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Neuroscience

ड्रोसोफिला लार्वा का उपयोग करके थर्मोजेनेटिक न्यूरोनल स्क्रीन में मैक्रोन्यूट्रिएंट्स सेवन का मात्राकरण

Published: June 11, 2020 doi: 10.3791/61323
Automatic Translation
1,2, *2, *1
1School of Biological Sciences, Monash University, 2Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa (ITQB NOVA)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल है जो विभिन्न मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के आहार के संपर्क में ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर लार्वा द्वारा निर्धारित अंतराल के भीतर खाए गए भोजन की मात्रा के रंगीन मात्राकरण को सक्षम बनाता है। ये परख एक न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक स्क्रीन के संदर्भ में आयोजित की जाती है।

Abstract

फोर्जिंग और भोजन व्यवहार जानवरों को उनके विकास, स्वास्थ्य और फिटनेस के लिए आवश्यक ऊर्जा और पोषक तत्वों के स्रोतों तक पहुंचने की अनुमति देते हैं। इन व्यवहारों के न्यूरोनल विनियमन की जांच करना शारीरिक और आणविक तंत्र की समझ के लिए आवश्यक है जो पोषण हो्योस्टेसिस अंतर्निहित है। आनुवंशिक रूप से ट्रैक करने योग्य पशु मॉडल जैसे कीड़े, मक्खियों और मछली का उपयोग इस प्रकार के अध्ययनों की सुविधा प्रदान करता है। पिछले दशक में, फल फ्लाई ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर को न्यूरोबायोलॉजिस्ट द्वारा एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो भोजन और फोर्जिंग व्यवहार के न्यूरोनल नियंत्रण की जांच कर रहे हैं। जबकि निस्संदेह मूल्यवान, अधिकांश अध्ययन वयस्क मक्खियों की जांच करते हैं। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो सरल लार्वा तंत्रिका तंत्र का लाभ उठाता है ताकि लार्वा को उनके प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट सामग्री में भिन्न आहार के संपर्क में आने पर खिलाने वाले व्यवहार को नियंत्रित करने वाले न्यूरोनल सब्सट्रेट्स की जांच की जा सके। हमारे तरीके एक मात्रात्मक रंग-मथर्मेट्रिक नो-चॉइस फीडिंग परख पर आधारित हैं, जो न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक-एक्टिवेशन स्क्रीन के संदर्भ में किया जाता है। एक पढ़ने के रूप में, एक 1 घंटे के अंतराल पर लार्वा द्वारा खाए गए भोजन की मात्रा का उपयोग तीन डाई-लेबल वाले आहार में से एक के संपर्क में आने पर किया जाता था जो उनके प्रोटीन में कार्बोहाइड्रेट (पी:सी) अनुपात में भिन्न होता है। इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता को विभिन्न मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के आहार में खाए गए भोजन की मात्रा को विनियमित करने वाले उम्मीदवार न्यूरोनल आबादी की पहचान करके लार्वा ड्रोसोफिलामें एक न्यूरोजेनेटिक स्क्रीन के संदर्भ में प्रदर्शित किया जाता है। हम फेनोटाइपिक कक्षाओं में परीक्षण किए गए जीनोटाइप को वर्गीकृत और समूहित करने में भी सक्षम थे। साहित्य में वर्तमान में उपलब्ध तरीकों की संक्षिप्त समीक्षा के अलावा, इन तरीकों के फायदों और सीमाओं पर चर्चा की जाती है और साथ ही, इस प्रोटोकॉल को अन्य विशिष्ट प्रयोगों के अनुकूल कैसे बनाया जा सकता है, इसके बारे में कुछ सुझाव दिए जाते हैं ।

Introduction

सभी जानवर जीवित रहने, विकास और प्रजनन के लिए आवश्यक मात्रा में पोषक तत्व प्राप्त करने के लिए संतुलित आहार पर निर्भर करते हैं1। क्या और कितना खाने के लिए का चुनाव जानवर की आंतरिक स्थिति से संबंधित बातचीत कारकों की एक भीड़ से प्रभावित होता है, जैसे तृप्ति स्तर, और पर्यावरण की स्थिति, जैसे खाद्य गुणवत्ता2,3,4,5। प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट दो प्रमुख मैक्रोन्यूट्रिएंट्स हैं और जानवरों की शारीरिक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए इसका संतुलित सेवन आवश्यक है। इसलिए, तंत्रिका तंत्र की समझ खिला व्यवहार को नियंत्रित करने और इन मैक्रोन्यूट्रिएंट्स के संतुलित सेवन को बनाए रखने के लिए बेहद प्रासंगिक है। इसका कारण यह है कि जीवन इतिहास के लक्षण जैसे जीवन, मलन्दि और मेटाबॉलिक स्वास्थ्य प्रोटीन के सेवन के स्तर से सीधे प्रभावित होते हैं6,7,8,9,10।

स्तनधारियों सहित जटिल जानवरों के साथ विकासवादी रूप से संरक्षित भोजन की आदतों को प्रदर्शित करने वाले सरल अधिक पथिक जीवों का उपयोग इस प्रकार के अध्ययनों के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण बात, इन सरल पशु मॉडल एक अच्छा एक महंगा, नैतिकता की दृष्टि से और तकनीकी रूप से अधिक प्रभावी संदर्भ में जटिल जैविक सवालों विच्छेदन करने का अवसर प्रदान करते हैं । पिछले दशकों में, ड्रोसोफिला,अपने शक्तिशाली आनुवंशिक टूलकिट, जटिल और टकसाली व्यवहार और स्तनधारियों के साथ परिधीय और पोषक तत्वों को संवेदन तंत्र की संरक्षित वास्तुकला के साथ, व्यवहार न्यूरोबायोलॉजिस्ट11के लिए एक उपयोगी मॉडल रहा है। अंततः, आशा है कि कैसे भोजन का सेवन इस जानवर में विनियमित है समझ से, एक सरल तंत्रिका तंत्र के साथ, हम तो मानव भोजन विकारों अंतर्निहित तंत्रिका कुकृत्यों को सुलझाना शुरू कर सकते हैं ।

भोजन व्यवहार के लिए न्यूरोनल सब्सट्रेट्स का अध्ययन उनकी न्यूरोनल गतिविधि में हेरफेर करते हुए जानवरों के भोजन के सेवन को एक साथ मापने में सक्षम होने पर गहरा निर्भर है। भोजन की न्यूनतम मात्रा के कारण, मक्खियों द्वारा खाए गए भोजन की मात्रा की मात्रा बेहद चुनौतीपूर्ण है, और वर्तमान में उपलब्ध सभी तरीके महत्वपूर्ण सीमाएं मौजूद हैं। इस प्रकार, सोने के मानक पूरक पद्धतियों का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए है12. वयस्क मक्खियों को ऐतिहासिक रूप से एक आनुवंशिक और व्यवहार मॉडल के रूप में इष्ट किया गया है। फिर भी, ड्रोसोफिला लार्वा, न्यूरोनल सब्सट्रेट्स एन्कोडिंग फीडिंग व्यवहार की जांच करने के अवसर भी प्रदान करते हैं। लगभग 12,000 न्यूरॉन्स के साथ लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), वयस्क की तुलना में काफी कम जटिल है, जिसमें लगभग 150,000 न्यूरॉन्स होते हैं। यह कम जटिलता न केवल संख्यात्मक है बल्कि कार्यात्मक भी है, क्योंकि लार्वा व्यवहार सरल लोकोमोटिव कार्यों और संवेदी प्रणालियों पर भरोसा करते हैं। उनके तंत्रिका तंत्र की स्पष्ट सादगी के बावजूद, लार्वा अभी भी पूर्ण भोजन व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, और ड्रोसोफिला लार्वा में भोजन की मात्रा निर्धारित करने के कुछ तरीकों को5,13,14, 15वर्णित किया गया है। न्यूरोनल गतिविधि के जोड़तोड़ के साथ बांधना करके, ड्रोसोफिला लार्वा भोजन के सेवन के तंत्रिका विनियमन को समझने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल मॉडल का गठन कर सकता है।

यहां प्रदान किया गया एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो विभिन्न मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के आहार के संपर्क में लार्वा में भोजन के सेवन की मात्रा निर्धारित करता है। आहार, तथाकथित मैक्रोन्यूट्रिएंट संतुलन आहार, प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट सामग्री में भिन्न होते हैं, विशेष रूप से कार्बोहाइड्रेट (पी: सी) अनुपात के लिए प्रोटीन के संबंध में: 1:1 (प्रोटीन युक्त आहार), 1:4 (मध्यवर्ती आहार), और 1:16 (प्रोटीन-खराब आहार), जैसा कि चित्रा 1Aमें दिखाया गया है। संक्षेप में, एक मात्रात्मक नहीं विकल्प खिला परख इन तीन आइसोलोकालिक सुक्रोज-खमीर (SY) आधारित आहार एक नीले भोजन डाई के साथ रंगे का उपयोग कर स्थापित किया गया था । क्योंकि खमीर निकालने और सुक्रोज का उपयोग प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट स्रोतों के रूप में किया जाता था, और दोनों में कार्बोहाइड्रेट होते हैं, पी में भिन्नता: सी अनुपात इन दो घटकों के संतुलन को बदलकर प्राप्त किया गया था, जैसा कि पहले16 वर्णित था और जैसा कि चित्र 1बीमें दर्शाया गया था। प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन, मुख्य प्रयोगात्मक कदम दिखा रहा है, चित्र 2में उपलब्ध है ।

इस प्रोटोकॉल की स्थापना विभिन्न पी: सी अनुपात और थर्मोजेनेटिक न्यूरोनल स्क्रीन के संदर्भ में लार्वा खिला स्तर के नियमन पर विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की भूमिका की जांच करने के उद्देश्य से की गई थी। क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (टीआरपी) परिवार से एक अच्छी तरह से विशेषता वाले न्यूरोजेनेटिक उपकरण का उपयोग किया गया था: ड्रोसोफिला क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (dTRPA1), जो एक तापमान और वोल्टेज-गेटेड cation चैनल है, जब परिवेश तापमान 25 डिग्री सेल्सियस17से ऊपर उठता है तो कार्रवाई क्षमता की गोलीबारी की अनुमति देता है। DTRPA1 ट्रांसजीन को व्यक्त करने के लिए, हमने जेनेलिया रिसर्च कैंपस18, 19में फ्लाईलाइट परियोजना के संदर्भ में रूबीन प्रयोगशाला में स्थापित ड्रोसोफिला जीनोम से सीआईएस-नियामकक्षेत्रों पर आधारित Gal4 लाइनों का लाभउठाया।

यद्यपि प्रोटोकॉल, यहां वर्णित है, एक सक्रियण स्क्रीन के संदर्भ में स्थापित किया गया है, इसे प्रयोगकर्ता द्वारा अन्य विशिष्ट आवश्यकताओं या हितों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, अर्थात् डीटीआरपीए1 के विकल्प में तापमान संवेदनशील न्यूरोनल साइलेंसर शिबिरेट्स20का उपयोग करके दमन स्क्रीन का प्रदर्शन करना। इस और अन्य अनुकूलन प्रोटोकॉल और चर्चा वर्गों में चर्चा कर रहे हैं।

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Protocol

1. सुक्रोज-खमीर (SY) आहार की तैयारी

  1. मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग और एल 3 पालन आहार के लिए सभी सूखी सामग्री (आगर, खमीर, सुक्रोज) का वजन करें। 1 एल भोजन तैयार करने के लिए आवश्यक प्रत्येक सामग्री के लिए ग्राम में मात्रा चित्रा 1बीमें दर्शाई गई है ।
    नोट: ध्यान रखें कि 60-मिमी पेट्री डिश को भरने के लिए लगभग 13 एमएल भोजन की आवश्यकता होती है।
  2. बाँझ आसुत पानी में सभी अवयवों को भंग करें (भोजन तैयार करने के लिए आवश्यक पानी की कुल मात्रा का लगभग 50% का उपयोग करें) और माध्यम को 5-10 मिनट के लिए हिलाएं।
  3. 50 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
  4. माध्यमों को ठंडा करने की अनुमति देने के बाद, आहार के लिए निपाजिन और प्रोपियोनिक एसिड समाधान, क्रमशः 3% और ०.३% की अंतिम एकाग्रता (v/v) पर जोड़ें । मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार के लिए, 1% की अंतिम एकाग्रता (v/v) में नीले भोजन डाई जोड़ें। आसुत पानी के साथ कुल मात्रा को पूरा करें।
  5. ध्यान से 60 मिमी पेट्री व्यंजनों के लिए भोजन आहार डालें, ताकि डाला गया भोजन की मात्रा प्लेटों में से प्रत्येक में लगभग समान हो। प्लेटों को पी: सी अनुपात आहार के साथ लेबल करें।
    नोट: भोजन परख के दिन मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार तैयार करें। यदि संभव नहीं है, तो तैयार आहार को 4 डिग्री सेल्सियस पर, एक सीलबंद कंटेनर में, अधिकतम 3 दिनों की अवधि के लिए स्टोर करें। लंबे समय तक भंडारण अवधि आहार को बहुत शुष्क और कठिन प्रदान करता है, और लार्वा माध्यम में नहीं हो सकता है।

2. माता-पिता की रेखाओं का आनुवंशिक क्रॉस

नोट: जेनेटिक क्रॉस स्थापित करने के लिए Gal4/UAS सिस्टम21 का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट न्यूरोनल आबादी में न्यूरोनल फ़ंक्शन को सक्रिय करने के लिए, यूएएस डीटीआरपीए1 लाइन17 की महिला कुंवारी का उपयोग किया गया था और जेनेलिया Gal4 लाइनों(चित्रा 2 ए)से पुरुषों को पार किया गया था। आनुवंशिक नियंत्रण का इस्तेमाल किया dTRPA1 लाइन और एक "खाली GAL4" लाइन है, जो वेक्टर में Gal4 किया जाता है के बीच एक क्रॉस की संतान रूबीन Gal4 संग्रह उत्पंन किया गया था, लेकिन कोई नियामक टुकड़ा वर्तमान (attP2)22के साथ । न्यूरोनल दमन को बढ़ावा देने के लिए, DTRPA1 के बजाय, एक यूएएस लाइन एन्कोडिंग शिबिरेट्स20 का उपयोग किया जा सकता है।

  1. L3 पालन आहार प्लेटों के साथ 60 मिमी भ्रूण संग्रह पिंजरों की स्थापना, कुछ सक्रिय खमीर पेस्ट के साथ पूरक।
  2. वयस्क यूएएस dTRPA1 महिला कुंवारी और Janelia Gal4 पुरुषों, 5-8 दिनों की आयु, भ्रूण संग्रह पिंजरों के लिए स्थानांतरण और संभोग 24-48 घंटे के लिए होने की अनुमति, 25 डिग्री सेल्सियस पर, ६०% आर्द्रता और एक 12:12 प्रकाश अंधेरे चक्र(चित्रा 2A)के साथ । 60 मिमी भ्रूण संग्रह पिंजरों के लिए, प्रति क्रॉस लगभग 100 कुंवारी महिलाओं और 30 पुरुषों का उपयोग करें।
  3. संभोग अवधि के अंत में, आनुवंशिक क्रॉस में उपयोग किए जाने वाले एल 3 पालन आहार प्लेटों को हटा दें और त्यागें। उन्हें ताजा L3 पालन आहार प्लेटों के लिए स्थानापन्न, आदेश में अंडा देता है और लार्वा मंचन प्रदर्शन करने के लिए ।

3. थर्ड-इनस्टार लार्वा की तैयारी (L3)

  1. संभोग वयस्क मक्खियों को ताजा एल 3 पालन आहार प्लेटों में स्थानांतरित करें और अंडे-बिछाने को 25 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2B)पर 3-4 घंटे के लिए होने दें। सुनिश्चित करें कि सभी प्लेटों जीनोटाइप के साथ लेबल कर रहे हैं, पी: आहार और अंडे की तारीख के सी अनुपात रखना ।
    नोट: समय बचाने के लिए, अंडे-L3 पालन आहार है, जो अंडे की अतिरिक्त हैंडलिंग से बचा जाता है में सीधे बिछाने प्रदर्शन करते हैं । छोटे पैमाने पर जेनेटिक स्क्रीनिंग के मामले में सेब के रस आगर प्लेटों का उपयोग करके अंडा बिछाने का अनुकूलन प्राप्त किया जा सकता है।
  2. अंडे बिछाने की अवधि के अंत में, पिंजरों से प्लेटों को हटा दें और उन्हें प्लास्टिक के ढक्कन से कवर करें। यदि खमीर निकालने का उपयोग एल 3 पालन प्लेटों के पूरक के लिए किया जाता है, तो अंडे बिछाने के अंत में सभी अवशिष्ट खमीर को हटाना सुनिश्चित करें। लार्वा वृद्धि के दौरान गैर-समान भोजन से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
    नोट: संभोग वयस्कों को ताजा L3 पालन आहार प्लेटों में स्थानांतरित किया जा सकता है, इसलिए अधिक अंडा देता है, और अधिक प्रयोगात्मक लार्वा प्राप्त किए जा सकते हैं। लगातार अंडा-देता है एक पूरे काम सप्ताह के दौरान एक ही वयस्कों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  3. प्रति प्लेट अंडे की संख्या का अनुमान लगाएं और लार्वा घनत्व को प्रति प्लेट अधिकतम 200 भ्रूण तक रखें। यह अनुमान थाली के एक चौथाई में भ्रूण की संख्या गिनकर किया जा सकता है।
    नोट: एक भीड़-भाड़ वाले प्लेट लार्वा विकास में देरी करेंगे और लार्वा खिला व्यवहार को प्रभावित करेंगे।
  4. 18 डिग्री सेल्सियस (स्वतंत्र तापमान), 60% आर्द्रता और 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र पर एल 3 पालन प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और लार्वा को 9 दिनों(चित्रा 2B)के लिए बढ़ने दें।
  5. अंडे बिछाने (एईएल) के बाद नौवें दिन, प्रत्येक जीनोटाइप (और प्रतिकृति के लिए) से 10 एल3 के तीन समूहों को इकट्ठा करने के लिए परीक्षण किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, "शून्य डाई भोजन" नियंत्रण के लिए 10 एल3 के समूहों को इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि लार्वा संग्रह अंडे को रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले दिन की समकक्ष समय अवधि के दौरान किया जाता है (उदाहरण के लिए, यदि अंडा बिछाने 10 am-2 pm के बीच हुआ, तो 9 दिनों के एईएल के समय के दौरान लार्वा एकत्र करें) और #5 या ढंका हुआ बल के बल ों का उपयोग करके, धीरे-धीरे किया जाता है। सीधे अगले चरण (3.6) में संकेत के रूप में लार्वा स्थानांतरित करें।
    नोट: "शून्य डाई भोजन" नियंत्रण जानवर लार्वा हैं कि खिला परख में नीले रंग के बिना भोजन दिया जाता है। यह नियंत्रण वें लार्वा अर्क की पृष्ठभूमि अवशोषण को दूर करने के लिए आवश्यक है।
  6. एकत्र किए गए प्रयोगात्मक लार्वा को 1 एमएल पानी वाली प्लास्टिक डिश वजन नौकाओं में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि L3 एकत्र कर रहे हैं, और नहीं L2, चित्रा 3में दिए गए निर्देशों का पालन करके ।
    नोट: पानी या 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) युक्त प्लास्टिक नौकाओं के लिए L3 का संग्रह, लार्वा को खिलाने की परख की शुरुआत से पहले अच्छी तरह से हाइड्रेटेड रखना महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि विभिन्न जीनोटाइप से कई प्रयोगात्मक L3 समूहों को एक ही समय में एकत्र किया जा रहा है। प्रत्येक समूह के लिए संग्रह आदेश का ट्रैक रखें, इसलिए प्रत्येक समूह के लिए भोजन-अभाव की अवधि में अंतर को कम किया जाता है। इस चरण में प्लास्टिक नौकाओं का उपयोग वैकल्पिक चरण 4.3 की सुविधा देता है क्योंकि यह लार्वा को सीधे पानी के स्नान में तैरने में सक्षम बनाता है।

4. थर्मोजेनेटिक एक्टिवेशन और नो-चॉइस फीडिंग परख

नोट: सर्कैडियन लय से संबंधित संभावित विविधताओं को कम करने के लिए दिन के लगभग एक ही समय में फीडिंग परख करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, हमेशा नियंत्रण प्रयोगों ("खाली Gal4" लाइन की संतान यूएएस dTRPA1 और "शून्य डाई भोजन" लार्वा को पार कर), ब्याज के जीनोटाइप के साथ समानांतर में चलाते हैं।

  1. 30 डिग्री सेल्सियस (गैर-स्वतंत्र तापमान) के लिए एक इनक्यूबेटर स्थापित करें और आर्द्रता के उच्च स्तर (कम से कम 65%) परख के दौरान लार्वा निर्जलीकरण से बचने के लिए।
  2. फीडिंग परख शुरू करने से पहले, परख प्लेटों के तापमान को 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर वार्मिंग करके बराबर करें।
  3. (वैकल्पिक) गर्मी-शॉक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 2 मिनट के लिए प्रयोगात्मक लार्वा। कुछ पानी युक्त प्लास्टिक वजन नौकाओं में जानवरों के साथ इस कदम को करें।
    नोट: इस कदम का उद्देश्य खिला परख की शुरुआत के बाद से न्यूरॉन्स की गोलीबारी को बढ़ावा देने के द्वारा न्यूरोनल सक्रियण को तेज करना है।
  4. 1 घंटे के लिए सेट कई टाइमर तैयार रखें। उपयोग किए जाने वाले टाइमर की संख्या परीक्षण किए जा रहे प्रयोगात्मक समूहों की संख्या और लार्वा को संभालने पर प्रयोगकर्ता के कुशलता स्तर पर निर्भर करती है।
    नोट: सभी जीनोटाइप के लिए परख की अवधि को सुसंगत रखने के लिए कई टाइमर का उपयोग महत्वपूर्ण है।
  5. प्लास्टिक की नावों से पानी को सावधानीपूर्वक निकालें और, एक गीले नरम ब्रश का उपयोग करके, धीरे-धीरे नावों से एल 3 समूहों को परख प्लेटों के केंद्र में स्थानांतरित करें। प्लेटों के ढक्कन वापस रखें और सटीक 1-एच खिला सत्र बनाए रखने के लिए प्रत्येक प्लेट (या प्लेटों के समूह) के लिए एक टाइमर शुरू करें।
  6. लार्वा को अंधेरे(चित्रा 2C)में 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए खिलाने की अनुमति दें।
    नोट: अंधेरे में परख का प्रदर्शन आहार भर में दृश्य संकेतों में अंतर के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि आहार टन में भिन्न होंगे, भले ही उनमें एक ही डाई एकाग्रता हो।
  7. प्लेटों को आइस बाथ में स्थानांतरित करके फीडिंग परख बंद करें। प्लेटों के लिए एक स्थिर सतह प्रदान करने के लिए जितना संभव हो बर्फ को दबाएं।
    नोट: ठंडे तापमान बिलिंग और खुदाई व्यवहार को बाधित करके खिला के अंत को बढ़ावा देंगे। अधिकांश लार्वा कुछ मिनटों के बाद खाद्य प्लेटों को सतह पर रखेंगे, जिससे निम्नलिखित चरणों में उनकी वसूली की सुविधा मिलेगी।

5. खाद्य डाई निष्कर्षण

  1. 10 L3 परीक्षण के प्रत्येक समूह के लिए 2 एमएल माइक्रोट्यूब तैयार करें, जिसमें लगभग 0.5 मिमी-ग्लास मोती (माइक्रोट्यूब के निचले हिस्से को भरने के लिए पर्याप्त) और बर्फ-ठंडे मेथनॉल के 300 माइक्रोन शामिल हैं। ठंड में माइक्रोट्यूब रखें, बेंच कूलर का इस्तेमाल करें।
    सावधानी: मेथनॉल अत्यधिक ज्वलनशील और विषाक्त है। इस अभिवाक्षक को संभालने के लिए अनुशंसित सभी सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें, जिसमें एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में काम करना और नाइट्राइल दस्ताने पहनना शामिल है।
    नोट: लार्वा नमूनों को ठीक करने और क्यूटिकल में मेलनाइजेशन प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए मेथनॉल का उपयोग महत्वपूर्ण है।
  2. #5 या ढंका हुआ-संदंश का उपयोग करके, 10 एल3 के समूहों को खिलाने वाली परख प्लेटों से सावधानीपूर्वक ठीक करें और उन्हें कुछ पानी युक्त परख प्लेटों के ढक्कन में स्थानांतरित करें। किसी भी चोट से बचने के लिए लार्वा को धीरे से संभालते हुए उनके शरीर पर किसी भी खाद्य मलबे को हटाने के लिए लार्वा कुल्ला। प्रति दोहराने प्रत्येक जीनोटाइप के लिए बरामद लार्वा की संख्या का रिकॉर्ड रखें, ताकि प्रति लार्वा भोजन के सेवन की औसत मात्रा निर्धारित की जा सके।
    नोट: घायल लार्वा को छोड़ दिया जाना चाहिए क्योंकि उनके पास मधुर क्यूटिकल होगा, जो कोलोरिमेट्रिक क्वांटिफिकेशन के लिए अनुपयुक्त होगा।
  3. एल 3 समूहों को 5.1 में तैयार 2 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. एक यांत्रिक लाइजर और कांच के मोतियों का उपयोग करके एक यांत्रिक लाइज़र विधि द्वारा हिम्मत से भोजन डाई निकालने के लिए लार्वा ऊतकों को Lyse करें जो चरण 5.1 में जोड़ा गया है। (यदि कोई ऊतक lyzer उपलब्ध नहीं है, तो एक समरूप मूसल का उपयोग करें)। अधिमानतः, इस चरण को 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2डी)पर करें।
    नोट: इस चरण की अवधि उपयोग किए गए उपकरणों पर निर्भर करेगी। एक पारंपरिक ऊतक lyser का उपयोग करना, 1 मिनट निष्कर्षण पर्याप्त है। समय संकीर्तन के मामले में, प्रोटोकॉल को इस चरण के अंत में रोका जा सकता है और बाद में आगे बढ़ाया जा सकता है। नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. नए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब पर सीधे 2 एमएल माइक्रोट्यूब को उलटा करके, 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब को साफ करने के लिए अर्क को स्थानांतरित करें। यदि धीरे-धीरे प्रदर्शन किया जाता है, तो अधिकांश ग्लास मोती 2 एमएल माइक्रोट्यूब के नीचे रहेंगे।
  6. अर्क को अपकेंद्री करके सेलुलर मलबे को साफ करें, 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब को साफ करने के लिए सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें। यदि सेलुलर मलबे अभी भी सुपरनेटेंट में दिखाई दे रहे हैं, तो 5.6 और 5.7 चरणों को दोहराएं।

6. खाद्य खपत का कोलोरिमेट्रिक मात्राकरण

  1. एक शुरुआती नीले रंग के समाधान के मेथनॉल में धारावाहिक 1:2 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके, एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए मानक समाधान तैयार करें। खाली होने के नाते केवल मेथनॉल का इस्तेमाल करें। मानकों की एकाग्रता भोजन के सेवन के जानवरों के स्तर पर निर्भर है ।
    नोट: पायलट स्क्रीन के मामले में यहां प्रस्तुत किया, के रूप में लार्वा अर्क के लिए प्राप्त डाई सांद्रता ०.०२ से १.९३ μL/mL के लिए प्राप्त की, यह एक मानक वक्र एक 2 μL/ml ब्लू डाई समाधान के 8 धारावाहिक कमजोर पड़ने के अवशोषण को मापने के द्वारा प्राप्त किया गया था । यदि आवश्यक हो, तो प्रयोगात्मक नमूनों की डाई एकाग्रता के आधार पर इन समाधानों की एकाग्रता को बढ़ाएं या कम करें।
  2. प्रायोगिक नमूनों के 100 μL हस्तांतरण (चरण 5.7 में प्राप्त), मानकों और खाली (चरण 6.1) को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें और प्लेट रीडर(चित्रा 2E)का उपयोग करके 600 एनएम पर अवशोषण को मापें। पृष्ठभूमि अवशोषण को दूर करने के लिए, लार्वा अर्क ("शून्य-डाई खाद्य नियंत्रण) के लिए "शून्य" के रूप में नीले रंग के बिना भोजन पर खिलाए गए लार्वा से प्राप्त अर्क के अवशोषण को मापें।
  3. एक मानक वक्र उत्पन्न करें और प्रत्येक प्रयोगात्मक लार्वा समूह से नमूनों के लिए प्राप्त अवशोषित मूल्यों को भोजन के सेवन (एमएल में मात्रा) के साथ सहसंबंधित करें। चरण 5.2 में प्रत्येक समूह के लिए एकत्र लार्वा की संख्या को ध्यान में रखते हुए प्रति लार्वा औसत खाद्य खपत का पता लगाएं

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Representative Results

ड्रोसोफिला लार्वा अतिरिक्त कार्बोहाइड्रेट23 (चित्रा 2E में योजनाबद्ध साजिश) को निगलने की कीमत पर अपने प्रोटीन सेवन को विनियमित करते हैं। वास्तव में, प्रोटीन के सेवन की यह प्राथमिकता कई अन्य जंतुओं में देखी गई है और इसेप्रोटीन 24,25का लाभ कहा जाता है ।

इस मजबूत खिला व्यवहार प्रतिक्रिया का लाभ उठाते हुए, एक व्यवहार-आधारित स्क्रीन को मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग में शामिल न्यूरोनल आबादी की पहचान करने के उद्देश्य से डिजाइन किया गया था। एक नहीं विकल्प खिला परख की स्थापना की थी, जिसमें एल 3 (प्रति समूह 10 व्यक्तियों) के समूहों को 1 घंटे के लिए विज्ञापन लिबिटम खिलाने की अनुमति देना और डीटीआरपीए1 का उपयोग करके न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक-सक्रियण स्थितियों के तहत, तीन आइसोकालोकारिक (248 कैल/एल) विशिष्ट पी:सी अनुपात (1:1, 1:4 और 1:16)(चित्रा 1 और चित्रा 2C)वाले भोजन-रंगे वाले आहार में शामिल था। एक पढ़ने के रूप में, विभिन्न पी के मैक्रोन्यूट्रिएंट आहार में खाए जाने वाले भोजन की औसत मात्रा: सी अनुपात का उपयोग किया गया था। Gal4/UAS प्रणाली21 का लाभ उठाते हुए और फ्लाईलाइट परियोजना18, 19से कुछ जेनेलिया Gal4 लाइनों का उपयोग करतेहुए,DTRPA1 की अभिव्यक्ति विशिष्ट न्यूरोनल आबादी में प्रेरित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों के साथ, हम लार्वा तंत्रिका तंत्र में विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के थर्मोजेनेटिक सक्रियण के तहत जानवरों के लिए पी: सी अनुपात के संदर्भ में, खपत किए गए मैक्रोन्यूट्रिएंट्स की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने में सक्षम थे। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण ने यह दर्शा दिया कि न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी को सक्रिय करने से तीसरे-इंस्टार लार्वा(चित्रा 4, तालिका 1)में मैक्रोन्यूट्रिएंट संतुलन काफी प्रभावित हुआ। नियंत्रण रेखा (attP2) के लिए मनाया गया फीडिंग पैटर्न कम पी: सी अनुपात आहार (ग्रे डॉट्स और चित्र 4 में लाइन) में परीक्षण लार्वा द्वारा भोजन के सेवन की अपेक्षित प्रतिपूरक वृद्धि दिखाकर विधि की प्रभावशीलता को दर्शाता है। इसके अलावा, जीनोटाइप और आहार के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत पाई गई, जिसका अर्थ है कि विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के थर्मोजेनेटिक-सक्रियण से लार्वा आहार की मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के जवाब में अपने भोजन के सेवन को विनियमित करने के तरीके को बदलता है।

तीन मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार (1:1, 1:4, 1:16) में परीक्षण किए गए जीनोटाइप के फीडिंग पैटर्न चित्रा 4 में रंगीन डॉट्स और लाइनों द्वारा दिखाए जाते हैं और सांख्यिकीय विश्लेषण तालिका 1में उपलब्ध हैं।

सक्रियण स्क्रीन में, कुल मिलाकर, लार्वा तंत्रिका तंत्र में विरल रूप से व्यक्त की जाने वाली 36 जेनेलिया Gal4 लाइनों का परीक्षण किया गया। रैखिक प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करके, हमने निर्धारित किया कि आनुवंशिक नियंत्रण जानवरों के संदर्भ में कौन से जीनोटाइप ने काफी अलग भोजन का सेवन प्रदर्शित किया। इन मतभेदों में सभी आहारों में खाए जाने वाले भोजन की पूर्ण मात्रा में अंतर, या मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग प्रतिक्रिया (आहार के विभिन्न पी: सी अनुपात के प्रति प्रतिक्रिया की ढलान) में अंतर शामिल थे।

सभी तीन आहार के पार, R12E06 नियंत्रण जानवरों की तुलना में काफी अधिक भोजन खाया । इसके अलावा, इसने मध्यवर्ती और कम प्रोटीन आहार पर भोजन के सेवन में वृद्धि की भरपाई की, जैसा कि भोजन के सेवन और पी: सी अनुपात(तालिका 1)के बीच बातचीत शब्द में एक महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है । R22H01 नियंत्रण से काफी अधिक खाया, लेकिन मैक्रोन्यूट्रिएंट संतुलन प्रतिक्रिया(तालिका 1)में अलग नहीं था । R14B11, R19G11, R21B06, R29C02 और R48F09 लार्वा भोजन की थोड़ी मात्रा में खाया और उपलब्ध आहार की खराब मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के लिए क्षतिपूर्ति करने की क्षमता खो दिया (जैसा कि भोजन के सेवन और पी के बीच महत्वपूर्ण बातचीत शर्तों द्वारा इंगित: आहार के सी अनुपात, तालिका 1)। अंत में, R45D11 लार्वा ने प्रोटीन-समृद्ध आहार में काफी अधिक खाया जिसमें पी: सी अनुपात मध्यवर्ती की तुलना में 1:1 और प्रोटीन-खराब आहार (1:4 और 1:16) में है, जो कम प्रोटीन आहार पर क्या उम्मीद करेगा इसके विपरीत है।

इसलिए, हमारे तरीकों ने हमें प्रयोगात्मक लार्वा को वर्गीकृत करने की अनुमति दी, प्रत्येक जीनोटाइप से, खाए गए भोजन की कुल मात्रा से संबंधित फेनोटाइपिक वर्गों में और कम पी: सी अनुपात के आहार में अधिक गणना करके प्रोटीन के सेवन को प्राथमिकता देने की क्षमता। प्रायोगिक जानवरों के लिए पांच फेनोटाइपिक कक्षाएं स्थापित की गई थीं(चित्रा 5):1 - "बहुत खाएं" (नियंत्रण जानवरों से अधिक) और प्रोटीन कमजोर पड़ने के लिए अधिक क्षतिपूर्ति; 2 - "बहुत खाओ लेकिन सामान्य रूप से क्षतिपूर्ति करें"; 3 - "थोड़ा खाओ (नियंत्रण से कम) लेकिन क्षतिपूर्ति"; 4 - "थोड़ा खाओ और भरपाई नहीं"; 5 - "aberrantly खाओ" (प्रोटीन से भरपूर और मध्यवर्ती आहार में प्रोटीन-गरीब आहार की तुलना में अधिक)। इसके अतिरिक्त, इन फेनोटाइपिक कक्षाओं और जीनोटाइप में से प्रत्येक के लिए, हम तीसरे-इनस्टार लार्वा के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीएफपी पैटर्न दिखाते हैं। यह जानकारी फ्लाईलाइट प्रोजेक्ट ऑनलाइन प्लेटफॉर्म में सार्वजनिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग डेटा से प्राप्त की गई थी, जहां कोई भी ब्याज26की सभी रूबीन Gal4 लाइनों के अभिव्यक्ति पैटर्न तक पहुंच प्राप्त कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: सुक्रोज-खमीर (SY) हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल आहार । (क)नीले बिंदु आहार परख में उपयोग किए जाने वाले आइसोकालोकिक (248 कैलोरी/एल) मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो प्रोटीन में कार्बोहाइड्रेट (पी:सी) अनुपात में भिन्न होते हैं: 1:1, 1:4 और 1:16। बेज डॉट प्रायोगिक तीसरे-इनस्टार लार्वा (एल 3) को पीछे करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आहार का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें पी: सी अनुपात 1:2 और 495 कैलोरी/एल(बी)सुक्रोज-यीस्ट (एसवाई) आधारित आहार की विस्तृत संरचना और पोषण संबंधी जानकारी शामिल थी। घटक सभी आहार के लिए समान हैं: आगर, सुक्रोज और खमीर। आहार के 1 एल तैयार करने के लिए आवश्यक घटकों के ग्राम में राशि दिखाई जाती है। ध्यान दें कि नीले रंग के 1% (v/v) मैक्रोन्यूट्रिएंट संतुलन आहार में जोड़ा जाना चाहिए और L3 पालन आहार निपाजिन और प्रोपोनिक एसिड समाधान के लिए क्रमशः 3% और ०.३% की अंतिम एकाग्रता (v/v) में जोड़ा जाना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हमारे प्रोटोकॉल में शामिल मुख्य चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ए)Gal4/UAS प्रणाली का लाभ उठाते हुए माता-पिता की लाइनों का आनुवंशिक क्रॉस । रूबीन Gal4 लाइनों और यूएएस लाइन एन्कोडिंग डीटीआरपीए1 के बीच क्रॉस, लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के थर्मोजेनेटिक सक्रियण की अनुमति देता है। (ख)प्रायोगिक थर्ड-इंस्टार लार्वा (एल 3) की तैयारी । माता-पिता की महिलाओं को 3-4 घंटे के लिए अंडे देने की अनुमति दी गई थी और लार्वा मंचन 9 दिनों के लिए अनुमेय तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) पर होता है। वैकल्पिक भोजन परख से पहले 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका है। (ग)न्यूरोनल फंक्शन की थर्मोजेनेटिक एक्टिवेशन और नॉन-एमिटिव टेम्परेचर (30 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए नो-चॉइस फीडिंग परख । प्रत्येक जीनोटाइप से 10 प्रयोगात्मक एल 3 के तीन समूहों को कार्बोहाइड्रेट (पी: सी) अनुपात (1:1, 1:4 और 1:16) के लिए विशिष्ट प्रोटीन युक्त मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार में से प्रत्येक में खिलाने की अनुमति दी गई थी। (घ)फूड डाई एक्सट्रेक्शन। लार्वा का यांत्रिक लाइसिस, एक ऊतक लाइसर का उपयोग करके, नीले भोजन डाई को निकालने के लिए। (ई)खाद्य सेवन मात्राकरण। लार्वा अर्क में खाद्य डाई एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करके प्रति लार्वा खाए जाने वाले भोजन की औसत मात्रा का कोलोरिमेट्रिक मात्राकरण। प्रयोगात्मक नमूनों, मानकों और "शून्य" के अवशोषण को 96-अच्छी प्लेट रीडर का उपयोग करके 600 एनएम (नीला) पर मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दूसरे (L2) और तीसरे-instars ड्रोसोफिला लार्वा (L3) के बीच मतभेद । एल 2 और एल 3 को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सर्पिल के अवलोकन से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। L2 के पूर्वकाल सर्पिल क्लब की तरह हैं, जबकि L3 में शाखाओं में बंटी हैं । अन्य विशेषताएं दो इंस्टार को अलग करने में मदद कर सकती हैं लेकिन व्यक्तिपरक और कम विश्वसनीय हैं। L3 के पीछे सर्पिल उनके टिप पर एक गहरे नारंगी अंगूठी है, जो कमी या कमजोर L2 में मौजूद है । श्वासनली एल 3 लार्वा में मोटा है। मारिसा ओलिविएरा द्वारा चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: कार्बोहाइड्रेट (पी:सी) अनुपात के लिए विशिष्ट प्रोटीन युक्त तीन मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार में न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक-एक्टिवेशन स्थितियों के तहत प्रति लार्वा खाए जाने वाले भोजन की मात्रा। विशिष्ट पी: सी अनुपात 1:1, 1:4 और 1:16 युक्त 3 मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग आहार में प्रति लार्वा (एमएल) खाए जाने वाले भोजन की मात्रा का औसत स्तर। प्रत्येक जीनोटाइप से 10 तीसरे-इनस्टार लार्वा के समूहों को 30 डिग्री सेल्सियस पर dTRPA1 का उपयोग करके न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक-एक्टिवेशन स्थितियों के तहत 1 घंटे के दौरान खिलाने की अनुमति दी गई थी। परीक्षण किए गए जीनोटाइप (रूबीन Gal4 लाइनों और यूएएस dTRPA1 लाइन के बीच आनुवंशिक क्रॉस से लार्वा संतान) डॉट्स और विभिन्न रंगों की लाइनों द्वारा इंगित किए जाते हैं। एक आनुवंशिक नियंत्रण (ग्रे में इंगित) के रूप में, "खाली Gal4" लाइन (attP2) और UAS dTRPA1 के बीच एक क्रॉस से लार्वा संतान का उपयोग किया गया था। किंवदंती में इंगित जीनोटाइप को दिए गए नाम "रूबीन GAL4" लाइनों से संबंधित थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 5 मुख्य फेनोटाइपिक कक्षाओं में परीक्षण की गई लाइनों का समूह। संख्याओं द्वारा इंगित फेनोटाइपिक कक्षाएं खाए गए भोजन की कुल मात्रा और प्रोटीन सेवन प्राथमिकता प्रतिक्रिया को बनाए रखने की क्षमता के संदर्भ में मनाए गए फेनोटाइप के संयोजन पर आधारित थीं: 1 - बहुत कुछ खाएं (नियंत्रण जानवरों से अधिक) और अधिक खाकर प्रोटीन कमजोर पड़ने की भरपाई करने में सक्षम थे; 2 - बहुत कुछ खाओ और भरपाई करने में सक्षम नहीं थे; 3 - थोड़ा खाओ (नियंत्रण से कम) लेकिन क्षतिपूर्ति; 4 - थोड़ा खाओ और क्षतिपूर्ति करने में सक्षम नहीं थे;  और 5 - एक अतिरिक्त फेनोटाइपिक वर्ग, जिसे "गुमराह" कहा जाता था, जिसमें लार्वा ने आहार में प्रोटीन सामग्री के मैक्रोन्यूट्रिएंट कमजोर पड़ने के जवाब में उम्मीद के अनुसार व्यवहार नहीं किया, प्रोटीन-गरीब आहार की तुलना में प्रोटीन युक्त और मध्यवर्ती आहार में अधिक भोजन किया। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, तीसरे-इंस्टार लार्वा के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीएफपी अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया गया है। इस परख में इस्तेमाल रुबिन Gal4 लाइनों का यह इमेजिंग डेटा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध फ्लाईलाइट प्रोजेक्ट ऑनलाइन प्लेटफॉर्म26से निकाला गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इनोवा टेबल (टाइप II परीक्षण)
प्रतिक्रिया: एकाग्रता/
राशि वर्ग लोमो एफ वैल्यू पीआर (>एफ)
खाद्य पदार्थ 0.086832 1 113.5358 < 2.2e-16 ***
जीनोटाइप 0.078443 10 10.2567 9.762e-15 ***
खाद्य: जीनोटाइप 0.064038 10 8.3733 6.416e-12 ***
बच 0.215673 282
महत्व कोड: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '. 0.1 ' ' 1
सारांश तालिका (नीचे दिए गए गुणांक की तुलना एटीटीपी नियंत्रण जीनोटाइप से की जाती है):
अनुमान लगाना Std. त्रुटि टी मान पीआर (>| नहीं|)
(अवरोधक) 0.064245 0.004316 14.886 < 2e-16 ***
खाद्य पदार्थ -0.058117 0.007206 -8.066 2.10e-14 ***
जीनोटाइप R12E06 0.040243 0.008961 4.491 1.03e-05 ***
जीनोटाइप R14B11 -0.053347 0.014361 -3.715 0.000245 ***
जीनोटाइप R19G11 -0.044880 0.010788 -4.160 4.23e-05 ***
जीनोटाइप R21B06 -0.051912 0.009363 -5.544 6.79e-08 ***
जीनोटाइप R22H01 0.017682 0.007296 2.423 0.016004 *
जीनोटाइप R29C02 -0.043102 0.011113 -3.879 0.000131 ***
जीनोटाइप R40D06 -0.005341 0.009876 -0.541 0.589102
जीनोटाइप R45C03 0.004064 0.009876 0.412 0.680997
जीनोटाइप R45D11 -0.052579 0.009876 -5.324 2.08e-07 ***
जीनोटाइप R48F09 -0.044612 0.011362 -3.926 0.000108 ***
खाद्य: जीनोटाइप R12E06 -0.037763 0.015440 -2.446 0.015067 *
खाद्य: जीनोटाइप R14B11 0.058054 0.027100 2.142 0.033031 *
खाद्य: जीनोटाइप R19G11 0.051532 0.017726 2.907 0.003937 **
खाद्य: जीनोटाइप R21B06 0.054403 0.015689 3.467 0.000607 ***
खाद्य: जीनोटाइप R22H01 -0.020863 0.012377 -1.686 0.092979 .
खाद्य: जीनोटाइप R29C02 0.048996 0.018714 2.618 0.009317 **
खाद्य: जीनोटाइप R40D06 0.003804 0.016550 0.230 0.818371
खाद्य: जीनोटाइप R45C03 0.034117 0.016550 2.061 0.040177 *
खाद्य: जीनोटाइप R45D11 0.090661 0.016550 5.478 9.53e-08 ***
खाद्य: जीनोटाइप R48F09 0.051184 0.019045 2.688 0.007625 **
महत्व कोड: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '. 0.1 ' ' 1
अवशिष्ट मानक त्रुटि: स्वतंत्रता के 282 डिग्री पर 0.02765
मल्टीपल आर-चुकता: 0.516, समायोजित आर-चुकता: 0.4799
एफ आंकड़ा: 21 और २८२ डीएफ, पी मूल्य पर १४.३१: < 2.2e-16

तालिका 1: भोजन के सेवन की मात्रा पर उपलब्ध आहार की न्यूरोनल थर्मोजेनेटिक-एक्टिवेशन और मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के प्रभाव के लिए इनोवा टेबल। नियंत्रण जानवरों की तुलना में काफी अलग एक खिला व्यवहार का प्रदर्शन जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए एक रैखिक मॉडल फिट किया गया था।

जीनोटाइप एसोसिएटेड जीन मूल बीडीएससी स्टॉक नंबर
w[*]; पी {यूएएस-टीआरपीए1 (बी) । K}attP2/TM6B, टीबी [1] ब्लूमिंगटन 26264
w[1118]; पी {GAL4.1Uw}attP2 जेनेलिया 68384
w[1118]; पी {GMR12E06-GAL4}attP2 नेट (CG11450) जेनेलिया ना
w[1118]; पी {GMR14B11-GAL4}attP2/TM3, Sb[1] डीएनसी (CG32498) जेनेलिया 49255
w[1118]; पी {GMR19G11-GAL4}attP2 सीजी33696 जेनेलिया 48864
w[1118]; पी {GMR21B06-GAL4}attP2 oa2 (CG6919) जेनेलिया 49857
w[1118]; पी {GMR22H01-GAL4}attP2 एफआरयू (सीजी14307) जेनेलिया 49001
w[1118]; पी {GMR29C02-GAL4}attP2 पीटीपी69डी (सीजी10975) जेनेलिया 48088
w[1118]; पी {GMR40D06-GAL4}attP2 सीएनसी (CG17894) जेनेलिया 48616
w[1118]; पी {GMR45C03-GAL4}attP2 kni (CG4717) जेनेलिया 47936
w[1118]; पी {GMR45D11-GAL4}attP2 पीएनटी (सीजी17077) जेनेलिया 49563
w[1118]; पी {GMR48F09-GAL4}attP2 डीपीआर8 (CG32600) जेनेलिया 50377

तालिका 2: इस काम में उपयोग की जाने वाले ड्रोसोफिला लाइनें। उपयोग की जाने वाली सभी लाइनों की विस्तृत जानकारी: कोड नाम, जीनोटाइप, संबद्ध जीन, मूल और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (बीडीएससी) नंबर।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के साथ, कोई भी प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट, दो प्रमुख मैक्रोन्यूट्रिएंट्स के सेवन स्तर को विनियमित करने के लिए विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के थर्मोजेनेटिक-सक्रियण के तहत लार्वा की क्षमता का परीक्षण कर सकता है, जब विभिन्न पी: सी संरचना के आहार के संपर्क में आता है। इस विधि का परीक्षण एक लार्वा प्रारंभिक स्क्रीनिंग के संदर्भ में किया गया था जिसका उद्देश्य विभिन्न मैक्रोन्यूट्रिएंट गुणवत्ता के आहार में भोजन के सेवन के नियंत्रण से जुड़ी न्यूरोनल आबादी की पहचान करना था। यह काम यह प्रदर्शित करने में भी योगदान देता है कि ड्रोसोफिला लार्वा पोषक तत्वों के होरोस्टेसिस से जुड़े भोजन व्यवहार के न्यूरोनल आधार की जांच के लिए मूल्यवान पशु मॉडल हैं।

प्रोटोकॉल में नोटों के रूप में उपलब्ध कराई गई जानकारी के अलावा हम कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर आगे चर्चा करना चाहेंगे । किसी भी व्यवहार परख के रूप में, पशु व्यवहार से जुड़े बदलाव को कम करने के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा उपाय किए जाने चाहिए। एक बहुत ही महत्वपूर्ण पहलू है कि एक ध्यान में रखना चाहिए विकास सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को प्राप्त करने के महत्व से संबंधित है । प्रारंभिक एल 3 लार्वा का उपयोग जो उनके विकास के चरण में अच्छी तरह से सिंक्रोनाइज्ड होते हैं,27को खिलाने के दौरान जानवरों द्वारा प्रदर्शित व्यवहार विविधताओं को कम कर देंगे। सिंक्रोनाइजिंग लार्वा को छोटे अंडे के द्वारा और संस्कृतियों में लार्वा के घनत्व को नियंत्रित करके हासिल किया जाता है। हम प्रोटोकॉल (3-4 घंटे) में संकेत देते हैं की तुलना में अंडे बिछाने की लंबी अवधि का उपयोग न करें। इसके अलावा, प्रति प्लेट 200 जानवरों की अधिकतम संख्या में लार्वा घनत्व को नियंत्रित करने से विकासात्मक देरी से बचा जा सकेगा और भोजन व्यवहार में अतिरिक्त भिन्नता खत्म हो जाएगी। कृपया, ध्यान दें कि पहला अंडा संभोग के बाद रखना, एकरूपता बनाए रखने और बेहतर सिंक्रोनाइज्ड लार्वा विकास प्राप्त करने के लिए त्याग दिया जाना चाहिए। महिलाओं ने अंडाशय में अंडे को निषेचित किया है और उन्हें विकास के विभिन्न चरणों में रखना है जिससे लार्वा संग्रह के बीच एकरूपता बनाए रखना मुश्किल हो जाता है। यह जरूरी है कि अंतिम संग्रह से पहले कम से कम पहले घंटे के अंडे संग्रह प्लेट को छोड़ दिया जाए। कृपया, ध्यान रखें कि लार्वा हैंडलिंग के दौरान जानवरों को प्रेरित तनाव भी व्यवहार को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। नरम और पानी से गीला ब्रश का उपयोग करके, जितना संभव हो उतना कोमल होने की कोशिश करें। अंत में, ध्यान रखें कि प्रतिकृति की एक उच्च संख्या अधिक विश्वसनीय डेटासेट उत्पन्न करती है।

किसी भी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में, हमारे तरीके कुछ सीमाएं पेश करते हैं। जानवरों की हिम्मत में भोजन-डाई के संचय के आधार पर भोजन के सेवन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कोलोरिमेट्रिक विधि का उपयोग करने में परख की अवधि से संबंधित कुछ सावधानियां शामिल हैं। वयस्क मक्खियों के लिए यह प्रदर्शित किया गया था कि डाई संचय के लिए एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने का एक महत्वपूर्ण जोखिम है, जिसमें egestion की दर सेवन की दर के बराबर होती है, जिससे विधि28की सटीकता कम हो जाती है। यद्यपि लार्वा में ऐसा होने का कोई सबूत नहीं है, हमने अधिकतम 60 मिनट की अवधि के साथ एक फीडिंग परख करने का फैसला किया। यह अवधि उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के साथ सुविधाजनक और संगत है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की कुल अवधि को यथासंभव कम रखते हुए एक कार्य दिवस में वर्ग 4, 5 और 6 में सभी चरणों को पूरा करने की अनुमति देता है। यदि भोजन परख की अवधि को बदलना आवश्यक है, तो 60 से 120 मिनट तक की परख अवधि को जीनोटाइप में भोजन के सेवन के कुशल मात्राकरण की अनुमति नीसनी चाहिए, जैसा कि पहले29का प्रदर्शन किया गया था। भोजन मरने के तरीकों की संवेदनशीलता भी अपेक्षाकृत कम है जब भोजन की छोटी मात्रा में खपत की जाती है, जो भोजन के सेवन के बहुत कम स्तर का प्रदर्शन करने वाले जीनोटाइप के बीच संकल्प को काफी कम कर देता है। हम एक नहीं विकल्प प्रतिमान का उपयोग कर हमारे खिला परख की स्थापना की । लार्वा के प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए केवल एक आहार प्रकार उपलब्ध है, जो जानवरों को प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट की खपत के स्तर को स्वतंत्र रूप से विनियमित करने की अनुमति नहीं देता है। इसके अलावा, क्योंकि हम रासायनिक रूप से अपरिभाषित आहार का उपयोग करते हैं, पोषक तत्वों की सांद्रता का नियंत्रण रखना मुश्किल है जो सीधे लार्वा खिलाने के पैटर्न को प्रभावित कर सकता है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, या प्रारंभिक स्क्रीन पर पाए जाने वाले हिट की पुष्टि और आगे विच्छेदन करने के लिए, प्रयोगकर्ता परिभाषित सिंथेटिक (होलीडिक) माध्यमों का उपयोग करके एक सटीक और नियंत्रित प्रयोगात्मक पोषण संदर्भस्थापित करने की संभावना पर विचार करना चाह सकता है और पहले वर्णित30के रूप में खाद्य पसंद परख स्थापित कर सकता है। थर्मोजेनेटिक न्यूरोनल मॉड्यूलेशन से जुड़े प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि आवश्यक तापमान बदलाव सीधे जानवरों के व्यवहार आउटपुट को प्रभावित कर सकता है। ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण का पूरक उपयोग तापमान-प्रेरित झूठी सकारात्मक के लिए नियंत्रित करना दिलचस्प होगा, लेकिन लार्वा खिलाने के संदर्भ में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि लार्वा को खिलाने से अधिकांश समय भोजन सब्सट्रेट में खर्च होता है।

फिर भी, हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कई शक्तियों की गणना की जा सकती है । हमारी विधि की सादगी और अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट विभिन्न पोषण स्थितियों के संपर्क में आने पर कई जीनोटाइप के लिए भोजन के सेवन की मात्रा की अनुमति देते हैं। लार्वा चरण में भोजन व्यवहार वयस्क मक्खियों की तुलना में अधिक आसानी से मात्रात्मक होते हैं, जिससे बेहतर कार्यात्मक रीडआउट की पीढ़ी को सक्षम किया जाता है। यह भी कम लार्वा में प्राकृतिक वातावरण जैसी परख स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है की तुलना में यह वयस्कों के लिए है, क्योंकि यह पहले31पर चर्चा की गई है । इसके अलावा, लार्वा में खिलाने की मात्रा निर्धारित करने के लिए पहले से स्थापित अन्य तरीकों की तुलना में, अर्थात् मैन्युअल के आधार पर32के समय की एक निश्चित अवधि के दौरान मुंह हुक संकुचन की संख्या की गणना करने वाले, हमारी कोलोरिमेट्रिक विधि बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग अध्ययन को सक्षम बनाती है। कुछ अन्य तरीके बस लार्वा के अनुपात को उनकी हिम्मत में रंगे-भोजन के साथ स्कोर करने पर आधारित हैं, जिससे भोजन के सेवन के स्तर33,34के सटीक मात्राकरण की अनुमति नहीं है। न्यूरोनल फ़ंक्शन के न्यूरोजेनेटिक नियंत्रण के संबंध में, तथ्य यह है कि टीआरपीए1 ट्रांसजीन 18 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय है यह सुनिश्चित करता है कि लार्वा विकास में न्यूरोनल गतिविधि प्रभावित नहीं होती है। यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोगात्मक न्यूरोनल सक्रियण विशेष रूप से फीडिंग परख के दौरान किया जाएगा न कि लार्वा विकास के दौरान। इसके अतिरिक्त, हम एक और बार उल्लेख करना चाहते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल को प्रयोगकर्ता की विशिष्ट आवश्यकताओं और हितों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सक्रियण के बजाय न्यूरोनल फ़ंक्शन का दमन, यूएएस लाइन के लिए डीटीआरपीए1 को प्रतिस्थापन करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, जो तापमान संवेदनशील न्यूरोनल साइलेंसर शिबिरेट्स20को एन्कोडिंग करता है। इसके अलावा, यदि प्रायोगिक लार्वा द्वारा प्रदर्शित भोजन का स्तर बहुत कम है, जिससे भोजन के सेवन की मात्रा बताना मुश्किल हो जाता है, तो फीडिंग परख से पहले 30 मिनट लार्वा भुखमरी का अतिरिक्त कदम लगाना संभव है (प्रोटोकॉल की धारा 4 में कदम से पहले), जैसा कि पहले15वर्णित है। यदि आप भूख-चालित व्यवहारों के मॉड्यूलर्स की जांच कर रहे हैं तो यह खाद्य-अभाव कदम विशेष रूप से दिलचस्प हो सकता है। अंत में, पिछले अध्ययनों में, मात्रात्मक रंगीन तरीकों का उपयोग करके, यह दिखाया गया था कि नीले रंग के साथ भोजन लेबलिंगका 12खिलाने पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। फिर भी, हमें लगता है कि पूरक, अधिक सटीक और संवेदनशील तरीकों का उपयोग, जैसे भोजन12के रेडियोलेबलिंग, एक अध्ययन के अधिक उन्नत चरणों में, प्रारंभिक चरणों के दौरान पाए जाने वाले हिट की पुष्टि या आगे विच्छेदन करना हमारी विधि का एक अच्छा पूरक होगा और प्रयोगकर्ता द्वारा विचार किया जाना चाहिए। इन सभी कारणों से, हम आनुवंशिक स्क्रीन (विशेष रूप से प्राथमिक स्क्रीन) प्रदर्शन करने के लिए हमारे तरीकों के आकर्षण में विश्वास करते हैं जिसका लक्ष्य न्यूरोनल सर्किट के कोडांतरण में शामिल न्यूरोनल आबादी की पहचान करना है।

अंतिम नोट के रूप में, हम इस तथ्य का उल्लेख करना चाहते हैं कि जेनेलिया रिसर्च कैंपस में स्थापित हजारों लार्वा Gal4 लाइनें सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर में और लार्वा26 और वयस्क19 सीएनएस अभिव्यक्ति पैटर्न के बारे में बड़ी मात्रा में जानकारी फ्लाईलाइट इमेज डेटाबेस (http://www.janelia.org/gal4-gen1) में भी सार्वजनिक रूप से सुलभ है। ये संसाधन ड्रोसोफिला लार्वा में खिला व्यवहार को विनियमित करने वाले न्यूरॉन्स के ख्यात संरचना-फ़ंक्शन न्यूरोनल मानचित्रों को विस्तृत करना संभव बनाते हैं। यह उपयोग किए गए ड्राइवरों के अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ न्यूरोनल स्क्रीन में उत्पन्न फेनोटाइपिक जानकारी को एकीकृत करके संभव है। हमारा मानना है कि हमारे तरीके ड्रोसोफिला मस्तिष्क में मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग से जुड़े व्यवहार को खिलाने के लिए प्रारंभिक न्यूरोनल नक्शे उत्पन्न करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण का गठन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रायोगिक उपकरणों के हिस्से तक पहुंच प्रदान करने के लिए इंस्टीट्यूटो गुलबेनकियान डी सिनेसिया (आईजीसी) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को पुर्तगाली फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी (एफसीटी), लिस्बोआ-01-0145-फेडरर-007660 द्वारा समर्थित किया गया था, पीटीडीसी/एनएमसी/2459/2014, आईएफ/00697/2014 और ला कैक्सा एचआर17-00595 से पीएमडी और ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल फ्यूचर फेलोशिप (FT170100259) द्वारा सीकेएम को ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtubes Sarstedt AG & Co. 72.690.001
10xPBS Nytech MB18201
2.0 mL microtubes Sarstedt AG & Co. 72.695.500
60 mm petri dishes Greiner Bio-one, Austria 628161
96 well microplates Santa Cruz Biotechnology SC-204453
Agar Pró-vida, Portugal
Bench cooler Nalgene, USA Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media Scientific Industries, Inc. 888-850-6208 (0.5 mm glass beads)
Dish weight boats Santa Cruz Biotechnology SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps BioQuip Products, USA 4750
Fly food for stocks maintenance 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5 Dumont 0108-5-PS Standard tips, INOX, 11cm
Incubator LMS Ltd, UK Series 2, Model 230 For thermogenetic feeding assay (30?C)
Incubator Percival Scientific, USA DR36NL To stage larvae (19?C)
Janelia lines Janelia Research Campus Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol VWR CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) Sigma-Aldrich H5501
Nitrile gloves VWR, USA
Refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany 5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines Janelia Research Campus Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line Bloomington Drosophila Stock Center BDSC number: 66600 Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan Go 51119300
Stereo microscope Nikon 1016625
Sucrose Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater MP Biomedicals, USA FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line Bloomington Drosophila Stock Center BDSC number: 26264 Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ?C
Water bath Sheldon Manufacturing Inc., USA W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract Pró-vida, Portugal 51% Protein, 15% Carbohydrate

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References

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Tags

न्यूरोसाइंस अंक 160 ड्रोसोफिला,लार्वा थर्मोजेनेटिक न्यूरोनल स्क्रीन लार्वा फीडिंग व्यवहार मैक्रोन्यूट्रिएंट बैलेंसिंग प्रोटीन कार्बोहाइड्रेट भोजन का सेवन परख भोजन डाई कोलोरिमेट्रिक क्वांटिफिकेशन

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/06/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae. A figure was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.

<em>ड्रोसोफिला</em> लार्वा का उपयोग करके थर्मोजेनेटिक न्यूरोनल स्क्रीन में मैक्रोन्यूट्रिएंट्स सेवन का मात्राकरण
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Poças, G. M., Domingos, P. M.,… More

Poças, G. M., Domingos, P. M., Mirth, C. K. Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (160), e61323, doi:10.3791/61323 (2020).

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