Summary
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af brænde sårheling. En termisk brænde blev induceret på brystskind af mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Brændt væv blev debrideret og overlejret med en hudtransplantation høstet fra halen af en genetisk lignende donormus.
Abstract
Trivielle overfladiske sår helbrede uden komplikationer ved primær hensigt. Dybe sår, såsom fuld tykkelse forbrændinger, helbrede ved sekundær hensigt og kræver kirurgisk debridering og hudtransplantation. Vellykket integration af donortransplantat i en modtager sår seng afhænger rettidig rekruttering af immunceller, robust angiogenic respons og nye ekstracellulære matrix dannelse. Udviklingen af nye terapeutiske midler, som er rettet mod nogle vigtige processer, der er involveret i sårheling, hindres af manglen på pålidelige prækliniske modeller med optimeret objektiv vurdering af sårlukning. Her beskriver vi en billig og reproducerbar model af eksperimentel fuld tykkelse brænde sår rekonstrueret med en allogen hudtransplantation. Såret er induceret på dorsum overfladen af bedøvet indavlede vilde type mus fra BALB / C og SKH1-Hrhr baggrunde. Forbrændingen er fremstillet ved hjælp af en messing skabelon måler 10 mm i diameter, som er forvarmet til 80 °C og leveres ved et konstant tryk i 20 s. Burn eschar er punkteret 24 timer efter skaden og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en genetisk lignende donor mus. Ingen specialiseret udstyr er nødvendig for proceduren og kirurgiske teknikker er ligetil at følge. Metoden kan uden besvær implementeres og gengives i de fleste forskningsindstillinger. Der er knyttet visse begrænsninger til modellen. På grund af tekniske vanskeligheder er høsten af tyndere hudtransplantater i spaltningstykkelse ikke mulig. Den kirurgiske metode, vi beskriver her giver mulighed for rekonstruktion af brænde sår ved hjælp af fuld tykkelse hudtransplantationer. Det kan anvendes til at udføre prækliniske terapeutiske test.
Introduction
Kirurgisk debridering og hudtransplantation er almindelige kliniske praksis, der anvendes i forvaltningen af kroniske sår1,brændesår 2, og akutte sår såsom traumatiske sår3. Hudtransplantation refererer til den kirurgiske procedure, som indebærer fjernelse af sund hud fra en del af kroppen og overføre det til en anden. Donorgrafter erstatter det tabte væv og giver et strukturelt stillads til cellulær migration og vækst. Efter integration i modtageren site, hudtransplantationer erstatte den tabte hud barriere ved at yde beskyttelse mod mikrobielle invasion, skadelige virkninger af det ydre miljø og overdreven tab af fugt4. Vellykket hudtransplantation integration afhænger af flere faktorer. Disse omfatter tilstrækkelig immunrespons ved tilstedeværelse af mikrobielle infektioner og rettidig opløsning af inflammation, robust angiogenese på sårstedet og etablering af vaskulære anastomoses mellem recipientsengen og donortransplantat5. Efterhånden som transplantatet begynder at nedbrydes, skal hjemmehørende hudceller erstattes af celler, der kan producere nye ekstracellulære matrixer. Samtidig skal de epidermale keratinocytter kravle over den nyproducerede matrix for at danne neo-epidermis og re-epithelialize såret. Det er derfor indlysende, at effektiv migration af celler fra recipientsengen til donortransplantaten er en anden afgørende faktor, der påvirker en vellykket graft inkorporering. I betragtning af det store antal faktorer, der er involveret isårheling 6, som kan være umuligt at kontrollere i de menneskelige forsøg på grund af etiske begrænsninger, modeller af præ-kliniske eksperimentelle hudtransplantation er nødvendige. Udvikling af prækliniske modeller for brændsårheling og tilhørende hudtransplantation vil være vigtig for forståelsen af komplekse mekanismer, der er involveret i kutan vævsreparation og afgørende for afprøvning af nye terapeutiske midler. In vitro-modellerne af sårheling er ude af stand til præcist at efterligne kompleksiteten af det kutane væv. In vivo-dyremodellerne er et uundværligt efterforskningsværktøj til at forstå de mekanismer, der er involveret i vævsreparation.
Flere metoder til hudtransplantation teknik blev udviklet i gnavere til at efterligne kirurgisk excision og brænde sår rekonstruktion7,8,9. De fleste af de tidligere beskrevne procedurer kunne imidlertid ikke fremkalde en termisk forbrændingsskade før hudtransplantation. I stedet for brænde sår, en fuld tykkelse excisional sår blev induceret, som derefter blev rekonstrueret med en fuld tykkelse hud allograft7. Forskellige anatomiske vartegn såsom øre, hale og ryg er blevet brugt til høst af donor huden i gnavere7,8. Der blev rapporteret forskellige graftfikserings- og stabiliseringsteknikker, herunder en "no suture technique"9,suturer 7 og kirurgisklim 10,11,12.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af en fuld tykkelse brænde sår, der ville opsummere den nuværende guld standard tilgang i brænde behandling, som indebærer ikke-levedygtige væv excision og hudtransplantation. En termisk brænde blev induceret på dorsum overfladen af en mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Burn eschar blev fjernet og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en donor mus. Der er tre vigtige fordele ved denne eksperimentelle model. For det første kan der induceres mere end ét brandsår på bagsiden af modtagermusen, og der kan høstes fire donorhudtransplantationer fra en enkelt hale af donormusen. Det betyder, at flere forsøgs- og kontrolbehandlinger potentielt kan sammenlignes med samme modtager- og donordyr. Afhængigt af den ønskede indgivelsesvej kan kontrolbehandlingen omfatte lokal eller systemisk administration af køretøjet eller placebo-kontrollen (f.eks. lokal anvendelse af salve, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs injektion af opløsning). For det andet kan tidspunktet for behandlingen og forsøgets endepunkt kontrolleres. For det tredje, denne model afhænger af genopbygningen af sår ved hjælp af fuld tykkelse grafts høstet fra halen, som er kendt for at have en højere sandsynlighed for en vellykket inkorporering i donor site i forhold til huden høstetfra bagsiden 13. Dette kan skyldes det lavere antal epidermale Langerhans celler, som spiller en central rolle i kutan immunobiologi, og er forbundet med hudtransplantationafstødning 14.
Den foreslåede model for sårheling og graft integration kan meget vel anvendes på transgene og knockout mus. Brugen af genetisk modificerede mus vil hjælpe med at belyse de roller, som visse gener kan spille under sårreparation. Eksogen påføring af topiske sårpræparater eller subkutan administration af terapeutiske antistoffer på skadesstedet kan også overvejes.
På grund af tekniske vanskeligheder er hudtransplantationer, der består af epidermis og en del af dermis, vanskelige at opnå i mus. Fuld tykkelse hudtransplantationer bestående af epidermis og fuld tykkelse dermis er kendt for at kræve en godt vaskulære sår seng for en vellykket integration. Den manglende evne til at høste hudtransplantationer i spaltetykkelser i mus kan betragtes som en begrænsning af denne model. Fikseringen af hudtransplantatet på modtagerens sårleje blev opnået ved anvendelse af den kirurgiske limlim, som er forbundet med mindre traume og hurtig nedbrydning sammenlignet med andre vævsfikseringsmidler15. Tidligere undersøgelser har vist, at suturering er forbundet med stærkere vævfiksering end den kirurgiske lim ved 24 timer efter den kirurgiske procedure15,som kan betragtes som en ulempe ved indgrebet. Men på senere tidspunkt, den biomekaniske styrke af sår behandlet med et kirurgisk klæbemiddel bliver sammenlignelig med suturer15 og bedre end korte fiksering16. Efter vævsfiksering med kirurgisk lim skal sår være dækket med en sårforbinding. Selv om sår på dorsale overflade af musen er vanskelige for dyret at nå, såret dressing, på den anden side, er let for dyret at manipulere og fjerne. Hyppige sårbandage ændringer kan være berettiget.
Anæstesi-induceret hypotermi hos små gnavere er et veldokumenteret fænomen17. Hypotermi er en bivirkning af denne procedure, som forårsager komplikationer, og potentielt kompromitterer både dyresundhed og datakvalitet. Derfor berettiger denne metode til gennemførelse af temperaturstyringsstrategier, især hvis der anvendes hårløse SKH1-Hrhr.
Den mest markante begrænsning ved at bruge mus til at efterligne menneskers sårlukning er forskellen mellem hudens anatomi og fysiologi. Musesår heler det meste via sammentrækning, mens menneskelige sår heler gennem granulering væv dannelse og re-epitelialization18. For at tage højde for denne uoverensstemmelse, den nuværende model kan ændres og anvendes i kombination med en splinting ring stramt klæbet omkring såret for at forhindre hud sammentrækning19. I betragtning af nogle fordele og ulemper ved denne in vivo protokol, denne model kunne tjene som et redskab til at studere visse processer, der er involveret i sårheling, der er umuligt at studere in vitro.
Protocol
Alle forsøg blev godkendt af det franske institut for videregående uddannelse og forskning (studienummer: 1221620171116161767670v2 og DAP180012). Alle mus var enkelt-op-op-til-ankomsten i plast bure og fik lov en 7-dages akklimatisering periode forud for undersøgelsen. Dyrerummet blev vedligeholdt ved en lys/mørke cyklus døgnet rundt (lys tændt kl. 07.00). Mad og vand fra hanen blev leveret ad libitum. BALB/c og SKH1-Hrhr mus blev fodret med traditionel hvede/soy-baseret kost. Savsmuld strøelse blev leveret sammen med redemateriale.
1. Forberedelse af udstyr
- Klargør en brændende anordning til proceduren og indstil den til 80 °C ved hjælp af temperaturregulatoren (Figur 1A). Kontroller temperaturen i messingskabelonen (Figur1B,C) vedhjælp af det infrarøde termiske billedkamera.
- Sørg for, at det digitale manometer fungerer korrekt.
- Dæk scenen med en kirurgisk drapere og justere højden af bordet (Figur 1A).
2. Præoperativ og intraoperativ pasning af dyr
- Erhverve BALB/c og SKH1-Hrhr mus, 6-8 uger.
- Der tilsættes paracetamol suspension ved 3 mg/ml til drikkevand og tilførsel 12 timer før og op til 72 timer efter indgrebet.
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål, administrere buprenorphin subkutane på 0,05 μg/g 30 min før proceduren og hver 6 timer i de første 72 timer efter indgrebet.
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål, administrere lidocain til dorsum af musen og 2-3 mm distalt til det område af brænde såret. Injicer lidocain ved 0,05 μg/g subkutanely 15 min før induktion af forbrændingssåret.
- Anesthetize mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion af xylazin på 10 mg/kg og ketamin 100 mg/kg. Brug en 1 ml sprøjte og en 26 G nål til at administrere injektionen.
- Kritisk trin: Placer den bedøvede mus på en opvarmet pude, og hold musen varm for at forhindre hypotermi i de første 30 minutter efter induktion af anæstesi og i mindst 15 minutter efter helbredelsen fra anæstesi. Ud over den opvarmede pad, heat lampsandre modaliteter, herunder varmelamper, cirkulerende varme væsker eller luft, og forvarmede varmereservoirer kan anvendes til at regulere kropstemperaturen. heat
- Påfør smøregel på øjnene af musen for at forhindre dehydrering af hornhinden.
- Brug tå knivspids tilbagetrækning refleks til at vurdere dybden af anæstesi.
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål administreres 200 μL lakteret ringeropløsning suppleret med 5% dextrose. Væskeudskiftning kutane umiddelbart efter induktion af anæstesi og 6 timer efter proceduren for at forhindre dehydrering.
3. Fuld tykkelse brænde sår induktion
- Barber den bedøvede mus med hårklipperen.
- Påfør depileringscreme på dorsumoverfladen på musen i 1 minut. Tør cremen af med noget steril gaze, og rengør området med et stykke fugtig gaze. Blot huden med nogle gaze indtil tør.
- Placer musen på scenen dækket med en kirurgisk drapere og flytte scenen opad tættere på forvarmet messing skabelon.
- Påfør den cirkulære messingskabelon på bagsiden af musen (80 °C i 20 s) ved konstant tryk på 0,15 N (Figur 2).
- Kritisk trin: Umiddelbart efter forbrændingsinduktionen skal det bedøvede dyr placeres på den opvarmede pude for at forhindre hypotermi og holde musen varm under og efter proceduren. Når inddrives fra anæstesi, returnere musen tilbage til buret.
- Kritisk trin: Giv en mosede kost på buret gulvet for de første 72 timer efter den kirurgiske procedure. Mus er undertiden tilbageholdende med at nå op til en sipper rør til at drikke vand efter en brænde sår skade.
4. Høst af donortransplantaet
- Lav et langsgående snit med en skalpel i den øverste del af donormusens hale og fjern forsigtigt huden ved hjælp af kirurgiske håndsving.
- Halehuden placeres i en steril petriskål fyldt med 10 ml steril 0,9% saltopløsning. Brug en lineal til at måle de enkelte grafts og skær hale huden i stykker, hver måler 15 mm, ved hjælp af en skalpel.
- Når hudtransplantationerne er klargjort, skal det opbevares i 0,9 % saltvand ved 4 °C i op til 2 timer.
5. Kirurgisk excision og hudtransplantation
- Fireogtyve timer efter forbrændinginduktionen forberedes musen til anæstesi ved indånding af isofluran. Anfør musen i induktionskammeret, og fremvirker anæstesi med 5 % isofluran i 100 % ilt med en strømningshastighed på 4 L/min. For at opretholde anæstesi under operationen, bruge 2% isofluran på 2 L/ min.
- Placer en kirurgisk drapere på musen og skåret ud af et vindue for at afsløre det kirurgiske felt. Ved hjælp af aseptisk teknik, podning såret først med povidone-jod og derefter med 70% alkohol.
- Forsigtigt afhente den brændte væv med et par kirurgiske pincet og punktafgifter alle nekrotiske og ikke-levedygtige væv med steril kirurgisk saks og pincet. Fjern panniculus carnosus lag af hypodermis at skabe en stabil modtager seng.
- Placer hudtransplantationen på den frisklavede sårseng. Træk forsigtigt den omgivende hud mod hudtransplantatet ved hjælp af kirurgiske pincet. Påfør nogle kirurgiske lim til at fastgøre transplantatet til sårsengen og tryk forsigtigt for at tilpasse hudkanterne. Kritisk trin: Størrelsen af sårsengen skal være mindre end størrelsen af hudtransplantation for at sikre en vellykket indpodning.
- Lad musen komme sig efter anæstesi. Kritisk trin:Placer musen på en opvarmet pude. Hold musen varm under og efter proceduren for at forhindre hypotermi.
- Påfør inert paraffin gaze dressing og klæbende sekundær dressing over podede sår.
- Placer musen i et individuelt bur. Kritisk skridt: Giv nogle mosede kost på buret gulvet for de første 72 timer efter den kirurgiske procedure og overvåge dagligt.
- Giv legetøj og berige miljøet.
6. Indsamling af digitale billeddannelses- og post mortem-sår
- Fotografi sår med et digitalt kamera ved at placere en lineal ved siden af såret (Figur 3).
- Ved forsøgets slutpunkt aflives dyrene ved at blive udsat for kuldioxid og cervikal dislokation. Kritisk trin: Overdreven trækhandling i huden under livmoderhalskræftforskydningen kan beskadige transplantatet.
- Ved post-mortem, kirurgisk punktafgifter dorsale brænde sår til fascia ved hjælp af en saks. Bisect sår. Fix halvdelen i 10% buffered formalin og proces for histologi og immunhistokemi. Fastfrysning af den anden halvdel i flydende nitrogen til RNA-ekstraktion og proteinkrytificering og opbevares ved -80 °C.
7. Hud histologi, immunhistokemi og kollagen visualisering
- Integrer prøver af huden i paraffin, skåret i 4 μm sektioner og sted på positivt ladede dias.
- Brug slides farves med hæmatoxylin og eosin til at vurdere hastigheden af re-epithelialization (% af det oprindelige sår). Det område af såret, der er dækket med neo-epidermis kan udtrykkes som en procentdel af hele såret (Figur 4). Brug et digitalt mikroskop program og ImageJ software til at udføre den mikroskopiske analyse af sektionerne.
- Brug histologiske sektioner (4 μm tykkelse) fremstillet af formalin-fast og paraffin-indlejret væv og underkaste dem immunhistokemi.
- For at vurdere kollagen I og fibronectin udtryk i sår, anvende primære antistoffer og inkubat i 1 h. Detektion kan udføres af artsspecifikke peberrodperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP)-konjugeret sekundære antistoffer.
- Reagersektioner med enten: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidin (DAB) eller (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabel over Materialer), som giver en lys rød farve (Figur 5). Scan sektionerne ved hjælp af et instrument og analysere med det digitale mikroskop ansøgning og ImageJ.
- For at muliggøre histologisk vurdering af kollagen aflejring, udføre trichrom farvning på histologiske sektioner ved hjælp af en kommerciel kit.
- For kollagen fiber visualisering, bruge multiphoton mikroskopi og anden harmoniske generation teknik (Figur 5). Brug et multifotonmikroskop til vævsscanning som tidligere beskrevet20. Brug en Ti:Sapphire laser med en center bølgelængde ved 810 nm som laserkilde til at generere anden harmoniske og to-foton ophidset fluorescens signaler (TPEF).
- Brug en laserstråle udstyret med en 25x/0,95 W mål at indsamle og ophidse anden harmoniske generation (SHG) og TPEF. Detekter signaler som beskrevet tidligere21 af NDD PMT-detektorer. Brug software til laserscanning kontrol og billede erhvervelse.
Representative Results
Resultaterne viser, at den udviklede protokol er en enkel metode, som tillader induktion af en fuld tykkelse brænde sår i mus. Forbrændinger er induceret ved hjælp af en forvarmet messing skabelon( Figur 1A-C). Det brændte område fremstår som et cirkulært sår med en hvid eschar og en hyperæmisk zone. Størrelsen af brænde sår er lidt større på 24 timer efter brænde skade som følge af den velbeskrevet fænomen kendt som brænde skade progression, som muligvis skyldes akut inflammation22. Efter excision rekonstrueres brandsår ved hjælp af allogen hudtransplantation (figur 3). På dag 7 efter forbrændingsskaden bliver sårvaskulære 5, hvilket er en indikation af en vellykket indpodning. Epidermal keratinocytter migrere fra den tilstødende modtager hud i bestræbelserne på at lukke såret og bygge bro mellem de to kanter af sårene. Mikroskopisk analyse af H og E farvede del af sår viste, at længden af neo-epidermis bliver betydeligt længere på dag 7 efter brænde skade i forhold til dag 3 efter brænde skade (Figur 4B). Før der udføres en stor undersøgelse, anbefales det på det kraftigste, at forskerne gennemfører en pilotundersøgelse, som gør det muligt at undersøge en ny intervention, vurdering af gennemførligheden, identifikation af ændringer af metoden for at sikre reproducerbarhed. Statistisk signifikante virkninger er vanskelige at påvise i mindre stikprøver, mens en forøgelse af stikprøvestørrelsen er en måde at øge en tests statistiske effekt på. For at påvise en statistisk signifikant forskel (p < 0,05) i hastigheden af re-epitialization(figur 4) mellem grupper, skal stikprøvestørrelsen være mellem seks og otte mus pr. gruppe. Alle forsøg bør gentages mindst to gange. Som matrix producerende celler, såsom fibroblaster, migrere fra modtageren væv ind i transplantatet, centrale komponenter i den ekstracellulære matrix, herunder kollagen I og fibronectin bliver stærkt udtrykt i den nydannede matrix (Figur 5).
Figur 1: Opsætning af brænder enhed. (A) Placering og opsætning af den brændende enhed. Forbrændingsanordningen er tilsluttet temperaturregulatoren og er fastgjort til det digitale monometer for at muliggøre overvågning af trykket. Den brændende enhed er suspenderet over en justerbar fase - flad overflade, hvorpå mus er placeret til induktion af brænde. (B-C) Et nærbillede af messingskabelonen, der bruges til at fremkalde sårforbrændinger. (C) Diameteren af messing skabelon er 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk illustration af de forskellige trin, der kræves for at gengive den forsøgsmodel, der er beskrevet i denne artikel. Der er tre hovedtrin til proceduren: (i) induktion af brændesåret ved hjælp af en forvarmet messing skabelon; ii) kirurgisk excision af det ikke-levedygtige nekrotiske væv 24 timer efter forbrændingsskaden iii) kirurgisk sårrekonstruktion ved hjælp af en allogen hudtransplantation af fuld tykkelse, der er høstet fra en donormus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den makroskopiske opfattelse af rekonstruerede mus brænde sår. Repræsentative digitale billeder af brandsår rekonstrueret med allogene hudtransplantationer på dag 0, 1, 3 og 7 efter forbrændingsskade. Linealen på billederne er i millimeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mikroskopisk udseende af sår 3 og 7 dage efter forbrændingsskade. H&E-farvede dele af sår 3 og 7 dage efter brænde skade. Længden af neo-epidermis (stiplet linje) er signifikant forøget i (A) dag 3 sår i forhold til (B) dag 7 sår. I (A) og (B) er skalabjælken 100 μm. (C) Grafisk repræsentation af procentdelen af reepiialisering af sår. Dette blev vurderet ved at måle længden af neo-epidermis på dag 3 og 7 post-burn skade og udtrykt som en procentdel af hele såret længde. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± S.E.M. (n = 6 mus i dag 3-gruppen; n = 6 mus i dag 7-gruppen, *p < 0,05; Studerendes t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Vurdering af den ekstracellulære matrix og kollagen I visualisering. Repræsentative billeder af immunhistokemianalyse på dag 7 musesår farves for (A) kollagen og (B) fibronectin. Bemærk intens rød farvning i aflange spindelformede kollagen I-positive celler. Bemærk brun farvning i fibronectin-positive celler i dermis af dag 7 sår. Skalabar = 50 μm i alle billeder. I (A) og (B) angiver e epidermis og d betegner dermis. (C) Visualisering af kollagen fibre og histologisk vurdering af kollagen deposition. (D) Repræsentant TPEF / SHG kollagen billede af dag 7 musesår. Samtidig TPEF/SHG-anskaffelse ved hjælp af cirkulær polarisering og SHG-signaler blev selektivt behandlet for at opnå en binær fordeling af SHG efter at have anvendt en tærskel. TPEF-billeder (grønne) og SHG-billeder (hvide) var pseudofarvede og overlejrede. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Ifølge tykkelsen klassificering af brænde skade23, fuld tykkelse forbrændinger er karakteriseret ved tydelig involvering af hele tykkelsen af huden og visse del af det subkutane væv. Denne type sår kan kun helbrede ved sammentrækning eller med hudtransplantation2. En iboende begrænsning af den metode, der er beskrevet i denne artikel er, at kun fuld tykkelse grafts, i modsætning til split tykkelse grafts, som ofte anvendes i den kliniske indstilling, blev høstet fra halen af en mus. Dette skyldtes de tekniske vanskeligheder, da musehuden er for tynd til at opnå split tykkelse grafts. Det skal påpeges, at fuld tykkelse grafts kræver en godt vaskulariseret sår seng, mens split tykkelse hudtransplantater er i stand til at overleve på donor steder med mindrevaskularisering 24. Tidligere undersøgelser viste, at et forbrændingssår fremkaldt på bagsiden af musen var forbundet med en robust dannelse af nye vaskulatur5. Dette tyder på, at et godt vaskulært område, såsom dorsum af musen, kunne betragtes som den anatomiske vartegn for induktion af brænde sår.
Brænd sårdybde er en vigtig faktor at overveje. Dybden af forbrændingssåret skal være konsistent mellem de enkelte mus. Reproducerbarheden af brændsåret dybde afhænger af temperaturen af messing skabelon, tryk og varigheden af varmeeksponeringen. Forbrændingssårets dybde skal verificeres histologisk. Det er vigtigt at huske på, at overdrevent tryk eller langvarig eksponering af huden til forvarmet messing skabelon kan skade det underliggende væv. Vævet omkring rygsøjlen, herunder komponenterne i det centrale og perifere nervesystem, er følsomme over for varme, og hvis beskadiget kan resultere i bagben lammelse.
Selv om ingen postoperativ dødelighed var direkte forbundet med den kirurgiske procedure, et lille antal hårløse SKH1-Hrhr mus, som er særligt følsomme over for kulde, udviklet hypotermi og undlod at komme sig efter den generelle anæstesi. Derfor skal der være supplerende varme under alle æstetiske begivenheder, og konstant overvågning er påkrævet, mens musen bedøves.
Den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse, var ikke forbundet med infektion på operationsstedet. Der skal dog anvendes aseptisk teknik for at forhindre overførsel af mikroorganismer til det kirurgiske sår i den perioperative periode. Inokulering af såret med bioluminescerende eller fluorescerende mikroorganismer kan indarbejdes i proceduren. Denne teknik kan være nyttig til at studere infektiøse organismer og deres patogenese25. Eksogen tilsætning eller injektion af bioluminescerende bakterier kanf.eks. I betragtning af at musehår er kendt for at forstyrre in vivo hele dyr fluorescens og bioluminescens imaging, hårløse SKH1-Hrhr mus er ideelle værter for undersøgelser, der involverer fluorescerende eller bioluminescerende reportere.
Sårvævsprøver kan indsamles på forskellige tidspunkter og behandles med henblik på histologisk og immunhistokemisk analyse. Protein og RNA kan isoleres fra hudens biopsi, og molekylærbiologiske teknikker kan anvendes til at vurdere ekspressionen af nøglemolekyler, der er involveret i sårheling.
I denne undersøgelse beskrev vi en eksperimentel model af brænde sårheling og allogen hud engraftment. Denne procedure kan ændres og tjene som model for prækliniske undersøgelser.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense og École Polytechnique. Vi takker vores kollega Yann Plantier fra École Polytechnique, som gav indsigt og ekspertise, som i høj grad hjalp produktionen af videofilen. Forfatterne takker Benoit Peuteman og Charlotte Auriau fra INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif for deres dyrevelfærd og plejeekspertise i løbet af dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G.
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
