Summary
Målet med protokollen er at sammenligne forskellige ekstracellulære matrix (ECM) belægningsbetingelser for at vurdere, hvordan differentiel belægning påvirker væksthastigheden for inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Vi sigter især mod at skabe betingelser for at opnå optimal vækst af iPSC-kulturer.
Abstract
Denne undersøgelse fokuserer på at forstå, hvordan voksende iPSC'er på forskellige ECM-belægningssubstrater kan påvirke cellesammenløbet. En protokol til vurdering af iPSC-sammenløb i realtid er blevet etableret uden behov for at tælle celler i enkeltcellesuspension for at undgå vækstforstyrrelser. Et billedanalysesystem med højt indhold blev brugt til at vurdere iPCS-sammenløb på 4 forskellige ECM'er over tid på en automatiseret måde. Forskellige analyseindstillinger blev brugt til at vurdere cellesammenløbet af vedhæftede iPSC'er, og kun en lille forskel (ved 24 og 48 timer med laminin) er blevet observeret, om en 60, 80 eller 100% maske blev påført. Vi viser også, at laminin fører til den bedste sammenløb sammenlignet med Matrigel, vitronectin og fibronectin.
Introduction
Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) opnås fra somatiske celler og kan differentieres i forskellige celletyper. De bruges ofte som et system til at modellere sygdomspatogenese eller udføre lægemiddelscreening og tilbyder også potentialet til at blive brugt i forbindelse med personlig medicin. Da iPSC'er har stort potentiale, er det vigtigt at karakterisere dem fuldt ud til brug som et pålideligt modelsystem. Vi har tidligere vist vigtigheden af at dyrke iPSC'er i et hypoxisk miljø, da disse celler er afhængige af glykolyse, og et aerobt miljø kan forårsage redox ubalance1. iPSC'er er også sårbare over for andre kulturforhold, især det ekstracellulære miljø. Optimering af kulturforhold er et centralt spørgsmål for at holde dem sunde og udbredte. En sund iPSC-kultur vil føre til sunde differentierede celler, der generelt er endepunktet for den model, der bruges til at forstå molekylære, cellulære og funktionelle træk ved specifikke menneskelige lidelser eller cellulære processer.
I denne undersøgelse er en simpel protokol blevet brugt til at teste sammenløbet af iPSC'er ved hjælp af forskellige belægningsforhold i separate brønde. iPSC'er kræver et feederlag af murine embryonale fibroblaster (MEF) for at kunne fastgøres korrekt, men sameksistensen af iPSC'er og MEF gør det vanskeligt at udføre analyse som RNA- eller proteinekstraktion, da to populationer af celler er til stede. For at undgå feederlaget er forskellige proteiner, der tilhører den ekstracellulære matrix (ECM), blevet brugt til at genskabe den naturlige celleniche og til at have feederfri iPSC-kultur. Matrigel er især et opløseligt kældermembranpræparat ekstraheret fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) musesarkom, som er beriget med ekstracellulære matrixproteiner (dvs. laminin, kollagen IV, heparansulfatproteoglycaner, entactin / nidogen og vækstfaktorer)2,3. De andre anvendte belægningsbetingelser er i stedet oprensede proteiner med kendt relevans i opbygningen af ECM'erne: laminin-521 vides at blive udskilt af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) i embryoets indre cellemasse, og det er en af de mest almindelige lamininer i kroppen efter fødslen 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectin er en xeno-fri cellekulturmatrix, der vides at understøtte vækst og differentiering af hPSC 12,13,14,15,16; fibronectin er et ECM-protein, der er vigtigt for hvirveldyrs udvikling og vedhæftning og vedligeholdelse af embryonale stamceller i en pluripotent tilstand 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Da der findes forskellige belægningsbetingelser, sammenligner vi dem med hensyn til deres virkning på iPSC'ernes sammenløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Belægning af 96 brøndplader
BEMÆRK: Forskellige belægninger blev testet i samme plade, men separate brønde (se supplerende fil).
- Fortynd Matrigel 1:100 i DMEM. Der tilsættes 100 μL pr. brønd til de 96 brøndplader og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Herefter fjernes opløsningen og brøndene vaskes med 100 μL DMEM to gange.
- Fortyndet laminin (20 μg/ml, LN-521) i PBS (med calcium og magnesium). Der tilsættes 100 μL til brønden, og der inkuberes ved 4 °C natten over. Den følgende dag udføres to vaske med DMEM, før cellerne sås.
- Fortyndet vitronectin (10 μg/ml) i fortyndingsbuffer. Der tilsættes 100 μL pr. brønd til 96-brøndpladen og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask brøndene med PBS (uden calcium og magnesium), inden cellerne pletteres.
- Fortynd HU-Fibronectin (30 μg/ml) i ddH2O. Tilsæt 100 μL til brøndene og inkuberes ved stuetemperatur i 45 minutter. Efter dette vaskes brøndene med mediet, inden cellerne sås.
2. Opretholdelse af iPSC'er i kulturen
BEMÆRK: iPSC'er blev købt kommercielt. IPSC'erne blev afledt af sunde humane fibroblaster og omprogrammeret ved hjælp af episomal teknologi.
- Fra -80 °C fryseren eller flydende nitrogen optøes de kryopræserverede iPSC'er i et 37 °C vandbad. Rengør hætteglasset, der indeholder cellerne, med 70% ethanol, inden det flyttes ind i det biologiske sikkerhedsskab.
- Tilsæt cellesuspensionen til 5 ml forvarmet cellekulturmedie (f.eks. mTeSR1) dråbe for dråbe med en 1000 μL pipette i et 15 ml sterilt konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 304 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern mediet, og suspender cellepelleten i 4 ml cellekulturmedium.
- Cellesuspensionen hældes i to brønde af de 6 brøndplader (105 iPSC'er pr. 6-brønds cellekulturskål), hvor musens embryonale fibroblaster (MEF'er) tidligere er blevet belagt. Frø MEF'er to dage før plettering af iPSC'er med en densitet på 2,4 x 104/cm2 i DMEM (indeholdende 10% føtalt kvægserum, 1% L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin).
- Efter såning suppleres cellemediet med 10 μM ROCK-hæmmer Y-27632.
- Dyrk iPSC'erne på MEF'er i de første 4-5 uger og derefter i feederfri tilstand (MEF-fri tilstand) ved hjælp af en af belægningerne af interesse (se trin 1 og tabel 1) i mTeSR1.
- Når iPSC'erne er 70-80% sammenflydende, passage 1: 4 ved hjælp af 0,5 mM EDTA-behandling i 3-5 minutter ved RT. Tilsæt 1 ml 0,5 mM EDTA til en 6-brøndplade (eller proportionale mængder for andre typer plader). Overfør til nye brønde under fødefri forhold og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2, 20 %O2.
- Skift mediet med frisk mTeSR1 hver dag og opdel cellerne hver 2. dag.
3. Karakterisering af cellesammenløb
- Brug 96 brøndplader til forsøgene.
- Frø 10.000 celler pr. brønd efter mindst 1 måneds dyrkning i feederfri tilstand for at være sikker på, at MEF'erne ikke blev passeret. Brug engangstællingsdias til at tælle cellerne med det optiske mikroskop.
- Udfør eksperimenterne i tre eksemplarer. Test derfor hver såningstilstand i tre brønde.
- Udfør automatiseret billedoptagelse fra dag 1 efter såning ved hjælp af et cytometer i lysfelttilstand. Udfør automatiseret billedoptagelse hver 24. time i 5 dage. For detaljerede oplysninger om de eksperimentelle parametre henvises til den supplerende fil.
- Brug automatisk kontrast og automatisk eksponering for bedre at visualisere celler.
- Indstil analyseindstillingen (se Supplerende fil) for sammenløbsanalyse til at anvende en maske på 60%, 80% og 100% pr. Brønd for at evaluere ændringerne i fokus på grund af lysbrydningen ved kanten af brøndene. Brug den forskellige maskeanalyseindstilling, der er nævnt ovenfor, til at analysere cellesammenløbet på hvert tidspunkt.
4. Statistiske analyser
- Rapporter kvantitative resultater som middel ± standardfejl i middelværdien (SEM).
- For at sammenligne overordnede forskelle i de forskellige belægningsbetingelser skal du indhente data ved hjælp af de samme prøver og udføre den studerendes parrede prøve t-test. P-værdier mindre end 0,05 betragtes som statistisk signifikante, og alle rapporterede p-værdier er tosidede.
5. Karakterisering af cytoskeletale mikrofilamenter
- Fix celler med 4% paraformaldehyd (4% PFA) i PBS i 10 min ved RT, efterfulgt af to vaske i PBS (10 min i alt).
- Der tilsættes 100 μL blokerende opløsning (sammensat af 5 % BSA, 0,1 % Triton i PBS) til hver brønd i 1 time ved RT.
- Fjern blokeringsopløsningen, og prøverne vaskes to gange med PBS i 10 min.
- Der tilsættes 100 μL af den phalloidinkonjugerede arbejdsopløsning pr. prøve og inkuberes i 1 time ved RT.
- Vask celler to gange med PBS (10 min ved RT).
- Pletkerner med Hoechst 33342 fortyndet 1:10000 i PBS i 10 minutter ved RT.
- Hoechst-opløsningen udtages, og cellerne vaskes to gange med PBS i 10 minutter hver gang.
- Prøven vaskes med H2O, og den tørres under en kemikaliehætte.
- Der tilsættes 100 μL monteringsmedier (dvs. PBS:glycerol, 1:1) for at dække cellerne og bevare fluorescensen af prøverne.
- Overhold celle ved Ex/Em 493/517 nm på et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med en WLL-kilde (White Light Laser) og en 405 nm diodelaser. Få sekventielle konfokale billeder ved hjælp af et HC PLAPO 40x olienedsænkningsmål. Brug den samme lasereffekt, strålesplittere, filterindstillinger, pinhole-diametre og scanningstilstand til alle undersøgte prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse undersøgte vi sammenløbet af iPSC'er, når de dyrkes under forskellige belægningsforhold. Ved hjælp af et cytometer var vi i stand til at opnå let informative resultater i tredoblinger på 5 dage. Da iPSC'er næppe fastgøres til plastbeholdere, og en belægning er nødvendig for at understøtte deres spredning, besluttede vi at overvåge sammenløbet af humane iPSC'er, da det er tegn på cellekulturens sundhed, og det kan afspejle deres differentieringspotentiale. Efter in vitro-ekspansion såede vi iPSC'erne på forskellige ECM-substrater og analyserede celler ved observation af prøvebillederne erhvervet i lysfelt og ved hjælp af phalloidinfarvning (bruges til farvning af actinfilamenter, også kendt som F-actin) for at forstå deres vedhæftning til karrene (figur 1). Faktisk tillader phalloidinfarvning visualisering af graden af celleadhæsion til beholderens overflade og derfor til den specifikke belægning, der anvendes til karret. Celler, der klæber til belægningen, viste tydeligt synlige cytoskeletale mikrofilamenter i stedet for kollapsede mikrofilamenter. Observationen af brightfield i kombination med phalloidinfarvning dokumenterer et godt vedhæftningsniveau af iPSC'erne til den belagte overflade.
For at undersøge sammenløbet såede vi iPSC'erne med Matrigel, LN-521, vitronectin og Hu-fibronectin i tre eksemplarer og udførte eksperimentet tre gange. For at undgå lysbrydning på grund af brøndens kant anvendte vi tre typer analyseindstillinger med en maske på 60, 80 og 100% og observerede, at de er ens i at plukke cellerne og undgå baggrunden (figur 2). De opnåede resultater viser, at iPSC'er sået på LN-521 viser en høj celleproliferation lineært over tid, når man sammenligner den med de andre belægninger, og at disse forskelle er statistisk signifikante (stjerner i figur 3A-C). Celler podet på Matrigel, Vitronectin eller Hu-Fibronectin viser en lineær proliferationshastighed i de første 96 timer, men de viser også en øget hældning af sammenløbskurven i de sidste 24 timer (uafhængigt af den anvendte maske, 60%, 80% eller 100%, figur 3A-C). Da den oprindelige forskel ved 24 timer for de forskellige belægninger kan skyldes forskelle i cellebinding, er cellevæksten blevet normaliseret til 24 timer for de senere tidspunkter (fra 48 til 120 timer) (figur 3D-F). De grafer, der er opnået ved hjælp af 60, 80 og 100% masken, viser, at der ikke er nogen forskelle med hensyn til sammenløb mellem de forskellige belægninger, og at de forskelle, der observeres med LN-521, sandsynligvis skyldes en øget evne hos iPSC'erne til at klæbe til denne belægning, når de passeres.
Figur 1. Repræsentative lysfeltbilleder og Phalloidin-farvning af iPSC'er podet på forskellige ECM-belægninger efter 3 dage. Lysfeltbilleder, der viser, at cellerne er sunde på den anvendte belægning, og at de er godt fastgjort til karrene som dokumenteret af fallosoidinfarvningen, der viser tydeligt synlige cytoskeletale mikrofilamenter. Skala bar: 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Repræsentative lysfeltbilleder, der viser tre forskellige analyseindstillinger for de masker, der bruges til at udføre sammenløbsanalyser. Mosaik opnået med et cytometer ved hjælp af lysfeltbilleder (16 billeder / brønd fra en 96 brøndplade). I grønt viser analysesegmenteringen tydeligt den forskellige maske, der påføres (60, 80 100%) for at undgå eller inkludere brøndens runde kant. Skala bar: 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Cellesammenløbsanalyse af iPSC'er sået på forskelligt belagte kar. Graf repræsenterer cellesammenløbet af iPSC'er sået på forskelligt belagte kar. Data blev analyseret efter erhvervelse med den relevante software ved hjælp af en (A) 60% maske (B) 80% (C) 100% i 5 dage (120 timer). Normalisering af sammenløbet af tidspunkterne 48 timer til 120 timer til det første tidspunkt (24 timer) er vist i (D, E, F). Dataene blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter. Data repræsenteres som gennemsnit ± SEM. n= 3 * p<0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Belægningsforbindelse | Oprindelig koncentration | Endelig koncentration |
| HU-Fibronectin | 1 mg/ml | 10 μg/cm2 |
| Laminin 521 | 100 μg/ml | 20 μg/ml |
| Matrigel | * | 0.111111111 |
| Vitronectin XF | 250 μg/ml | 10 μg/ml |
Tabel 1. Liste over belægningsforbindelser, der bruges til at analysere sammenløbet. Navn, indledende og endelig koncentration af forskellige anvendte belægninger rapporteres. * Den oprindelige koncentration af Matrigel er variabel afhængigt af batchen.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af iPSC'er til sygdomsmodellering og fremtidig lægemiddelscreening sammen med deres mulige anvendelse i præcisionsmedicin gør det til en teknologi af stor relevans, og derfor mener vi, at det er nødvendigt klart at forstå in vitro-dyrkningstilstanden, der bedre ligner den fysiologiske situation for embryonale stamceller. I denne sammenhæng testede vi forskellige ECM-belægninger ved hjælp af vildtype iPSC'er for at forstå de forhold, der gør det muligt for cellerne at forblive i en sund og udifferentieret tilstand. Derudover er et kritisk punkt dyrkning af iPSC'er i xenogene komponenter i MEF'er og Matrigel, der kan forklare den eksperimentelle variabilitet blandt triplikater, og dette hindrer evnen til at udføre mekanistiske undersøgelser26.
I denne undersøgelse testede vi iPSC'ernes sammenløb på xenogene-frie substrater (dvs. LN-521, Vitronectin, Hu-Fibronectin) ved hjælp af et billedanalysatorcytometer med højt indhold. Årsagen til at bruge det automatiserede billedanalysesystem skyldes, at tælling af celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelsesmetode ville kræve at lave enkeltcellesuspensioner, og dette anbefales ikke, når man manipulerer iPSC'er, da de skal formeres i celleklynger for at undgå celledød. De data, der opnås med billedanalysen med højt indhold, giver os mulighed for at følge cellesammenløb uden at forstyrre celler, da de simpelthen afbildes hver dag i 5 dage. Denne teknologi kan betragtes som valgmetoden til at karakterisere iPSC-linjer, og den kan inkluderes til at udføre kvalitetskontrolpaneler af menneskelige iPSC'er. Mens vi brugte en kommerciel softwarepakke, kan den her beskrevne metode med succes bruges ved hjælp af ækvivalente billedanalyseplatforme med højt indhold / høj kapacitet og lignende analytiske softwarepakker. De opnåede data viser, at iPSC'erne podet på LN-521 præsenterer en lineær sammenløb i løbet af 5 dage i kultur uden at splitte cellerne og er derfor det bedste xenogene-frie substrat, der er testet i denne undersøgelse. En begrænsning af denne protokol er, at de opnåede resultater skal normaliseres til første gangpunkt for at overveje forskelle i iPSC-fastgørelse til forskellige substrater. Interessant nok er de opnåede data sandsynligvis drevet af en øget cellefastgørelseshastighed for iPSC'er til LN-521. Faktisk, når man normaliserer resultaterne for første gang, observeres der ingen forskel mellem de forskellige substrater.
Baseret på resultaterne opnået med undersøgelsen ville det være interessant at bedre forstå biologien af pluripotente stamceller med hensyn til at kende de vigtigste celleoverfladereceptorer, der formidler celle-ECM-kontakter, og som kan være ansvarlige for vedligeholdelsen af deres selvfornyelsesevne snarere end spontan differentiering i specifikke celletyper. Interessant nok er der undersøgelser, der viser, at kulturoverfladens matrixelasticitet påvirkede differentieringen mod forskellige celletyper, og dette er sandsynligvis afhængigt af celle-ECM-interaktionerne, der aktiverede en intracellulær cellesignalvej, der var relevant for celletypespecifik differentiering27. Ud over dette udforskede Vigilante et al.28 det genetiske bidrag til ændringer i iPSC-adfærd ved at kombinere beregningsmetoder med genekspression og cellebiologiske datasæt. Arbejdet af Vigilante et al.28 er derfor et stort fremskridt i forsøget på at kortlægge genetisk variation til fænotypisk variation. Disse undersøgelser kan føre til udvikling af standardiserede metoder, der skal anvendes til at udføre iPSC-eksperimenter i lyset af deres fremtidige mulige anvendelse i klinikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra Fondazione Bambino Gesù og Ricerca Corrente (det italienske sundhedsministerium) til C.C. Vi vil gerne takke Dr. Enrico Bertini (Institut for Neurovidenskab, Enhed for Neuromuskulære og Neurodegenerative Sygdomme, Laboratorium for Molekylær Medicin, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Dr. Stefania Petrini (Confocal Microscopy Core Facility, Research Laboratories, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Giulia Pericoli (Institut for Onco-hæmatologi, Gen- og Celleterapi, Børneforskningshospital Bambino Gesù) og Roberta Ferretti (Institut for Onco-hæmatologi, Gen- og Celleterapi, Children's Research Hospital Bambino Gesù) for videnskabelige diskussioner og teknisk hjælp. Maria Vinci er modtager af et "Children with Cancer UK fellowship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
