Summary
Häri beskriver vi ett förfarande för genomet hela analysen av DNA-metylering i mag-tarmcancer. Förfarandet är av relevans för studier som undersöker samband mellan metyleringsmönster av gener och faktorer som bidrar till cancerframkallande ämnen vid mag-tarmcancer.
Abstract
DNA-metylering är en viktig epigenetisk förändring som är biologiskt meningsfull och ett vanligt fokus för cancerforskning. Genom-hela DNA-metylering är en användbar åtgärd för att ge en korrekt analys av metylering status gastrointestinala (GI) maligniteter. Med tanke på de många potentiella translationella användningsområdena för DNA-metyleringsanalys, måste praktiserande kliniker och andra som är nya i DNA-metyleringsstudier kunna förstå steg för steg hur dessa genomomfattande analyser utförs. Målet med detta protokoll är att ge en detaljerad beskrivning av hur denna metod används för biomarkör identifiering i GI maligniteter. Viktigt, beskriver vi tre kritiska steg som behövs för att få korrekta resultat under genomet hela analysen. Tydligt och koncist skrivet, dessa tre metoder saknas ofta och inte märkbar för de nya till epigenetiska studier. Vi använde 48 prover av en GI malignitet (magcancer) för att belysa praktiskt hur genomet hela DNA metylering analys kan utföras för GI maligniteter.
Introduction
Epigenetik avser heritable förändringar i genfunktion utan ändring av sekvensen av DNA1. Sådana förändringar kan bero på DNA-metylering, där metylgrupper på en DNA-bas kan förändra genuttrycket genom förändringar i kromatinpackning. Cancerutveckling och progression kan uppstå om denna effekt resulterar i förändrat uttryck av tumör suppressor gener2. Åldrande och kronisk inflammation är båda orsaker till cancer och de främsta orsakerna till förändringar i DNA-metyleringhos människor 3,4,5. Följaktligen tillåter detta utnyttjandet av DNA-metylering som en biomarkör vid cancerdiagnos, och som ett mål för behandling och förebyggande. För tidig upptäckt och cancer prognos, DNA metylering mäts i tumör, blod, urin, och avföring prover6, medan demetylating agenter nu används för att behandla leukemier såsom myelodysplastiskt syndrom7.
Genom-wide DNA-metylering analys med hjälp av en array plattform för komplex utvärdering av DNA-metylering vid en enskild CpG locus i det mänskliga genomet kan utnyttjas för att undersöka metylering status mer än 450.000 CpG platser i genomisk DNA8,9, som tillåter utforskning av cancer epigenetik (se Tabell över material). Hela genomet bisulfitsekvensering (WGBS) teknik har förändrat våra tillvägagångssätt inom epigenetik10,11. Det finns dock vissa nackdelar med teknikerna i form av en väsentlig kostnad och handläggningstid för epigenetisk analys av ett stort antalprover 10,11. Därför är arrayplattformen mer genomförbar för komplex utvärdering av DNA-metylering i det mänskliga genomet. Tillgången till tillvägagångssätt för helande metyleringsanalyser har förbättrats under de senaste åren och gör det möjligt för oss att utöka vår kunskap om hur DNA-metylering bidrar till cancerutveckling och progression12. De senaste framstegen inom mikroarray-plattform metoder ger oss den logiska grunden för genomet hela metylering analys för att identifiera en ny epigenetisk signatur i mag-tarmcancer13. Målet med detta protokoll är att ge en detaljerad beskrivning av hur denna metod används för biomarkör identifiering i GI maligniteter.
Protocol
Alla förfaranden som följdes var i enlighet med de etiska normerna i institutionernas mänskliga forskningsetiska kommitté. Studien godkändes av Institutional Review Board vid Juntendo University Shizuoka Hospital, och skriftligt informerat samtycke avskrevs på grund av den retrospektiva designen.
1. Tvättning av rutschbanorna
- Förbered 10 μm av obefläckade formalin-fasta paraffininin-inbäddade (FFPE) sektioner.
- Placera diabilder i en glasglashållare: använd ca 3–5 största tvärsnittsglas om inte vävnaden är minimal, och fler diabilder behövs.
- Fyll bildhållaren med xylen, och se till att all vävnad på bilden är nedsänkt. Låt sitta i 15 min.
- Efter 15 min häller du ut xylen med rutschkanorna som hålls med pipettspets så att objektglasen inte faller ut.
- Häll i mer xylen till samma nivå som tidigare. Låt sitta i ytterligare 15 min.
- Efter 15 min, häll ut xylen igen.
- Fyll bildhållaren med 100% etanol (EtOH), och se till att all vävnad på bilden är helt nedsänkt. Låt sitta i 3 min.
- Häll av EtOH medan du försiktigt håller i rutschbanorna. Fyll på till samma nivå med mer EtOH. Låt sitta i 2 min.
- Häll av EtOH igen och ta bort bilden. Försiktigt placera dem med framsidan upp på en ren pappershandduk för att torka. Låt sitta i 10 min.
2. Skrapa diabilderna
- Förbered matsmältnings-/lysbuffert med 650 mL diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten, 100 mL etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 50 ml Trishydroklorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8, och 200 ml 10% natrium dodetylsulfat (SDS) (se Tabell över material).
- Fyll ett 1,5 mL engångsrör av polypropylen med 80 μL rötnings-/lysbuffert (se Tabell över material).
- Sätt en ren pipettspets i bufferten.
- Identifiera cancer vävnader i tumörområdet mest lämpade för makrodissektion enligt lämplig H & E färgade avsnitt.
OBS: Tumörområdet för makrodissektion bör identifieras av helst två kvalificerade patologer. - Makrodissektcancer vävnad baserad på den markerade H&E-färgade sektionen.
- Ta ett rent rakblad och försiktigt skrapa cancer vävnaden från bilden, försöker hålla den i ett stycke så att det är lättare att arbeta med.
- Ta pipettspetsen ur polypropylenrör för engångsbruk som innehåller buffert och använd den för att överföra den skrotade vävnaden till buffertflaskan (se Tabell över material).
OBS: Våtspetsen ska dra till sig vävnaden, vilket gör överföringen lättare.
- Upprepa steg 2.5 med resten av bilderna.
- Efter all vävnad är i engångsbruk polypropylen röret, använd spetsen för att se till att vävnaden är helt nedsänkt och inte fastnat på väggen i röret.
- Tillsätt 20 μL a subtilisin-relaterad serinproteas i injektionsflaskan och snärta försiktigt för att blanda (se Tabell of Materials).
- Placera injektionsflaskan i ett 55 °C-värmeblock i minst 4 h eller över natten. Se till att något vortexa efter 2 h.
3. Bisulfitbehandling
- Använd 45 μL av den rötade vävnadslösningen som prov.
- Utför bisulfitbehandlingen med hjälp av reagenser i en bisulfitomvandlingssats enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell över material).
- Tillsätt 5 μL spädningsbuffert till DNA-provet och inkubera vid 37 °C i 15 min (se Tabell över material).
- Medan proverna inkuberas, bereder du reagensen för bisulfitomvandling genom att tillsätta 750 μL dH2O och 210 μL spädningsbuffert till ett rör av CT-omvandlingsreagens (se Tabell över material). Blanda rören genom att vortexa i 10 min.
- Efter inkuberingen på 15 min, tillsätt 100 μL av det beredda CT-konverteringsreagensen till varje prov och blanda genom inversion.
- Inkubera proverna i mörker vid 50 °C i 12 till 16 h.
- Efter inkubationen, ta bort proverna och placera på is i 10 min.
- Tillsätt 400 μL bindningsbuffert och blanda varje prov genom pipettering upp och ner (se Tabell över material). Fyll på varje prov i en spinnkolumn och placera kolonnen i ett 2 mL uppsamlingsrör (se Table of Materials).
- Centrifugera varje prov med full hastighet (10 000 x g) i 1 min och kasta genomflödet.
- Tillsätt 200 μL tvättbuffert till varje kolumn och snurra med full hastighet i 1 min, och kasta genomflödet (se Tabell of Materials).
- Tillsätt 200 μL av desulfonationsbuffert till varje kolumn och låt kolonnen stå i rumstemperatur i 15 min (se Tabell över material). Efter inkubationen snurrar du kolonnerna i full fart i 1 min och kasserar genomflödet.
- Tillsätt 200 μL tvättbuffert till varje kolumn och snurra med full hastighet i 1 min (se Tabell över material).
- Upprepa det här steget en gång till.
- Tillsätt 46 μL dH2O till varje kolumn och placera varje kolumn i ett nytt sterilt 1,5 mL engångsrör för engångsbruk (se Tabell över material). Snurra varje rör i 2 min för att elera DNA: t.
- Ta bort varje spinnkolumn från polypropylenröret för engångsbruk och kasta (se Tabell över material). DNA:t är nu redo för analysen.
4. Array plattform för utvärdering av DNA-metylering vid en CpG locus i det mänskliga genomet
- Bedöma kvaliteten på DNA (kvalitetskontrollen: QC) med hjälp av FFPE QC-analys på ett REALTID PCR-amplifierings- och detektionsinstrument, med efterföljande dataanalys utförd enligt tillverkarnas anvisningar (se Table of Materials).
OBS: Prover med ∆Cq-värden mindre än de rekommenderade 5.0 bearbetas vidare14. - Analysera prover med en arrayplattform för komplex utvärdering av DNA-metylering för att bedöma metyleringsstatusen för >450 000 CpG-platser i genomet (se Table of Materials). Produktinformationsblad, datablad och produktfiler för matrisplattformen finns15.
OBS: Analysen utförs enligt tillverkarens anvisningar för FFPE-material14. - Beräkna hög och låg locusmetylering i ett dataanalysverktyg för en matrisplattform som ett β-värde, med ett intervall från 0 respektive 1 (se Tabell över material). Använd kommersiellt tillgänglig programvara (se Tabell över material) för att beräkna β värde.
- Importera data som genereras på arrayplattformen för komplex utvärdering av DNA-metylationsplattformen i R-programvarumiljön (R v.2.15.1) och bearbeta dem med hjälp av ett verktyg för att analysera metyleringsarrayer16,17.
OBS: På heatmapen, som genereras med hjälp av ett dataanalysverktyg, beställs kolumner genom oövervakad klustring, medan radernas ordning baseras på den minskande betydelsen av statistiken t för differentialmetylering uppifrån och ned. - Dela upp heatmapen i hög- och lågmetyleringsgrupper med hjälp av den första differentiator i den oövervakade klustring.
OBS: För validering med kvantitativ metyleringsspecifik PCR (qMSP), välj gener baserat på ett större β-värde i förhållande till CpG-öar i promotorregionen, och på grund av deras lämplighet för primer och sonddesign för qMSP.
5. Kvantitativt Metyleringsspecifik PCR (qMSP)
- Använd det bisulfite-modifierade DNA:t från steg 3.3 som mall för fluorescensbaserad realtids-PCR i qMSP för att utvärdera metylering av promotorns region i varje genanalys.
- Utför qMSP med hjälp av ett 96-väl Realtids PCR-instrument (se Table of Materials).
- Kontrollera för promotorn metylering status av målet genen på bisulfite-modifierad DNA med hjälp av 200 nM framåt primer, 200 nM omvänd primer, och 80 nM sonder. Förbered mastermixen med 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10 nM fluorescein, 0,166 mM av varje deoxynucleotidetrifosfat, och 0,04 U/μl DNA-polymeras (se Tabell över material). Den slutliga reaktionsvolymen i varje brunn för alla analyser är 25 μL.
- Utför cykling av qMSP enligt följande: 95 °C i 5 minuter, följt av 55 cykler på 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min och 72 °C i 1 min.
OBS: Målgen bör väljas utifrån kriterierna för att ha större betavärden, vara relaterade till CpG öar i promotorn regionen, och vara lämplig för primer och sond design för qMSP.
- Använd Humangenomiskt behandlat med CpG Metylas (M.SssI) som en positiv metylationskontroll (se Tabell över material).
OBS: Den slutliga kvantifieringen av metylering definieras som det relativa metyleringsvärdet (RMV), och beräknas som 2–ΔCt för varje metyleringsdetekteringsre replicate jämfört med medelvärdet för Ct for β-Actin (ACTB)18. Primer- och probsekvenser visas i tabell 1. En Ct på 100 används för oupptäckta replikat, vilket ger ett värde på 2–ΔΔCt nära noll. Följande formel används: medelvärde 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.
Representative Results
Egenskaperna hos 48 patienter med magcancer i träningskohorten är följande (Tabell 2): medianåldern för patienterna var 74 år (52–89 år), och kohorten inkluderade 38 hanar (79,2%), och 10 honor (20,8%). Det fanns 35 patienter (72,9%) med primär magcancer och hos 13 patienter (27,1 %) med kvarleva magcancer (primär magcancer: första förekomsten av en icke-metastaserande malignitet i magen; kvarleva magsäckscancer: cancer i kvarlevan magen som utvecklats mer än 5 år efter distala gastrektomi, oavsett orsaken till den ursprungliga samband19). Det fanns 23 patienter (47,9%) med lymfkörtelns metastasering och 25 patienter (52,1 %) Utan. Först var alla 48 prover (träningskohorten) lastade för identifiering av extremvärden (bild 1A). Två prover gav toppar som var större än två standardavvikelser förskjutna från de andra, och dessa prover togs bort (Bild 1B). Därför var 46 prover klustrade av DNA promotorn hypermetrin. Den resulterande heatmap delades in i två grupper baserat på hög och låg metylering (Figur 2). Denna heatmap tillåter visualisering av de 50 bästa sonderna inom 1 500 bp av transkriptionsstartplatsen (TSS) i den differentiella metyleringsanalysen. De höga och låg metylering grupper skilde sig i clinicopathological faktorer relaterade till en aggressiv maligna fenotyp. Det vill säga den typ av cancer (primär magcancer: PGC) (p = 0,01, oddskvot = 9,09 (1,67–50,00)) och förekomst av lymfkörteln metastasering (positiv) (p = 0,03, oddskvot = 6,82 (1,16–40,08)) framstod som betydande oberoende prediktiva faktorer när de clinicopathological faktorerna användes som kovarianer vid multivariatanalys (Tabell 3). Slutligen identifierade vi EPB41L3genen 20,21 (primer och probe sekvenser som visas i tabell 1) att vara starkt förknippad med kodifiera utbildningen kohorten i hög och låg metylering grupper i microarray analysen. Med hjälp av qMSP validerades resultaten av mikroarrayanalysen för EPB41L3 i testkohorten (126 prov). Egenskaperna hos patienterna i testkohorten visas i tabell 4. RMVs av EPB41L3 i PGC vävnader var betydligt högre än de i kvarleva magcancer (RGC) i univariat analys (p = 0.01) (Figur 3A). På samma sätt var RMVs i prover med lymfkörteln metastasering betydligt högre än de utan lymfkörteln metastasering (p = 0,03) (Figur 3B). På så sätt kan DNA-metyleringsgenomet omfattande analys hjälpa oss att identifiera specifika gener för att karakterisera vissa kliniska status hos patienter med GI maligniteter.
Figur 1: Betavärden i 48 prov (träningskohort). Alla 48 prover (träningskohorten) var lastade och avvikare undersöktes (A). Två prover hade toppar som var extremvärden, och dessa togs bort (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Den resulterande värmekartan. De återstående 46 proverna var klustrade av DNA promotorn hypermetylering. Heatmapen delades in i kick- och low methylationgrupper. Denna heatmap tillåter visualisering av de 50 bästa sonderna inom 1 500 bp av transkriptionsstartplatsen (TSS) i den differentiella metyleringsanalysen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Relativ metyleringsvärden (RMVs) för EPB41L3 vid primär magcancer (PGC) jämfört med kvarleva magcancer (RGC), och i fall med och utan lymfkörtelmetastas. Resultaten av mikroarrayanalys för EPB41L3 i testkohorten (126 prov) validerades med hjälp av qMSP. (A) Vid univariatanalys var RMVs av EPB41L3 i PGC-vävnader betydligt högre än de i RGC (p = 0,01). (B) På samma sätt var RMVs i prover med lymfkörtelmetastas betydligt högre än hos de utan lymfkörtelmetastas (p = 0,03). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Gen | Framåt 5' - 3' | Omvänd 5' - 3' | Sond |
| B-ACTIN | TAGG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |
Tabell 1: Primer- och probsekvenser.
| Clinicopathological faktorer | Variabler | |
| Ålder | 74 (52 - 89) * | |
| Kön | Man / Kvinna | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| Typ | PGC / RGC | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| Lymfkörtelmetastas | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: Primär magcancer, RGC: Kvarleva magcancer | ||
| * Median (lägsta-maximum) | ||
Tabell 2: Egenskaperna hos 48 patienter med magcancer i träningskohorten.
| P-värde | Odds-förhållande | 95% Konfidensintervall | |
| Typ (PGC) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| Lymfkörtelmetastas (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| PGC: Primär magcancer | |||
Tabell 3: Prediktiva faktorer för gruppen med hög metylering (Kluster B).
| Clinicopathological faktorer | Variabler | |
| Ålder | 71 (33 - 86) * | |
| Kön | Man / Kvinna | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| Typ | PGC / RGC | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| Lymfkörtelmetastas | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: Primär magcancer, RGC: Kvarleva magcancer | ||
| * Median (lägsta-maximum) | ||
Tabell 4: Egenskaperna hos 126 patienter med magcancer i testkohorten.
Discussion
Det finns tre kritiska steg för att få korrekta resultat från DNA-metyleringsgenomet hela analysen. Den första är makrodissektion av en tumör område genom att helst två kvalificerade patologer baserat på representativa H&E färgade sektioner. Felaktiga makrodission kan orsaka kontaminering med intilliggande icke-cancerogena vävnader, som föder opålitliga resultat; alltså krävs noggrann makrodissektion. Den andra är bedömning av DNA-kvaliteten (kvalitetskontrollen: QC). Prover som misslyckas med QC (∆Cq > 5.0) kan ge uppgifter av dålig kvalitet. Därför ska prover med ∆Cq > 5.0 tas bort och andra användas. Det tredje steget är beräkning av β-värde, som bestäms av ett dataanalysverktyg för array-plattformens programvara som den metylerade signalen / den totala (metylerade + oöverfyllda)signalen 17. De β-värde varierar från 0–1 (eller 0%–100%), vilket är enkelt att tolka biologiskt17. Det största problemet med detta värde är dess dåliga statistiska egenskaper, eftersom dess höga heterocistiskhet innebär att variansen över prover vid metyleringsintervall ytterligheter (β = 0 eller β = 1) är mycket reducerad17. Dessutom kan det på grund av dålig provkvalitet β-värden inte uppvisa reproducerbara bifasiska toppar22, och prover utan sådana toppar bör uteslutas från ytterligare studier. Målgen bör dessutom väljas utifrån kriterierna för att ha större betavärden, vara relaterad till CpG-öar i promotorregionen, och vara lämplig för primer och sonddesign för qMSP.
Utvärdering av DNA-metylering vid en CpG locus i det mänskliga genomet utförs med hjälp av microarray-baserad teknik med ett fast antal sonder för att kartlägga specifika genomiska lokus. Det är den mest använda metoden i epigenome-wide association studier (EWAS) på grund av dess låga kostnad, liten mängd DNA som krävs, och markant kortare prov bearbetningstid, vilket möjliggör hög genomströmning bearbetning av många kliniska prover23. Men en array plattform för komplex utvärdering av DNA-metylering vid en enskild CpG locus begränsas av antalet och specificiteten hos sonder för epigenetically förändrat lokus, vilket förhindrar utforskning av vissa genomiska regioner. WGBS ses allmänt som den guldmyntfoten metoden tack vare dess mer breda spectrum av genomictäckning 10,11. Denna metod har dock en väsentlig kostnad och en relativt lång handläggningstid för analys av ett stort antal prover10,11. Således är det inte alltid genomförbart. I jämförelse är arrayplattformen för komplex utvärdering av DNA-metylering vid en enskild CpG-locus i det mänskliga genomet rimlig för användning när det gäller kostnads- och genomisk täckning. Nyligen har den senaste uppgraderade pärla marker fått redo att använda24. Dessa analyser kan hjälpa oss att analysera nästan fördubblade uppmätta CpG-platser, vilket kan uppnå idealisk genomomfattande associationsstudie (GWAS) för stora provpopulationer.
Sammanfattningsvis kan DNA-metyleringsgenomet omfattande analys med array plattform för komplex utvärdering av DNA-metylering vid en enskild CpG locus i det mänskliga genomet ge viktig information om epigenetiska biomarkörer i mag-tarmcancer. Jämfört med WGBS är den här metoden kostnadseffektiv och minskar provbearbetningstiden. Därför är denna metod för detektion av DNA-metylering vid en CpG locus sannolikt används i stor utsträckning i epigenetisk biomarkörforskning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är särskilt tacksamma mot alla medlemmar i institutionen för kirurgi, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center vid Johns Hopkins University School of Medicine för användbara diskussioner och tekniskt stöd. Vi tackar också Kristen Rodgers för generös teknisk vägledning om rutinerna för bisulfitebehandling och qMSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
References
- Qiu, J.
- Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).
- Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).
- Hsieh, C. J., et al. Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).
- Ushijima, T., Okochi-Takada, E. Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from. Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).
- Coppedè, F. Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).
- Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).
- Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. DNA methylation data analysis and its application to cancer research. Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).
- Morris, T. J., Beck, S. Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data. Methods. 72, San Deigo, California. 3-8 (2015).
- Rauluseviciute, I., Drabløs, F., Rye, M. B. DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis. Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).
- Cazaly, E. Making sense of the epigenome using data integration approaches. Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).
- Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection. Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).
- Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas. Epigenomics. 12 (11), (2020).
- Wong, E. M., et al. Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies. BMC Research Notes. 8, 543 (2015).
- Illumina. , Available from: https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html (2020).
- Fackler, M. J., et al. Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence. Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).
- Dedeurwaerder, S., et al. A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing. Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).
- Hulbert, A., et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).
- Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).
- Eijsink, J. J., et al. Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study. Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).
- Sugimoto, K., et al. DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).
- Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. BMC Bioinformatics. 19, Suppl 5 115 (2018).
- Teh, A. L., et al. Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples. Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
