פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפתוגן התוך תאי כלמידיה trachomatis עובר מחזור התפתחותי המורכב משתי צורות התפתחותיות מורפולוגית דיסקרטית. הגוף היסודי שאינו משוכפל (EB) יוזם זיהום של המחשב המארח. ברגע שנכנס, EB מבדיל לתוך הגוף reticulate (RB). לאחר מכן RB עובר סיבובים מרובים של שכפול, לפני ההבדיל בחזרה לטופס EB מדבק. מחזור זה חיוני להישרדות כלמידית ככישלון לעבור בין סוגי תאים מונע פלישה מארחת או שכפול.
מגבלות בטכניקות גנטיות בשל האופי התוך תאי המחייב של כלמידיה יש לעכב את הזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח סוג התא. עיצבנו מערכת פלסמיד מקדם-כתב-יזם-חדשני, שבילוב עם מיקרוסקופית תאים חיים, מאפשרת הדמיה של החלפת סוג תא בזמן אמת. כדי לזהות גנים המעורבים ברגולציה של פיתוח סוג תא, מערכת יחצ"ן-כתב תא חי היה ממונף לפיתוח גישה גנטית קדימה על ידי שילוב mutagenesis כימי של זן הכתב הכפול, הדמיה ומעקב של כלמידיה עם קינטיקה התפתחותית שונה, ואחריו בידוד clonal של מוטציות. זרימת עבודה גנטית זו קדימה היא כלי גמיש שניתן לשנות לחקירה מכוונת למגוון רחב של מסלולים גנטיים.
מבוא
כלמידיה trachomatis (Ctr) הוא פתוגן תאי חובה המתקדם דרך מחזור התפתחותי דו-פאזי חיוני להישרדותווהתפשטותו 1. מחזור זה מורכב משתי צורות התפתחותיות, הגוף היסודי (EB) והגוף reticulate (RB). EB הוא שכפול לא יושר אבל מתווכת פלישה לתא באמצעות אפקט המושרה אנדוציטוזיס2. פעם אחת במארח, EB מתבגר RB משוכפל. RB מבצע סיבובים מרובים של שכפול לפני המרה בחזרה EB על מנת ליזום סיבובים הבאים של זיהום.
המערך המוגבל של כלים גנטיים הגביל את רוב המחקר הכלמידלי למחקרים ביוכימיים או לשימוש במערכות חלופיות. כתוצאה מכך, ההבררה של ויסות גנים ושליטה במחזור ההתפתחותי היהקשה 3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל קבצי ה- Script של פיתון המשמשים בפרוטוקול זה זמינים ב- Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. כתב מוטגניז כלמידיה
הערה: Ctr-L2-hctBהנשף-mKate2/euoהנשף-תלתן EBs היו מוטאגניים ישירות באמצעות אתיל מתנסולפונט (EMS) במדיה axenic CIP-1 כמו מדיה זו תומכת חילוף חומרים EB ותחזוקה של EBזיהומית 12.
- להפשיר מלאי כלמיד על קרח המכיל ~ 3 x 107 EBs טרנספורמציה עם p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover כתב plasmid וכדור ב >14,000 x g עבור 30 דקות ב 4 °C.
הערה: אורגניזמים כלמידיה המשמשים לניסו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מוטגנזה EMS ישיר של זן כלמידיאל היזם-כתב שלנו הביא לירידה של ~75% בהדבקה. באמצעות פרוטוקול הדמיה תא חי המתואר, כ-600 הכללות נותינו ואותרו במשך תקופה של 24 שעות. הביטוי הפלורסנט קינטיקה של שני הכתבים בכל הכללה היה חזותי באמצעות סקריפטים ניידים פיתון מותאם אישית. שתי גישות הדמיה יושמו כדי לזהות מועמד mutagenized כלמידיה לבידוד. המתודולוגיה הראשונה (שלב 3.3.8) מדמיינת את הזמן לביטוי חצי-מקסימלי של מקדמי euo ו-HCTB מבודדים כלמידיים בודדים בחלקת פיזוראינטראקטיבית (איור 2).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתוח המנגנונים לשלוט מחזור התפתחותי כלמידיאלי כבר התעכב על ידי המגבלות של הכלים הגנטיים הזמינים כיום. העסקת היזם שלנו-כתב כלמידיה בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי תא חי, מערכת נבנתה המאפשר ניטור של פיתוח סוג תא בהכללות בודדות על פני תקופה של 24 שעות. מערכת זו, בשילוב עם mutagenesis כימי ובידוד הכללה ישירה הקימה שיטה כדי לבחור במהירות וclonally כלמידיה המביעה פרופילים התפתחותיים שונה(איור 5).
EBs כלמידיאלי פעילים באופן מטבולית מחוץ למארח כאשר מסופקים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר אנדרס אומסלנד מאוניברסיטת וושינגטון על שסיפק את התקשורת הגרזן CIP-1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AI130072, R21AI135691 ו- R21AI113617. תמיכה נוספת סופקה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת איידהו והמרכז לאינטראקציות מורכבות מידול באמצעות מענק NIH שלהם P20GM104420.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לוחות פוליסטירן 24 בארות | Corning | 3524 | גידול תרבית תאים להדבקה חוזרת של מבודדים |
| לוחות תחתונים מזכוכית 6 בארות | Cellvis | P06-1.5H-N | גידול תרבית תאים להדמיה |
| צלחות תחתונות זכוכית 96 בארות | Nunc | 165305 | גידול תרבית תאים להדמיה |
| יחידת CO2 קו מודגש | OKO Labs | יחידת CO2 שלב BL | בקרת CO2 |
| קו מודגש T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | בקרת טמפרטורה של חממת במה צינורות |
| נימיים מזכוכית בורוסיליקט | Sutter Instrument | B1005010 | צינורות נימיים |
| מסנן פליטת פס פס BrightLine (514/30 ננומטר) | Semrock | FF01-514/30-25 | קוביית מסנן פלואוסנט |
| מסנן פליטת פס פס BrightLine (641/75 ננומטר) | Semrock | FF02-641/ 75-25 | קוביית מסנן פלואוסנט |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | מיקרו-מזרק |
| כלמידיה טרכמטיס סרובר L2 | ATCC | VR-577 | כלמידיה טרכומטיס |
| CIP-1 מדיה | בבית | NA | Axenic. IPB בתוספת 1% FBS, 25 ו-mu; חומצות אמינו M, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT ו-50 μ M GTP, UTP, ו CTP. (Omsland, A. 2012) תוצרת החברה. |
| תאי Cos-7 (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | תא כליה של קוף ירוק אפריקאי (תאי מארח) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | מעכב צמיחת תאי מארח |
| אתיל מתאן סולפונט, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | תוסף למדיית גידול בסיס |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | תוכנה לניתוח תמונות מקורות פתוחים. https://imagej.net/Fiji |
| חממת CO2 גלקסי 170 | S Eppendorf | CO1700100X | של דגירה של תרבית תאים |
| (גרסאות FP פלואורסצנטיות: Clover ו-mKate2) | טכנולוגיות DNA משולבות | NA | gblock ORFs של גרסאות FP מותאמות ל-Ctr לשיבוט לתוך p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | אנטיביוטיקה למצע גידול |
| HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק) | קורנינג | 21-020-CM | תאי מארח שוטפים |
| את הפרין נתרן | אמרשם מדעי החיים | 16920 | מעכב והופך את האינטראקציות האלקטרוסטטיות המוקדמות בין התא המארח ל-EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | מאגר pH למצע גדילה |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | הדמיה של עקבות הכללה. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | שולט גלגל מסנן |
| Oko Touch | OKO Labs | ממשק מגע Oko Touch | לשליטה בקו המודגש T ויחידת CO2 |
| שלב XY קודם | קודם | H107 | ממונע שלב מיקרוסקופ XY פריזמה |
| צנטריפוגה | Labnet | C2500-R | מיקרוצנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה |
| תנור היברידיזציה Problot | Labnet | H1200A | חממת נדנדה לזיהום בכלמידיה |
| Proscan II | קודם | H30V4 | XYZ בקרת שלב מיקרוסקופ |
| מטהר Class 2 ארון בטיחות ביולוגית | Labconco | 362804 | עבודת תרבית תאים |
| RPMI-1640 (ללא פנול אדום) | Gibco | 11835-030 | מדיית גידול בסיס להדמיה |
| RPMI-1640 (פנול אדום) | GE Life Sciences | SH30027.01 | מדיית גידול |
| בסיסנוריות עירור LED (470nm, 595nm) | scopeLED | F140 | אור עירור |
| Sonic Dismembrator דגם 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | סוניקטור, השעיית גלולה כלמידית |
| חממת שלב | OKO Labs | H301-K-FRAME | אשכול תא דגירה של צלחת |
| מאגר סוכרוז-פוספט-גלוטמט 1X (SPG) | בבית | NA | מאגר אחסון כלמידיה. (10 מ"מ נתרן פוספט [8 מ"מ K 2HPO 4, 2 מ"מ KH 2PO 4], 220 מ"מ סוכרוז, 0.50 מ"מ חומצה L-גלוטמית; pH 7.4) |
| T-75 צלוחיות | Thermo Scientific | 156499 | גידול תרבית תאים |
| TE 300 מיקרוסקופ הפוך | Nikon | 16724 | |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | אור לבן |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | מסיר תאים מארחים מבקבוק לזריעה לצלחות |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | |
| ומיקרו; מנהל 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | חבילת תוכנה לבקרת מיקרוסקופ אוטומטי מקור פתוח |
מקורות
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyros....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
