando tinción de faloidina (utilizada para teñir filamentos de actina, también conocida como F-actina) para comprender su adhesión a los vasos (Figura 1). De hecho, la tinción de faloidina permite visualizar el grado de adhesión celular a la superficie del recipiente y, por lo tanto, al recubrimiento específico utilizado para el recipiente. Las células que se adhieren al recubrimiento mostraron microfilamentos citoesqueléticos claramente visibles en lugar de microfilamentos colapsados. La observación del campo claro en combinación con la tinción de faloidina documenta un buen nivel de adhesión de las iPSCs a la superficie recubierta.
Para investigar la confluencia, sembramos las iPSCs con Matrigel, LN-521, vitronectina y Hu-fibronectina por triplicados, y realizamos el experimento tres veces. Para evitar la refracción de la luz debido al borde del pozo, aplicamos tres tipos de ajuste de análisis con una máscara de 60, 80 y 100%, y observamos que son similares en la selección de las celdas y evitar el fondo (Figura 2). Los resultados obtenidos muestran que las iPSCs sembradas en LN-521 muestran una alta tasa de proliferación celular de forma lineal a lo largo del tiempo, comparándola con los otros recubrimientos y que estas diferencias son estadísticamente significativas (asteriscos en la Figura 3A-C). Las células sembradas en Matrigel, Vitronectin o Hu-Fibronectin muestran una tasa de proliferación lineal en las primeras 96 horas, pero también muestran una mayor pendiente de la curva de confluencia en las últimas 24 horas (independientemente de la máscara utilizada, 60%, 80% o 100%, Figura 3A-C). Dado que la diferencia inicial a las 24 h para los diferentes recubrimientos puede deberse a diferencias en la unión celular, el crecimiento celular se ha normalizado a las 24 h para los puntos de tiempo posteriores (de 48 a 120 h) (Figura 3D-F). Los gráficos obtenidos utilizando la máscara 60, 80 y 100% muestran que no existen diferencias en términos de confluencia entre los diferentes recubrimientos y que las diferencias observadas con LN-521 se deben probablemente a una mayor capacidad de las iPSC para adherirse a este recubrimiento cuando se pasan.
Figura 1. Imágenes representativas de campo claro y tinción con faloidina de iPSCs sembradas en diferentes recubrimientos ECM después de 3 días. Imágenes de campo claro que muestran que las células están sanas en el recubrimiento utilizado y que están bien unidas a los vasos, como lo documenta la tinción de faloidina que muestra microfilamentos citoesqueléticos claramente visibles. Barra de escala: 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de campo claro que muestran tres configuraciones de análisis diferentes para las máscaras utilizadas para realizar análisis de confluencia. Mosaico obtenido con un citómetro utilizando imágenes de campo claro (16 imágenes/pocillo de una placa de 96 pocillos). En verde la segmentación del análisis muestra claramente las diferentes máscaras aplicadas (60, 80 100%) para evitar o incluir el borde redondo del pozo. Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de confluencia celular de iPSCs sembradas en vasos recubiertos de manera diferente. Gráfico que representa la confluencia celular de iPSCs sembradas en recipientes recubiertos de manera diferente. Los datos fueron analizados después de la adquisición con el software apropiado utilizando una (A) máscara al 60% (B) 80% (C) 100% durante 5 días (120 h). La normalización de la confluencia de los puntos de tiempo de 48 h a 120 h hasta el primer punto de tiempo (24 h) se muestra en (D, E, F). Los datos se obtuvieron de tres experimentos independientes. Los datos se representan como media ± SEM. n= 3 * p<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto de recubrimiento | Concentración inicial | Concentración final |
| HU-fibronectina | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminina 521 | 100 μg/ml | 20 μg/ml |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectina XF | 250 μg/ml | 10 μg/ml |
Tabla 1. Lista de compuestos de recubrimiento utilizados para analizar la confluencia. Se informa el nombre, la concentración inicial y final de los diferentes recubrimientos utilizados. * La concentración inicial de Matrigel es variable, dependiendo del lote.
Archivo complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El uso de iPSCs para el modelado de enfermedades y el futuro cribado de fármacos junto con su posible aplicación en medicina de precisión lo convierte en una tecnología de gran relevancia y por esta razón creemos que es necesario entender claramente la condición de cultivo in vitro que mejor se asemeja a la situación fisiológica de las células madre embrionarias. En este contexto, probamos diferentes recubrimientos ECM utilizando iPSC de tipo salvaje para comprender las condiciones que permiten que las células permanezcan en un estado saludable e indiferenciado. Además de esto, un punto crítico es el cultivo de iPSCs en componentes xenogénicos de MEFs y Matrigel que puede explicar la variabilidad experimental entre triplicados y esto dificulta la capacidad de realizar estudios mecanicistas26.
En este estudio, probamos la confluencia de las iPSC en sustratos libres de xenogénicos (es decir, LN-521, Vitronectina, Hu-fibronectina) utilizando un citómetro analizador de imágenes de alto contenido. La razón para usar el sistema automatizado de análisis de imágenes se debe al hecho de que contar células, utilizando el método de exclusión de azul de tripano requeriría hacer suspensiones de células individuales y esto no se recomienda cuando se manipulan iPSC, ya que deberían propagarse en grupos de células para evitar la muerte celular. Los datos obtenidos con el análisis de imágenes de alto contenido nos permiten seguir la confluencia celular sin perturbar las células, ya que simplemente se obtienen imágenes todos los días durante 5 días. Esta tecnología puede considerarse como el método de elección para caracterizar líneas iPSC y puede incluirse para realizar paneles de control de calidad de iPSCs humanas. Si bien utilizamos un paquete de software comercial, la metodología aquí descrita se puede utilizar con éxito mediante plataformas equivalentes de análisis de imágenes de alto contenido / alto rendimiento y paquetes de software analítico similares. Los datos obtenidos muestran que las iPSCs sembradas en LN-521 presentan una confluencia lineal durante 5 días en cultivo sin dividir las células y por lo tanto es el mejor sustrato libre de xenogénico probado en este estudio. Una limitación de este protocolo es que los resultados obtenidos deben normalizarse hasta el primer punto de tiempo para considerar las diferencias en la unión de iPSC a diferentes sustratos. Curiosamente, los datos obtenidos probablemente se deban a una mayor tasa de unión celular de iPSCs a LN-521. De hecho, al normalizar los resultados para el primer punto de tiempo, no se observa ninguna diferencia entre los diferentes sustratos.
A partir de los resultados obtenidos con el estudio, sería interesante comprender mejor la biología de las células madre pluripotentes en términos de conocer los principales receptores de superficie celular que median los contactos célula-ECM y que pueden ser responsables del mantenimiento de su capacidad de autorrenovación en lugar de la diferenciación espontánea en tipos celulares específicos. Curiosamente, hay estudios que muestran que la elasticidad de la matriz de la superficie de cultivo influyó en la diferenciación hacia diferentes tipos celulares y esto es probablemente dependiente de las interacciones célula-MEC que activaron alguna vía de señalización celular intracelular relevante para la diferenciación específica del tipo celular27. Además de esto, Vigilante et al.28 exploraron la contribución genética a los cambios en el comportamiento de iPSC, combinando enfoques computacionales con conjuntos de datos de expresión génica y biología celular. El trabajo de Vigilante et al.28 es, por lo tanto, un gran avance en el intento de mapear la variación genética a la variación fenotípica. Estos estudios pueden conducir al desarrollo de metodologías estandarizadas que se utilizarán para realizar experimentos de iPSCs a la luz de su posible uso futuro en clínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por subvenciones de la Fondazione Bambino Gesù y Ricerca Corrente (Ministerio de Salud italiano) a C.C. Nos gustaría agradecer al Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociencia, Unidad de Enfermedades Neuromusculares y Neurodegenerativas, Laboratorio de Medicina Molecular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Centro Central de Microscopía Confocal, Laboratorios de Investigación, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) y Roberta Ferretti (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) para discusiones científicas y ayuda técnica. Maria Vinci recibió una "beca para niños con cáncer del Reino Unido".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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