Summary
L'obiettivo del protocollo è confrontare diverse condizioni di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) per valutare in che modo il rivestimento differenziale influisce sul tasso di crescita delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In particolare, miriamo a creare le condizioni per ottenere una crescita ottimale delle colture iPSC.
Abstract
Questo studio si concentra sulla comprensione di come la crescita di iPSC su diversi substrati di rivestimento ECM può influenzare la confluenza cellulare. È stato stabilito un protocollo per valutare la confluenza di iPSC in tempo reale senza la necessità di contare le cellule in sospensione monocellulare per evitare qualsiasi perturbazione della crescita. Un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto è stato utilizzato per valutare la confluenza di iPCS su 4 diversi ECM nel tempo in modo automatizzato. Sono state utilizzate diverse impostazioni di analisi per valutare la confluenza cellulare di iPSC aderenti e solo una leggera differenza (a 24 e 48 ore con laminina) è stata osservata se è stata applicata una maschera al 60, 80 o 100%. Mostriamo anche che la laminina porta alla migliore confluenza rispetto a Matrigel, vitronectin e fibronectina.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono ottenute da cellule somatiche e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule. Sono spesso utilizzati come sistema per modellare la patogenesi della malattia o eseguire lo screening dei farmaci e offrono anche il potenziale per essere utilizzati nel contesto della medicina personalizzata. Poiché le iPSC hanno un grande potenziale, è importante caratterizzarle completamente per l'uso come sistema modello affidabile. In precedenza abbiamo dimostrato l'importanza della crescita di iPSC in un ambiente ipossico poiché queste cellule si basano sulla glicolisi e un ambiente aerobico può causare uno squilibrio redox1. Le iPSC sono anche vulnerabili ad altre condizioni di coltura, in particolare all'ambiente extracellulare. L'ottimizzazione delle condizioni colturali è una questione chiave per mantenerle sane e proliferanti. Una coltura iPSC sana porterà a cellule differenziate sane che generalmente sono l'endpoint del modello utilizzato per comprendere le caratteristiche molecolari, cellulari e funzionali di specifici disturbi umani o processi cellulari.
In questo studio, è stato utilizzato un semplice protocollo per testare la confluenza di iPSC utilizzando diverse condizioni di rivestimento in pozzetti separati. Le iPSC richiedono uno strato di alimentazione di fibroblasti embrionali murini (MEF) per attaccarsi correttamente, ma la coesistenza di iPSC e MEF rende difficile eseguire analisi come l'estrazione di RNA o proteine poiché sono presenti due popolazioni di cellule. Al fine di evitare lo strato di alimentazione, diverse proteine appartenenti alla matrice extracellulare (ECM) sono state utilizzate per ricreare la nicchia cellulare naturale e per avere una coltura di iPSC priva di alimentatore. In particolare, Matrigel è un preparato di membrana basale solubilizzato estratto dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), arricchito in proteine della matrice extracellulare (laminina, collagene IV, eparan solfato proteoglicani, entactin/nidogeno e fattori di crescita)2,3. Le altre condizioni di rivestimento utilizzate sono invece proteine purificate con rilevanza nota nella costruzione delle ECM: la laminina-521 è nota per essere secreta dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nella massa cellulare interna dell'embrione ed è una delle laminine più comuni nell'organismo dopo la nascita 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina è una matrice di coltura cellulare xeno-free nota per supportare la crescita e la differenziazione di hPSC 12,13,14,15,16; la fibronectina è una proteina ECM importante per lo sviluppo dei vertebrati e l'attaccamento e il mantenimento delle cellule staminali embrionali in uno stato pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Poiché sono disponibili diverse condizioni di rivestimento, le confrontiamo in termini di effetto sulla confluenza delle iPSC.
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Protocol
1. Rivestimento di 96 piastre di pozzetto
NOTA: Diversi rivestimenti sono stati testati nella stessa piastra ma pozzetti separati (vedere File supplementare).
- Diluire il Matrigel 1:100 in DMEM. Aggiungere 100 μL per pozzetto alle piastre da 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione e lavare i pozzetti con 100 μL di DMEM due volte.
- Laminina diluita (20 μg/mL, LN-521) in PBS (con calcio e magnesio). Aggiungere 100 μL nel pozzetto e incubare a 4 °C durante la notte. Il giorno seguente eseguire due lavaggi con DMEM prima di seminare le cellule.
- Vitronectina diluita (10 μg/ml) in tampone di diluizione. Aggiungere 100 μL per pozzetto alla piastra a 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i pozzetti con PBS (senza calcio e magnesio) prima di placcare le cellule.
- Diluire HU-Fibronectina (30 μg/ml) in ddH2O. Aggiungere 100 μL ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Successivamente, lavare i pozzetti con il mezzo prima di seminare le cellule.
2. Mantenimento delle iPSC in coltura
NOTA: le iPSC sono state acquistate commercialmente. Le iPSC sono state derivate da fibroblasti umani sani e riprogrammate utilizzando la tecnologia episomiale.
- Dal congelatore a -80 °C o dall'azoto liquido, scongelare le iPSC crioconservate in un bagno d'acqua a 37 °C. Pulire il flaconcino contenente le cellule con etanolo al 70% prima di spostarlo nell'armadio di sicurezza biologica.
- Aggiungere la sospensione cellulare a 5 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (ad es. mTeSR1) goccia a goccia con una pipetta da 1000 μL in un tubo conico sterile da 15 ml.
- Centrifugare le celle a 304 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il terreno e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura cellulare.
- Placcare la sospensione cellulare in due pozzetti delle 6 piastre del pozzetto (105 iPSC per piatto di coltura cellulare a 6 pozzetti), dove i fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati placcati in precedenza. MEF di semi due giorni prima della placcatura delle iPSC ad una densità di 2,4 x 104/cm2 in DMEM (contenente il 10% di siero bovino fetale, l'1% di L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina).
- Dopo la semina, integrare il terreno cellulare con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632.
- Far crescere le iPSC sui MEF per le prime 4-5 settimane e poi in condizioni di feeder free (MEF free condition), utilizzando uno dei rivestimenti di interesse (vedi step 1 e Tabella 1) in mTeSR1.
- Quando le iPSC sono confluenti al 70-80%, passare 1:4 usando il trattamento EDTA da 0,5 mM per 3-5 minuti a RT. Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA per una piastra a 6 pozzetti (o quantità proporzionali per altri tipi di piastre). Trasferimento in nuovi pozzi in condizioni di assenza di alimentazione e incubazione a 37 °C, 5% CO2, 20% O2.
- Cambiare il supporto con mTeSR1 fresco ogni giorno e dividere le celle ogni 2 giorni.
3. Caratterizzazione della confluenza cellulare
- Utilizzare 96 piastre per pozzetti per gli esperimenti.
- Seminare 10.000 cellule per pozzetto dopo almeno 1 mese di coltura in condizioni di feeder free per essere sicuri che i MEF non siano stati passati. Utilizzare vetrini di conteggio usa e getta per contare le cellule con il microscopio ottico.
- Eseguire gli esperimenti in triplice copia. Pertanto, testare ogni condizione di semina in tre pozzi.
- Eseguire l'acquisizione automatica delle immagini dal giorno 1 successivo alla semina utilizzando un citometro in modalità campo chiaro. Esegui l'acquisizione automatica delle immagini ogni 24 ore per 5 giorni. Per informazioni dettagliate sui parametri sperimentali, fare riferimento al file supplementare.
- Usa il contrasto automatico e l'esposizione automatica per visualizzare meglio le celle.
- Impostare l'impostazione di analisi (vedere File supplementare) per l'analisi di confluenza per applicare una maschera del 60%, 80% e 100% per pozzetto, al fine di valutare i cambiamenti di messa a fuoco dovuti alla rifrazione della luce al bordo dei pozzi. Utilizzare la diversa impostazione di analisi della maschera menzionata sopra per analizzare la confluenza della cella in ogni punto temporale.
4. Analisi statistiche
- Riportare i risultati quantitativi come mezzi ± errore standard della media (SEM).
- Per confrontare le differenze complessive delle diverse condizioni di rivestimento, ottenere dati utilizzando gli stessi campioni ed eseguire il test t del campione accoppiato dello studente. I valori di p inferiori a 0,05 sono considerati statisticamente significativi e tutti i valori p riportati sono a due facce.
5. Caratterizzazione dei microfilamenti citoscheletrici
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (4% PFA) in PBS per 10 minuti a RT, seguito da due lavaggi in PBS (10 minuti totali).
- Aggiungere 100 μL di soluzione bloccante (composta da 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) a ciascun pozzetto per 1 ora a RT.
- Rimuovere la soluzione bloccante e lavare i campioni due volte con PBS per 10 minuti.
- Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro coniugata alla falloidina per campione e incubare per 1 ora a RT.
- Lavare le celle due volte con PBS (10 minuti a RT).
- Nuclei di colorazione con Hoechst 33342 diluito 1:10000 in PBS per 10 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione di Hoechst e lavare le celle due volte con PBS per 10 minuti ogni volta.
- Lavare il campione con H2O e lasciare asciugare sotto un cappuccio chimico.
- Aggiungere 100 μL di mezzi di montaggio (cioè PBS:glicerolo, 1:1) per coprire le cellule e preservare la fluorescenza dei campioni.
- Osservare la cella a Ex/Em 493/517 nm su un microscopio confocale a scansione laser dotato di una sorgente laser a luce bianca (WLL) e di un laser a diodi da 405 nm. Acquisisci immagini confocali sequenziali utilizzando un obiettivo HC PLAPO 40x ad immersione in olio. Utilizzare la stessa potenza laser, gli stessi beam splitter, le impostazioni del filtro, i diametri stenopeici e la modalità di scansione per tutti i campioni esaminati.
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Representative Results
In questo studio, abbiamo studiato la confluenza delle iPSC quando coltivate in diverse condizioni di rivestimento. Utilizzando un citometro, siamo stati in grado di ottenere risultati prontamente informativi in triplice copia in 5 giorni. Poiché le iPSC difficilmente si attaccano ai vasi di plastica ed è necessario un rivestimento per supportare la loro proliferazione, abbiamo deciso di monitorare la confluenza delle iPSC umane in quanto è indicativa della salute della coltura cellulare e potrebbe riflettersi sul loro potenziale di differenziazione. Dopo l'espansione in vitro, abbiamo seminato le iPSC su diversi substrati di ECM e analizzato le cellule osservando le immagini campione acquisite in campo chiaro e utilizzando la colorazione con falloidina (utilizzata per colorare i filamenti di actina, nota anche come F-actina) al fine di comprendere la loro adesione ai vasi (Figura 1). Infatti, la colorazione della falloidina permette di visualizzare il grado di adesione cellulare alla superficie del vaso e quindi al rivestimento specifico utilizzato per il vaso. Le cellule aderenti al rivestimento hanno mostrato microfilamenti citoscheletrici chiaramente visibili invece di microfilamenti collassati. L'osservazione del campo luminoso in combinazione con la colorazione della falloidina documenta un buon livello di adesione delle iPSC alla superficie rivestita.
Per studiare la confluenza, abbiamo seminato le iPSC con Matrigel, LN-521, vitronectina e Hu-fibronectina in triplice copia ed eseguito l'esperimento tre volte. Al fine di evitare la rifrazione della luce dovuta al bordo del pozzo, abbiamo applicato tre tipi di impostazione di analisi con una maschera del 60, 80 e 100% e abbiamo osservato che sono simili nel raccogliere le celle ed evitare lo sfondo (Figura 2). I risultati ottenuti mostrano che le iPSC seminate su LN-521 mostrano un alto tasso di proliferazione cellulare in modo lineare nel tempo, confrontandolo con gli altri rivestimenti e che queste differenze sono statisticamente significative (asterischi in Figura 3A-C). Le cellule seminate su Matrigel, Vitronectin o Hu-Fibronectin mostrano un tasso di proliferazione lineare nelle prime 96 ore, ma mostrano anche una maggiore pendenza della curva di confluenza nelle ultime 24 ore (indipendentemente dalla maschera utilizzata, 60%, 80% o 100%, Figura 3A-C). Poiché la differenza iniziale a 24 h per i diversi rivestimenti può essere dovuta a differenze nell'attacco cellulare, la crescita cellulare è stata normalizzata alle 24 ore per i punti temporali successivi (da 48 a 120 ore) (Figura 3D-F). I grafici ottenuti utilizzando la maschera 60, 80 e 100% mostrano che non esistono differenze in termini di confluenza tra i diversi rivestimenti e che le differenze osservate con LN-521 sono molto probabilmente dovute ad una maggiore capacità delle iPSC di aderire a questo rivestimento quando vengono passate.
Figura 1. Immagini rappresentative in campo chiaro e colorazione con falloidina di iPSC seminate su diversi rivestimenti ECM dopo 3 giorni. Immagini in campo chiaro che mostrano che le cellule sono sane sul rivestimento utilizzato e che sono ben attaccate ai vasi come documentato dalla colorazione falloidina che mostra microfilamenti citoscheletrici chiaramente visibili. Barra scala: 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Immagini rappresentative a campo chiaro che mostrano tre diverse impostazioni di analisi per le maschere utilizzate per eseguire analisi di confluenza. Mosaico ottenuto con un citometro utilizzando immagini in campo chiaro (16 immagini/pozzetto da una piastra a 96 pozzetti). In verde la segmentazione dell'analisi mostra chiaramente la diversa maschera applicata (60, 80 100%) per evitare o includere il bordo arrotondato del pozzo. Barra scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Analisi della confluenza cellulare di iPSC seminate su vasi diversamente rivestiti. Grafico che rappresenta la confluenza cellulare di iPSC seminate su vasi con rivestimento diverso. I dati sono stati analizzati dopo l'acquisizione con il software appropriato utilizzando una maschera (A) 60% (B) 80% (C) 100% per 5 giorni (120 h). La normalizzazione della confluenza dei punti temporali da 48 h a 120 h al primo punto temporale (24 h) è mostrata in (D, E, F). I dati sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti. I dati sono rappresentati come media ± SEM. n = 3 * p<0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composto di rivestimento | Concentrazione iniziale | Concentrazione finale |
| HU-Fibronectina | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 μg/ml | 20 μg/mL |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectina XF | 250 μg/ml | 10 μg/mL |
Tabella 1. Elenco dei composti di rivestimento utilizzati per analizzare la confluenza. Sono riportati il nome, la concentrazione iniziale e finale dei diversi rivestimenti utilizzati. * La concentrazione iniziale di Matrigel è variabile, a seconda del lotto.
File supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'utilizzo delle iPSC per la modellizzazione delle malattie e il futuro screening farmacologico insieme alla loro possibile applicazione in medicina di precisione la rende una tecnologia di grande rilevanza e per questo motivo riteniamo che sia necessario comprendere chiaramente la condizione di coltura in vitro che meglio assomiglia alla situazione fisiologica delle cellule staminali embrionali. In questo contesto, abbiamo testato diversi rivestimenti ECM utilizzando iPSC wild type al fine di comprendere le condizioni che consentono alle cellule di rimanere in uno stato sano e indifferenziato. Oltre a questo, un punto critico è la coltura di iPSCs in componenti xenogenici di MEF e Matrigel che può spiegare la variabilità sperimentale tra i triplicati e questo ostacola la capacità di eseguire studi meccanicistici26.
In questo studio, abbiamo testato la confluenza delle iPSC su substrati privi di xenogenici (cioè LN-521, Vitronectina, Hu-Fibronectina) utilizzando un citometro analizzatore di immagini ad alto contenuto. La ragione per utilizzare il sistema automatizzato di analisi delle immagini è dovuta al fatto che il conteggio delle celle, utilizzando il metodo di esclusione del blu di Trypan, richiederebbe di effettuare sospensioni a singola cellula e questo non è raccomandato quando si manipolano le iPSC in quanto dovrebbero essere propagate in cluster di cellule per evitare la morte cellulare. I dati ottenuti con l'analisi delle immagini ad alto contenuto ci consentono di seguire la confluenza cellulare senza perturbare le cellule poiché vengono semplicemente visualizzate ogni giorno per 5 giorni. Questa tecnologia può essere considerata come il metodo di elezione per caratterizzare le linee iPSC e può essere inclusa per eseguire pannelli di controllo qualità di iPSC umane. Mentre abbiamo utilizzato un pacchetto software commerciale, la metodologia qui descritta può essere utilizzata con successo per mezzo di piattaforme equivalenti di analisi delle immagini ad alto contenuto / ad alto throughput e pacchetti software analitici simili. I dati ottenuti mostrano che le iPSC seminate su LN-521 presentano una confluenza lineare durante 5 giorni in coltura senza scindere le cellule ed è quindi il miglior substrato privo di xenogenici testato in questo studio. Una limitazione di questo protocollo è che i risultati ottenuti devono essere normalizzati al primo punto temporale per considerare le differenze nell'attaccamento delle iPSC a diversi substrati. È interessante notare che i dati ottenuti sono probabilmente guidati da un aumento del tasso di attaccamento cellulare delle iPSC a LN-521. Infatti, quando si normalizzano i risultati per il primo punto temporale, non si osserva alcuna differenza tra i diversi substrati.
Sulla base dei risultati ottenuti con lo studio, sarebbe interessante comprendere meglio la biologia delle cellule staminali pluripotenti in termini di conoscenza dei principali recettori di superficie cellulare che mediano i contatti cellula-ECM e che possono essere responsabili del mantenimento della loro capacità di auto-rinnovamento piuttosto che della differenziazione spontanea in specifici tipi cellulari. È interessante notare che ci sono studi che dimostrano che l'elasticità della matrice della superficie di coltura ha influenzato la differenziazione verso diversi tipi cellulari e questo dipende probabilmente dalle interazioni cellula-ECM che hanno attivato alcune vie di segnalazione cellulare intracellulari rilevanti per la differenziazione specifica del tipo di cellula27. Oltre a questo, Vigilante et al.28 hanno esplorato il contributo genetico ai cambiamenti nel comportamento iPSC, combinando approcci computazionali con l'espressione genica e set di dati di biologia cellulare. Il lavoro di Vigilante et al.28 è, quindi, un importante progresso nel tentativo di mappare la variazione genetica alla variazione fenotipica. Questi studi possono portare allo sviluppo di metodologie standardizzate da utilizzare per eseguire esperimenti di iPSC alla luce del loro futuro possibile utilizzo in clinica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente a C.C. Si ringraziano il Dott. Enrico Bertini (Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Malattie Neuromuscolari e Neurodegenerative, Laboratorio di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), la Dott.ssa Stefania Petrini (Centro di Microscopia Confocale, Laboratori di Ricerca, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale di Ricerca Pediatrica Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù) per le discussioni scientifiche e l'assistenza tecnica. Maria Vinci è destinataria di una borsa di studio "Children with Cancer UK".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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