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Cancer Research

3 डी संस्कृति में कैंसर सेल आक्रमण और टी-सेल साइटोटॉक्सिकिटी की निगरानी

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

प्रस्तुत दृष्टिकोण एक साथ 3 डी गोलाकार परख और टी-सेल साइटोटॉक्सिकिटी में कैंसर सेल आक्रमण का मूल्यांकन करता है। स्फेरॉइड एक पाड़ मुक्त एगर उठे मल्टी-माइक्रोवेल कास्ट में उत्पन्न होते हैं। सह संस्कृति और प्रकार में एम्बेडिंग मैं कोलेजन मैट्रिक्स एक ही डिवाइस के भीतर किया जाता है जो कैंसर सेल आक्रमण और टी-सेल मध्यस्थता साइटोटॉक्सीसिटी की निगरानी करने की अनुमति देता है।

Abstract

इम्यूनोथेरेपी के साथ कैंसर के इलाज में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, हालांकि बड़ी संख्या में कैंसर उपचार के लिए प्रतिरोधी रहते हैं । परख की एक सीमित संख्या ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत में प्रत्यक्ष निगरानी और यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति देते हैं, जिसके बीच, टी कोशिकाओं कैंसर कोशिकाओं के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के साइटोटॉक्सिक प्रतिक्रिया को क्रियांवित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अधिकांश परख दो आयामी (2 डी) सह उपयोग की सापेक्ष आसानी के कारण कोशिकाओं की संस्कृति पर आधारित हैं, लेकिन आक्रामक विकास फेनोटाइप, कैंसर कोशिकाओं की पहचान में से एक के सीमित प्रतिनिधित्व के साथ । वर्तमान त्रि-आयामी (3 डी) सह-संस्कृति प्रणालियों को सह-संस्कारी कैंसर कोशिकाओं पर आक्रमण और टी-कोशिकाओं पर बातचीत के लिए विशेष उपकरण या अलग निगरानी की आवश्यकता होती है।

यहां हम सह-संस्कृति में कैंसर सेल स्फेरॉइड और टी-सेल साइटोटॉक्सिकिटी के 3 डी में आक्रामक व्यवहार की निगरानी करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। स्फेरॉइड गठन पी-आकार के नीचे से पाड़-मुक्त एगरैर्ज माइक्रोवेल डाले में बढ़ी हुई सेल-सेल इंटरैक्शन से प्रेरित है। दोनों टी सेल सह संस्कृति और कैंसर सेल आक्रमण प्रकार मैं कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आवश्यकता के बिना agarose casts के माइक्रोवेल के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं, इस प्रकार परख भर में एक बरकरार 3 डी सह संस्कृति प्रणाली को बनाए रखने । कोलेजन मैट्रिक्स को एग्रिसेड कास्ट से अलग किया जा सकता है, जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला हो सकता है और कोशिकाओं की कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए। इसके अलावा, कोशिकाओं को आगे के विकास के लिए अलग किया जा सकता है या जीन अभिव्यक्ति या फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) जैसे विश्लेषणों के अधीन किया जा सकता है। अंत में, 3 डी सह-संस्कृति का विश्लेषण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के बाद किया जा सकता है। परख के संभावित संशोधनों में एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) की बदली हुई रचनाएं शामिल हैं और साथ ही कैंसर कोशिकाओं के साथ विभिन्न स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल किया गया है।

Introduction

पिछले एक दशक में कैंसर इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद, संवेदनशीलता और उपचार के प्रतिरोध की हमारी यंत्रवादी समझ अभी भी काफी गरीब1हैं । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि ट्यूमर पर्याप्त विषमता प्रदर्शित करते हैं, और ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशील बातचीत उनके माइक्रोएनवायरमेंट के साथ-साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ, प्रभाव ट्यूमर सेल मृत्यु, आक्रामक व्यवहार और उपचार के प्रति प्रतिक्रिया जिसमें इम्यूनोथेरेपी1,,2,,3शामिल हैं। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के एक हाथ के रूप में, टी-कोशिकाएं सेल-विशिष्ट साइटोटॉक्सिकिटी को निष्पादित करती हैं। टी सेल मान्यता और कैंसर की कोशिकाओं के लिए प्रतिक्रिया का विश्लेषण प्रतिरोध और प्रतिरक्षा मॉड्यूलरी उपचार के प्रति संवेदनशीलता में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

इन विट्रो मॉडलिंग और एक उपयुक्त वातावरण में कैंसर और टी कोशिकाओं के बीच बातचीत की निगरानी चुनौतीपूर्ण रहा है और अब तक, सीमित यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के परिणामस्वरूप । अधिकांश सेल-आधारित परख दो-आयामी (2D) वातावरण पर भरोसा करते हैं, इसमें उन प्रमुख विशेषताओं का अभाव है जो वीवो फिजियोलॉजी4,5,,6,अर्थात् स्थानिक कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम)7,गतिशील मेटाबोलिक मांग, द्रव्यमान वृद्धि8के कारण हाइपोक्सिया में वृद्धि, और ट्यूमर माइक्रोएनविरोनमेंट (टीएमई) 9 में त्रि-आयामी(3डी) को पुनः रीकैपिटल करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।, दूसरी ओर, वर्तमान में उपयोग किए गए त्रि-आयामी (3 डी) सह-संस्कृति और आक्रमण परख प्रणालियों के साथ अभी भी कई कमियां हैं: (1) गोलाकार पीढ़ी और फसल की समय लेने वाली प्रकृति5,,10,(2) गोलाकार आकार पर नियंत्रण की कमी, आकार और कोशिका घनत्व11,,12,(3) कम थ्रूपुट प्रकार का परख, (4) विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता13,,14,(5) विभिन्न परख के लिए सह-संस्कृति को अलग वातावरण में स्थानांतरित करने की आवश्यकता15,16,,17।, विशेष रूप से, सह-संस्कृति परख के हस्तांतरण से अक्सर स्फेरॉइड में व्यवधान होता है और सह-संस्कृति अखंडता की हानि होती है। यह विशेष रूप से कम सेल-सेल आसंजन के साथ "ढीले" स्फेरॉइड के लिए लागू होता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश 3 डी आक्रमण की आवश्यकता होती है कि उनके प्रारंभिक गठन के बाद स्फेरॉइड काटा जाता है और फिर ईसीएम14 , 15,,16में फिर से निलंबित कर दियाजाताहै। इस पुनर्प्रापीय चरण के परिणामस्वरूप गोलाकारों के बीच की दूरी पर नियंत्रण की हानि होती है। चूंकि ट्यूमर गोलाकारों के बीच की दूरी उनके आक्रामक व्यवहार को प्रभावित करती है, इसलिए नियंत्रण का यह नुकसान उच्च अंतर-परख विचरण का परिचय देता है और प्रजनन क्षमता को कम करता है। इसके अलावा, परिधीय और ट्यूमर गोलाकार घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आकलन के लिए लगातार अपकेंद्रित्र कदमों द्वारा सेल अंश का अनुप्रयोग ट्यूमर सेल आबादी तक सीमित है जो अधिक स्थिर गोलाकार17उत्पन्न करते हैं।

अवधारणा और दृष्टिकोण

हमारा दृष्टिकोण "ऑल-इन-वन"-3 डी स्फेरॉइड सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग करके उपरोक्त कमियों को संबोधित करता है, जिसके लिए बाद की परख के लिए स्पेरोइड के हस्तांतरण की आवश्यकता नहीं होती है। हमने कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार और सह-सुसंस्कृत टी-कोशिकाओं के साइटोटॉक्सिकिटी की एक साथ निगरानी करने के लिए एक परख उत्पन्न करने के लिए एक गोलाकार गठन डिवाइस (सामग्रीकी तालिका देखें) को अनुकूलित किया। यह विधि उपयोगकर्ता के अनुकूल, सस्ती है और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट 3डी सेटिंग में त्वरित और आसान हैंडलिंग की अनुमति देती है। उपयोग किए गए डिवाइस के प्रकार पर निर्भर, 81 बड़े समान रूप से आकार के स्फेरोइड को वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या को संशोधित करके व्यक्तिगत गोलाकार आकार पर नियंत्रण के साथ एक ही पाइपिंग चरण में उत्पन्न किया जा सकता है। स्फेरॉइड गठन को पीपाड़-मुक्त एगर उठे मल्टी-वेल में यू-आकार के नीचे से बढ़ी हुई सेल-सेल इंटरैक्शन द्वारा मजबूर किया जाता है। हमने गतिशील सेल-आधारित कार्यात्मक अध्ययनों के साथ-साथ एंडपॉइंट आणविक और जैव रासायनिक परख के लिए इस 3 डी प्रणाली को अनुकूलित किया जिसमें फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS), इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला के साथ-साथ बरकरार 3 डी सह-संस्कृति का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण शामिल है।

कार्यात्मक अध्ययनोंके लिए, एग्वैर उठे के भीतर प्रकार के स्फेरॉइड को एम्बेड करने से कैंसर कोशिकाओं पर समान दूरी के स्फेरॉइड से आक्रमण होता है और आवश्यक सेल लाइन-विशिष्ट विशेषताओं की निगरानी करने की अनुमति होती है, जैसे एकल सेल बनाम सामूहिक सेल माइग्रेशन18,,19। इसके अलावा, कोलेजन मैट्रिक्स को आसानी से एगर उठे कास्ट से अलग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 1 \u20122 मिमी मोटी पैच होती है जिसमें कई स्फेरॉइड होते हैं, जिन्हें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आईएफ-धुंधला और इमेजिंग के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है। यह एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में अलग सेल आक्रमण और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन प्रकट कर सकता है। इसके अलावा, कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं को बाद में कोशिका की खेती या विश्लेषण के लिए कोलेजन पाचन और एकल कोशिका वियोजन के बाद अलग किया जा सकता है।

स्फेरॉइड के आईएचसी विश्लेषण केलिए, एगर उठे हुए कलाकारों के निर्धारण और खंड के बाद, प्रोटीन या ब्याज के अन्य अणुओं को गोलाकारों की भौगोलिक स्थितियों को बनाए रखते हुए पता लगाया जा सकता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण में, गोलाकार सीधे एगर उठे कास्ट के भीतर हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रसंस्करण जेल में एम्बेडेड होते हैं और जेल माइक्रोवेल के नीचे स्फेरॉइड को बनाए रखने के लिए "ढक्कन" के रूप में कार्य करता है। एगर उठे कास्ट20के पैराफिन एम्बेडिंग के बाद, सीरियल क्षैतिज खंडिंग शुरुआती बिंदु के रूप में सेवारत कलाकारों के नीचे के साथ किया जाता है।

यह दृष्टिकोण स्फेरॉइड के पारंपरिक आईएचसी खंड के विपरीत है जिसके लिए हाइड्रोक्सीथिल एगरग्ड प्रोसेसिंग जेल21 में एम्बेड करने से पहले कोशिकाओं की कटाई की आवश्यकता होती है और गोलाकारों के व्यवधान का जोखिम होता है जिससे कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था खो जाती है। इसके अलावा, यह आकलन करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिका अंश कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं ने घुसपैठ की या ट्यूमर स्फेरॉइड17 के लिए परिधीय बने रहे, प्रत्यक्ष एम्बेडिंग से बचा जाता है।

इसके अलावा, 3 डी सह-संस्कृति ट्यूमर, स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एडमिक्स करके किया जा सकता है, और इस प्रकार ट्यूमर सेल क्रॉसटॉक का अध्ययन कर सकता है या एंडोथेलियल कोशिकाओं16के साथ सह-संस्कृतियों सहित सेल-सेल इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट्स का पुनर्पूंजीकरण कर सकता है।

इस 3 डी स्फेरॉइड सह-संस्कृति सेटिंग का उपयोग ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों की सह-संस्कृति करने और परिवर्तित ईसीएम तत्वों के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। टाइप I कोलेजन के अलावा, अन्य ईसीएम घटक (जैसे, मैट्रिक्सेल, मैट्रिक्सेल/कोलेजन मिश्रण, फाइब्रोनेक्टिन) का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि ट्यूमर सेल आक्रमण विभिन्न सब्सट्रेट्स22की बहुतायत से प्रभावित होता है। इसके अलावा, एगर उठे कास्ट के माइक्रोवेल प्राथमिक सेल लाइनों के गोलाकार गठन और कम सेल-सेल आसंजन वाली कोशिकाओं के लिए उपयुक्त हैं।

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Protocol

प्रोटोकॉल के दौरान अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले कुछ शब्दों की सूची और स्पष्टीकरण अनुपूरक फाइल 1में पाया जा सकता है ।

1. गोलाकारों का उत्पादन

  1. 1x पीबीएस (उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस के 50 एमएल में 1 g agarose) और ऑटोक्लेव 35- और 81-माइक्रोवेल रबर मोल्ड्स में 2% एग्रामीज़ तैयार और ऑटोक्लेव।
    सावधानी: आईएचसी प्रसंस्करण के लिए एगर उठे हुए डाले को उत्पन्न करने के लिए कम पिघलने वाले एगर उठे का उपयोग करने से बचें।
  2. तैयार agarose डाले
    नोट: ३५-माइक्रोवेल डाले आक्रमण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और सेल अलगाव परख के लिए उपयोग किया जाता है । 81- माइक्रोवेल कास्ट का उपयोग साइटोटॉक्सीसिटी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), सेल आइसोलेशन और आरएनए एक्सट्रेक्शन परख के लिए किया जाता है।
    1. एगर उठे के बाद, पिघला हुआ एगर लगभग 60\u201270 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया। एक सेल कल्चर हुड में, एसेप्टिक तकनीक और पिघले हुए एग के पिपेट 500 माइक्रोल का उपयोग प्रति अच्छी तरह से 81-माइक्रोवेल रबर मोल्ड में या 330 माइक्रोल माइक्रोल में 35-माइक्रोवेल रबर मोल्ड में शामिल हो गया।
      सावधानी: मिश्रण या पाइपिंग एगर उठे समय बुलबुले बनाने से बचें। धीरे-धीरे पाइपिंग करके किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    2. एगर उठे के जम जाने के बाद, एगर उठे कास्ट को हटाने के लिए रबर मोल्ड को सावधानी से फ्लेक्स करें। इसके द्वारा, उचित अच्छी तरह से थाली के ऊपर हाथ जगह है और agarose डाली अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से सही में छोड़ देते हैं ।
      नोट: फ्लेक्स रबर मोल्ड को विभिन्न पदों पर रखें ताकि ठोकने से बचा जा सके। यह रबर मोल्ड फ्लेक्स और एक ही समय में नीचे से धीरे धक्का करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
    3. agarose डाले संतुलन के लिए, सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें, DMEM से मिलकर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (२.५ एमएल/वेल के लिए 12 अच्छी तरह से थाली और 1 mL/अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से थाली के लिए) । अच्छी तरह से प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट में रखें।
  3. इस बीच, सीडिंग के लिए सेल कल्चर तैयार करें।
    नोट: प्रति agarose डाली कुल सेल सीडिंग संख्या अन्वेषक द्वारा तय किया जाना है । मुरीन प्राथमिक अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों के लिए, ३५,००० कोशिकाओं/३५-माइक्रोवेल कास्ट और ८१,००० कोशिकाओं/८१-माइक्रोवेल कास्ट (औसत १००० कोशिकाओं/spheroids में) सभी निम्नलिखित परख के लिए वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । एक गोलाकार का औसत व्यास 48 घंटे के बाद लगभग 150\u2012200 माइक्रोन है।
  4. अच्छी तरह से थाली झुकाव द्वारा पहले एक P1000 पिपेट के साथ agarose डाली आसपास के सेल संस्कृति माध्यम हटा दें । फिर ध्यान से सीडिंग कक्ष में माध्यम को हटा दें।
  5. सावधानी से तैयार ट्यूमर सेल निलंबन ड्रॉप वार सेल सीडिंग कक्ष में बीज। ध्यान से अच्छी तरह से थाली वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में15 मिनट के लिए डाल दिया।
    नोट: इस चरण के दौरान कोशिकाएं एगर उठे कास्ट के माइक्रोवेल में बस जाएंगी।
  6. agarose डाली के बाहर करने के लिए अतिरिक्त माध्यम जोड़ें (२.५ एमएल/अच्छी तरह से 12 के लिए अच्छी तरह से थाली और 1 एमएल/अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से थाली के लिए) ।
  7. अच्छी तरह से प्लेट वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में48 घंटे के लिए रखो।
    नोट: आमतौर पर कोशिकाओं को माइक्रोवेल में गोलाकार बनाने में कुछ घंटे तक का समय लगता है। सामान्य तौर पर, ठोस ट्यूमर सेल गोलाकार 24 घंटे के बाद बनते हैं और 48 घंटे के बाद स्थिर होते हैं। हालांकि, यह विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकता है। यदि आवश्यक हो, तो सेल संस्कृति माध्यम को ध्यान से अच्छी तरह से प्लेट को एगर उठे हुए डाले के साथ झुकाकर और P1000 पिपेट के साथ आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटाकर बदलें। फिर ध्यान से इसे कुएं की दीवार के साथ पाइपिंग करके ताजा माध्यम जोड़ें। आमतौर पर अपनी छोटी मात्रा और गोलाकार को हटाने के जोखिम के कारण डाले के भीतर मीडिया को बदलना आवश्यक नहीं है।

2. टी-कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति

  1. 75 माइक्रोल (35 माइक्रोवेल कास्ट) में या 190 माइक्रोवेल कास्ट में 75 माइक्रोवेल कास्ट में या 190 माइक्रोवेल कास्ट में 190 माइक्रो-सेल कल्चर मीडियम (आरपीएमआई 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यूनिट/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) में टी-सेल की आवश्यक संख्या को फिर से खर्च करें।
  2. अच्छी तरह से थाली झुकाव द्वारा पहले एक P1000 पिपेट के साथ agarose डाली आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें । फिर धीरे-धीरे और ध्यान से दूसरे हाथ से झुका हुआ प्लेट रखते हुए पी 200 पिपेट के साथ सीडिंग चैंबर के एक कोने को धीरे से लक्षित करके कलाकारों के भीतर माध्यम को हटा दें।
  3. (महत्वपूर्ण कदम 1) चूंकि गोलाकार को हटाने का खतरा है, इसलिए 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे देखने से माध्यम को हटाने से पहले और बाद में माइक्रोवेल के भीतर स्फेरॉइड की संख्या की तुलना करके गोलाकारों के नुकसान के लिए नियंत्रण।
  4. ध्यान से टी-सेल निलंबन ड्रॉप-वार को कास्ट के ऊपर 0.5 सेमी के बारे में P200 पिपेट पकड़कर एगर उठे कास्ट के सीडिंग चैंबर में बीज करें।
  5. (महत्वपूर्ण कदम 2) टी-कोशिकाओं को जोड़ते समय स्फेरॉइड बाहर निकलने का खतरा रहता है। इसलिए, टी-कोशिकाओं को बहुत धीरे-धीरे और सीडिंग कक्ष से लगभग 0.5 सेमी ऊपर जोड़ना महत्वपूर्ण है।
    नोट: एक संभावना बाहर निकाल दिया बाहर गोलाकार की संख्या को कम करने के लिए सीडिंग चैंबर के एक कोने में पिपेट ओर इशारा करते हुए टी कोशिकाओं को जोड़ने से है, इस प्रकार केवल इस कोने में गोलाकार खतरे में डाल बाहर निकाल दिया जाएगा ।
  6. ध्यान से अच्छी तरह से थाली वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में15 मिनट के लिए जगह है।
  7. इनक्यूबेटर से अच्छी तरह से प्लेट लें और ताजा सेल कल्चर माध्यम (आरपीएमआई को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) जोड़ें, जो धीरे-धीरे इसे कुएं की दीवार के साथ पाइपिंग करके कास्ट किया जाता है।
  8. अच्छी तरह से थाली वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में ४८ घंटे के लिएरखो ।

3. टाइप I कोलेजन मैट्रिक्स में 3 डी सह-संस्कृति का एम्बेडिंग

  1. निष्प्रभावी प्रकार तैयार मैं कोलेजन
    1. सीरम फ्री बेस मीडियम (आरपीएमआई) के साथ स्टॉक कोलेजन को 3 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए पतला करें । पतला कोलेजन के हर 100 माइक्रोन के लिए, 10x पीबीएस के 11 माइक्रोन और 1.2 माइक्रोन 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (नाओएच) जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए बर्फ और इनक्यूबेट (बेअसर) पर रखें।
  2. अच्छी तरह से थाली झुकाव द्वारा पहले एक P1000 पिपेट के साथ agarose डाली आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें । फिर, धीरे-धीरे और ध्यान से दूसरे हाथ से झुका हुआ प्लेट रखते हुए पी 200 पिपेट के साथ सीडिंग चैंबर के एक कोने को धीरे-धीरे लक्षित करके कलाकारों के भीतर माध्यम को हटा दें।
    नोट: यहां, यह पूरी तरह से आग्नेय कलाकारों के आसपास सेल संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. ध्यान से बेअसर कोलेजन मैं मिश्रण ड्रॉप-वार एगर उठे कलाकारों के सीडिंग चैंबर में कास्ट के ऊपर 0.5 सेमी के बारे में P200 पिपेट पकड़ कर।
  4. 4 मिनट (35-माइक्रोवेल कास्ट) या 5 मिनट (81-माइक्रोवेल कास्ट) के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में तुरंत अच्छी तरह से प्लेट लगाएं।
    सावधानी: (महत्वपूर्ण कदम 3) यह कड़ाई से दिए गए इनक्यूबेशन समय को रखने के लिए महत्वपूर्ण है । अन्यथा, आक्रामक व्यवहार प्रजनन योग्य नहीं हो सकता है।
  5. अच्छी तरह से प्लेट उलटा और इसे 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में फ़्लिप छोड़ दें।
    नोट: डाले सतह तनाव के कारण अच्छी तरह से थाली के नीचे से जुड़े रहेंगे । यदि उच्च सीरम एकाग्रता के साथ विशेष सेल संस्कृति माध्यम (उदाहरण के लिए, आरपीएमआई 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) का उपयोग किया जाता है, तो सतह तनाव बढ़ाने के लिए कुएं में माध्यम को हटाने के बाद 1x पीबीएस के साथ एक अतिरिक्त धोने का कदम आवश्यक हो सकता है।
  6. अच्छी तरह से थाली को इनक्यूबेटर से बाहर निकालकर वापस उलटा करें। नए सेल कल्चर मीडियम (आरपीएमआई को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और १०० यूनिट्स/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सप्लीमेंट) जोड़ें, जो धीरे-धीरे कुएं की दीवार के साथ पाइपिंग करके कास्ट को उठाया गया है ।
  7. अच्छी तरह से थाली वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में ४८ घंटे के लिए रखो ।

4. साइटोटॉक्सिकिटी परख

  1. 2% भ्रूण गोजातीय सीरम प्रति agarose डाली के साथ 1x PBS के 3 एमसीएल तैयार करें।
  2. 4 डी के लिए सह-संस्कृति के बाद, दूसरे हाथ से अच्छी तरह से प्लेट को थोड़ा झुकाकर एक P1000 पिपेट के साथ एगर उठे कास्ट के आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें।
    नोट: सह-संस्कृति की कुल समय अवधि अन्वेषक द्वारा तय की जानी है ।
  3. माइक्रोवेल से स्फेरॉइड को उखाड़ फेंकने के लिए सीडिंग चैंबर में पी1000 पिपेट के साथ 1x पीबीएस + 2% एफबीएस के 1 एमसीएल वितरित करें।
  4. अच्छी तरह से वॉल्यूम के साथ दो बार चरण 4.3 दोहराएं और इसे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 एस के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
  6. ध्यान से एक P1000 पिपेट के साथ सुपरनेट निकालें।
  7. 1x पीबीएस के 1 एमसीएल को 2% एफबीएस और सेंट्रलाइज के साथ 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए 300 x g पर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  8. वाशिंग स्टेप (चरण 4.7) दोहराएं।
  9. सुपरनेट निकालें और सेल वियोजन एंजाइमों के समाधान के 1 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. सेल समूहों को तोड़ने के लिए P200 पिपेट और पिपेट का उपयोग करें।
  11. कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 20मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  12. दोहराएं चरण 4.10।
    नोट: निरीक्षण करने के लिए सेल कल्चर डिश पर ~ 10 माइक्रोन बाहर लें और बीज करें (10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे) स्फेरॉइड ने एकल कोशिकाओं में कितनी अच्छी तरह अलग किया है। यदि आवश्यक हो, तो 5 मिनट और इनक्यूबेशन जोड़ें।
  13. पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (आरपीएमआई 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) और ट्यूब 3\u20124 बार उलटा करके मिश्रण करें।
  14. आरटी में 4 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रलाइज।
  15. एपोटोटिक कोशिकाओं के एनेक्सटिन वी धुंधला के लिए सुपरनैंट निकालें और कोशिकाओं को एफएक्सी बफर में फिर से खर्च करें।
    नोट: यहां से किसी भी FACS धुंधला और सेल विश्लेषण पर किया जा सकता है ।

5. आईएचसी सेक्शनिंग के लिए हाइड्रोक्सीथिल एगरजिंग प्रोसेसिंग जेल एम्बेडिंग

नोट: यहां एगर उठे डाले पैदा करने के लिए कम पिघलने वाले एगर उठे का उपयोग करने से बचना महत्वपूर्ण है।

  1. सह-संस्कृति के अंत में, अच्छी तरह से प्लेट को झुकाकर पहले P1000 पिपेट के साथ एगर उठे कास्ट के आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें। फिर धीरे-धीरे और ध्यान से दूसरे हाथ से झुका हुआ प्लेट रखते हुए पी 200 पिपेट के साथ सीडिंग चैंबर के एक कोने को धीरे से लक्षित करके कलाकारों के भीतर माध्यम को हटा दें।
  2. धीरे-धीरे पी 200 पिपेट के साथ सीडिंग चैंबर के एक कोने को धीरे से लक्षित करके सीडिंग कक्ष में पहले 10% फॉर्मेलेट करें। फिर एगर उठे कास्ट के बाहर 10% फॉर्मेलिन जोड़ें जब तक कि यह पूरी तरह से कवर न हो जाए। 1 डी के लिए 10% फॉर्मेलिन में एगरेग्याड कास्ट को ठीक करें।
  3. अगले दिन फॉर्मलिन निकालें।
  4. ध्यान से पिपेट 210 माइक्रोल (81-माइक्रोवेल कास्ट) या 100 माइक्रोल (35-माइक्रोवेल कास्ट) पूर्व-गर्म और तरलीकृत हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रोसेसिंग जेल (सामग्री की तालिकादेखें) ड्रॉप-वार कास्ट के ऊपर पी 200 पिपेट को पकड़कर एगर उठी कास्ट के सीडिंग चैंबर में।
  5. हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रसंस्करण जेल को आरटी में 10 मिनट के लिए जमना चाहिए।
  6. एगरेग्यारेड कास्ट को 1x पीबीएस में ट्रांसफर करें।
    नोट: लंबे भंडारण के लिए, प्रदूषण को रोकने के लिए 70% इथेनॉल में कास्ट को एम्बेड करें।
  7. एक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से जेल वर्गों को निर्जलित करें (1 घंटे प्रत्येक: 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल [3x परिवर्तन प्रत्येक])। फिर 1 घंटे के लिए एक समाशोधन समाधान 3x में स्पष्ट करें (उदाहरण के लिए, एलिफेटिक हाइड्रोकार्बन [जैसे, क्लियराइट], या जाइलीन), और पिघले हुए पैराफिन (प्रत्येक के लिए 3x) के साथ मैन्युअल रूप से या ऊतक प्रोसेसर में घुसपैठ करें। बाद में 5 माइक्रोन प्रति सेक्शन पर सेक्शन के लिए पैराफिन वैक्स में कास्ट को एम्बेड करें।
  8. जाइलीन में स्लाइड डालकर मोम निकालें, प्रत्येक के लिए 3x, फिर एक ग्रेडेड अल्कोहल श्रृंखला के माध्यम से ऊतक वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें: 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 1 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 30 एस के लिए 80% इथेनॉल और 30 एस के लिए 70% इथेनॉल, फिर पानी में रखें।
  9. 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक सब्जी स्टीमर में गर्मी प्रेरित एपिटोप पुनः प्राप्ति करें, इसके बाद 10 एमएम सोडियम साइट्रेट पीएच 6.0 समाधान में 20 मिनट ठंडा होता है और एच2ओ2के साथ एंडोजेनस पेरोक्सीडास को ब्लॉक करता है।
  10. सामान्य लक्ष्य सीरम के साथ वर्गों को ब्लॉक करें और उन्हें रातोंरात एंटी-सीडी 8 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1/25) में बेनकाब करें।
  11. एंटी-खरगोश-एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) लागू करें और 3,3'-Diaminobenzidine (डीएबी) क्रोमेजन का उपयोग करके धुंधला विकसित करें। 11% हैरिस हेमेटॉक्सीलिन समाधान के साथ काउंटरटाइन न्यूक्लियी (सामग्री की तालिकादेखें)।

6. सह-संस्कृति में स्वेरॉइड आक्रमण की निगरानी और विश्लेषण करना

नोट: कोलेजन I मैट्रिक्स में इमेजिंग स्फेरॉइड आक्रमण का समय-बिंदु अन्वेषक द्वारा तय किया जाना है। 10x आवर्धन के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल संस्कृति छवियों का अधिग्रहण करें। आदर्श समय बिंदु सेल लाइन पर निर्भर है परीक्षण किया जा रहा है, साथ ही ईसीएम घटक । कोलेजन जोड़ने के कुछ घंटों के भीतर कोलेजन में अधिक आक्रामक सेल लाइनें फैलना शुरू हो जाएंगी। चूंकि सह-संस्कृति में टी-कोशिकाएं बहुत शुरुआती समय-बिंदुओं पर स्पेरोइड से एग्रेस पर पूर्ण दृश्य को रोक सकती हैं, आम तौर पर छवियों को कोलेजन जोड़ने के बाद 0 एच (संदर्भ के रूप में), 24 एच और 48 एच पर लिया जाता है।

  1. स्फेरॉइड से बाहर आने वाले "स्पाइक्स" की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर आक्रामकता का मात्रा निर्धारित करें और/
    1. एक गोलाकार के "स्पाइक्स" की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर स्फेरोइड से "स्पाइक्स" की संख्या के रूप में आक्रमण का विश्लेषण करें।
      नोट: यह अन्वेषक द्वारा तय किया जाना है जो स्फेरॉइड से फलाव को "स्पाइक्स" माना जाता है। एक निर्णय मापदंड स्फेरॉइड के किनारे से मापा "स्पाइक" की लंबाई हो सकती है।
    2. स्फेरॉइड के आकार के सापेक्ष आक्रमण क्षेत्र के रूप में आक्रमण का विश्लेषण करें।
      1. कुल क्षेत्र (आक्रमण + गोलाकार क्षेत्र) की सीमा का पता लगाने के लिए फ्रीहैंड ड्रा टूल (छवि जे) का उपयोग करें।
      2. शीर्ष मेनू पर विश्लेषण करने पर क्लिक करें, फिर क्षेत्र माप प्रदर्शित करने के लिए उपाय पर क्लिक करें।
      3. कुल गोलाकार क्षेत्र की सीमा का पता लगाते हैं।
      4. शीर्ष मेनू पर विश्लेषण करने पर क्लिक करें, फिर क्षेत्र माप प्रदर्शित करने के लिए उपाय पर क्लिक करें।
      5. मापा परिणाम सूची को स्प्रेडशीट में कॉपी करें और सूत्र का उपयोग करके कुल आक्रमण/गोलाकार की गणना करें: कुल आक्रमण = कुल क्षेत्रफल/गोलाकार क्षेत्र ।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. निम्नलिखित तैयार करें।
    1. 1x पीबीएस के 2.3 एमएल और 10% फॉर्मेलिन के 2.7 एमएल का उपयोग करके 5.4% फॉर्मलिन (5 एमएल) तैयार करें।
    2. 1x पीबीएस के 50 एमएल और 10% ऑक्टोक्सिनॉल (आरटी में स्टोर) के 2.5 एमएल का उपयोग करके 0.5% ऑक्टोक्सिनॉल (50 एमएल) तैयार करें।
    3. यदि बफर (200 एमएल) 1x पीबीएस के 200 मिलीएल, 200 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 10% ऑक्टोक्सिनोल के 4 एमएल, 10% पॉलीसॉर्बेट 20 के 1 मिलियन (उपयोग से पहले आरटी तक गर्म; फिल्टर और स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर) का उपयोग करके तैयार करें।
    4. 5 एमएल का उपयोग करके अवरुद्ध समाधान (5 एमएल) तैयार करें यदि बफर और बकरी सीरम के 500 माइक्रोन (उपयोग से पहले आरटी तक गर्म)।
    5. 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड, ग्लास कवर्लिप्स, और बढ़ते मीडिया तैयार रखें।
  2. दिन 0
    1. एक आर्द्रीकृत कक्ष में आरटी में 5.4% फॉर्मलिन में रात भर स्फेरॉइड सहित पूरे एगर उठे कास्ट को ठीक करें।
  3. दिन 1
    1. अच्छी तरह से थाली झुकाव द्वारा एक P1000 पिपेट के साथ agarose डाली आसपास के सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें ।
    2. कोलेजन पैच को एक 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में स्थानांतरित करें, जो कोलेजन मैट्रिक्स के एक कोने को चिकना नुकीले टिप चिमटी के साथ एगर उठे के साथ कास्ट करता है और इसे एक एकल, आत्मविश्वासी आंदोलन में एगर उठे हुए कास्ट से छील जाता है।
      नोट: कोलेजन पैच आसानी से agarose डाली से अलग किया जाना चाहिए । अन्यथा, सीडिंग चैंबर के क्षेत्र में संस्कृति माध्यम को ध्यान से जोड़ने या एगर उठे हुए कलाकारों को उलटा करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे कोलेजन मैट्रिक्स को उखाड़ फेंकने के लिए अच्छी तरह से प्लेट को हिलाएं।
    3. 0.5% ऑक्टोक्सिनॉल के 250 माइक्रोन जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति अच्छी तरह से। आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
    4. ऑक्टॉक्सिनॉल को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान के 250 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 1 घंटे के लिए ब्लॉक ।
    5. इस बीच, प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (एंटी-केराटिन 8 के लिए कमजोर पड़ना: 1/500; फालोइडिन 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) अवरुद्ध समाधान में, अच्छी तरह से प्रति 250 μL के लिए गणना।
    6. समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और आर टी में रात भर इनक्यूबेशन के लिए एक आर्द्रीकृत कक्ष में चैंबर स्लाइड रखें।
  4. दूसरा दिन
    1. एस्पिरेशन करके समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें।
    2. अगर बफर के 300 माइक्रोन जोड़कर 3 बार धोएं और इसे आरटी में 5 मिनट के लिए बैठने दें।
      नोट: बस इसे बैठने दें, इसे शेकर पर रखने की कोई आवश्यकता नहीं है।
    3. समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें (एंटी-केराटिन 8 के लिए: एंटी-चूहा, कमजोर पड़ने 1/500)।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान को अवरुद्ध करने और आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट में माध्यमिक एंटीबॉडी के 250 μL जोड़ें। यहां से, नमूनों को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    5. एस्पिरेशन करके समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी को हटा दें।
    6. यदि बफर के 300 माइक्रोन के साथ 3 बार धोएं और इसे आरटी में 5 मिनट के लिए बैठने दें।
    7. 1x पीबीएस के साथ नमूनों को कुल्ला और यह आकांक्षी।
    8. ध्यान से कक्ष स्लाइड की दीवारों को हटा दें ताकि नीचे केवल ग्लास स्लाइड बनी रहे।
    9. एक ग्लास कवरलिप में बढ़ते मीडिया के कम से कम 200 माइक्रोल जोड़ें और धीरे-धीरे नमूने पर कवरस्लिप छोड़ दें।
      नोट: बुलबुले बनाने से बचें क्योंकि इससे छवि की गुणवत्ता प्रभावित होगी। बुलबुले को धीरे-धीरे 45 डिग्री कोण पर स्लाइड के लंबे किनारे पर कवर स्लिप रखकर या स्लाइड पर कवर स्लिप को धीरे-धीरे कम करके रोका जा सकता है।
    10. घुड़सवार नमूनों को किसी अंधेरे और सूखी जगह पर रखें और रात भर बैठने दें। इमेजिंग अगले दिन किया जा सकता है।
      नोट: कवरस्लिप शुरू में एक बार कोलेजन पैच पर रखा थोड़ा बदलाव हो सकता है । ग्लास स्लाइड कुछ मिनटों के लिए एक भी क्षेत्र पर बैठते हैं। कवरलिप नमूने को समतल करेगा ताकि समय के साथ ग्लास स्लाइड और कवरलिप के बीच कोई अंतर नहीं बचा होगा।

8. कोलेजन मैट्रिक्स से कोशिकाओं का अलगाव

  1. निम्नलिखित तैयार करें।
    1. सीरम युक्त सेल कल्चर मीडियम में 1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेस 4 तैयार करें (स्टोर एलिकोटेड कोलेजनेस 4 कमजोर पड़ने पर -20 डिग्री सेल्सियस)
    2. 1x पीबीएस में 2.5% बीएसए तैयार करें और इसके साथ सभी ट्यूबों और पिपेट टिप्स को कोट करें (उपयोग से पहले बीएसए समाधान को फ़िल्टर करें)।
    3. उपयोग से पहले बीएसए समाधान और सेल संस्कृति माध्यम को प्रीवार्म करें।
  2. 35-माइक्रोवेल एगरेज कास्ट से अधिकतम तीन कोलेजन मैट्रिस को पचाने के लिए कोलेजनेस 4 सॉल्यूशन (1 मिलीग्राम/एमएल) का 2 एमएल तैयार करें।
  3. 35-माइक्रोवेल एगर उठे से तीन 75 माइक्रोल कोलेजन मैट्रिस को 2.5% बीएसए प्री-लेपित 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। चिकना नुकीली टिप चिमटी के साथ agarose डाली के सीडिंग चैंबर के भीतर कोलेजन मैट्रिक्स के एक कोने को समझें और इसे एक एकल, आत्मविश्वासी आंदोलन में एगर उठे कास्ट से छील लें।
  4. बेवेल-कैंची के साथ एक P1000 टिप की नोक काट । 2.5% बीएसए के साथ शेष टिप को प्री-कोट करें और कोलेजन मैट्रिक्स को जितना संभव हो उतना ऊपर और नीचे पाइपिंग करके तोड़ दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब इनक्यूबेट।
  5. (महत्वपूर्ण कदम 4) हर 5 मिनट में, जांच करें कि कोलेजन मैट्रिक्स भंग हो गया है या नहीं। नमूना के 10 माइक्रोन लेने से पहले फिर से ऊपर और नीचे पिपेट करें और 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे अवलोकन के लिए सेल कल्चर डिश पर बीज करें। यदि आवश्यक हो तो एक और 5 मिनट जोड़ें।
  6. प्रीवारमेड सेल कल्चर मीडियम (डीएमईएम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) के 10 एमएल के साथ ट्यूब भरें। धीरे से ट्यूब 3 \ u20124 बार उलटा द्वारा मिश्रण ।
  7. आर टी में 4 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  8. ध्यान से सुपरनेट निकालें और वॉल्यूम के 2 एमएल छोड़ दें।
  9. (महत्वपूर्ण कदम 5) पहले अपकेंद्रित्र कदम के बाद 2 एमसीएल छोड़ दें क्योंकि अभी भी ट्यूब के नीचे उनके साथ कोशिकाओं को ले जाने वाले कोलेजन को असुंजित किया जा सकता है।
  10. हर बार सीरम युक्त सेल कल्चर मीडियम के 10 एमएल जोड़कर दो वॉशिंग स्टेप्स करें। सेंट्रलाइज हर बार आरटी में 4 मिनट के लिए 400 x g पर।
  11. अंतिम धोने के कदम के बाद, जितना संभव हो उतना माध्यम हटा दें और सिर्फ सेल पेलेट छोड़ दें।
  12. सेल डिसोसिएशन एंजाइमों के समाधान के 1 एमसीएल में सेल पेलेट को फिर से रिस्पेंड करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  13. सेल समूहों को तोड़ने के लिए P200 पिपेट और पिपेट का उपयोग करें।
  14. कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 20मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  15. दोहराएं चरण 8.13।
    नोट: 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करने के लिए सेल कल्चर डिश पर ~ 10 माइक्रोन आउट और बीज लें ताकि यह देखा जा सके कि स्फेरॉइड ने एकल कोशिकाओं में कितनी अच्छी तरह से अलग किया है। यदि आवश्यक हो, तो 5 मिनट और इनक्यूबेशन जोड़ें।
  16. सेल कल्चर मीडियम के 4 एमएल जोड़ें (डीएमईएम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) और ट्यूब 3 \ u20124 बार उलटा करके मिश्रण करें ।
  17. आरटी में 4 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रलाइज।
  18. सुपरनिट निकालें। यहां से आगे, FACS धुंधला या सेल संस्कृति प्रदर्शन किया जा सकता है।

9. कोलेजन मैट्रिक्स से आरएनए निष्कर्षण

  1. फिनोल (सामग्री की तालिकादेखें), 100% क्लोरोफॉर्म, 70% आरएनएएस-मुक्त इथेनॉल, आरएनए निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिकादेखें), आरएनएसई-मुक्त 1.5 एमएल ट्यूब, आरएनएसई-मुक्त 15 एमएल ट्यूब और आरएनएसई-मुक्त डीडीएच 2 ओ के साथ ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट तैयार करें।2
  2. 81-माइक्रोवेल एग्रिस से बारह 190 माइक्रोन कोलेजन मैट्रिस को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। चिकना नुकीली टिप चिमटी के साथ agarose डाली के सीडिंग चैंबर के भीतर कोलेजन मैट्रिक्स के एक कोने को समझें और इसे एक एकल, आत्मविश्वासी आंदोलन में एगर उठे कास्ट से छील लें।
    नोट: मैट्रिस को आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भी फ्रीज किया जा सकता है।
  3. 15 एमएल ट्यूब में कोलेजन मैट्रिस में फिनॉल (सामग्री की टेबलदेखें) के साथ 1 एमएल ग्वानिडिनियम थिओसाइनेट जोड़ें।
    नोट: फिनोल के साथ ग्वानिनियम थिओसाइनेट को कोलेजन मैट्रिस को पूरी तरह से कवर करना चाहिए।
  4. भंवर 10\u201220 s के लिए ट्यूबों
  5. मैट्रिस को 20 जी सुइयों और 5 एमएल सीरिंज के साथ तब तक समरूप करें जब तक कि वे पूरी तरह से भंग न हो जाएं।
  6. मैट्रिस को आरटी में 5 मिनट तक बैठने दें ।
  7. मैट्रिस में शुद्ध क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोल जोड़ें और ट्यूब को 15 एस के लिए सख्ती से हिलाएं।
  8. तुरंत मिश्रण को 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  9. मिश्रण को आरटी में कम से कम 5 मिनट के लिए बैठने दें जब तक कि चरण अलग न हो जाएं।
  10. 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर 1.5 एमएल ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें।
  11. 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोन के साथ एक नई 1.5 एमएल ट्यूब भरें।
    नोट: अपकेंद्रित्र के बाद जलीय चरण की मात्रा पर निर्भर (चरण 9.12 देखें। यह 500 माइक्रोन नहीं हो सकता है। 70% इथेनॉल की मात्रा जलीय चरण की मात्रा के बराबर होनी चाहिए।
  12. केंद्रीकृत नमूनों के ऊपरी जलीय चरण को 70% इथेनॉल से भरी ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  13. (महत्वपूर्ण कदम 6) ऊपरी चरण को हटाते समय फिनोल पृथक्करण के साथ ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट के नीचे परतों को परेशान न करें, क्योंकि इससे आरएनए दूषित हो जाएगा।
  14. एक आरएनए निष्कर्षण कॉलम में नमूना जोड़ें (आरएनए निष्कर्षण किट में शामिल, सामग्री की तालिकादेखें)। यहां से, कोशिकाओं से आरएनए शुद्धिकरण के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

3 डी सह-संस्कृति मॉडल चित्रा 1Aमें दिखाए गए विभिन्न परखों के लिए अनुमति देता है, जिसे आवश्यकतानुसार संयुक्त या संशोधित किया जा सकता है। हमारे स्थापित प्रयोगात्मक सेटअप में, ट्यूमर और टी कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए सह-संस्कारी किया जाता है जिसके बाद आक्रामक और/या प्रतिरोधी ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 1B)के चयन के लिए आक्रमण परख की दीक्षा होती है । 4 दिन आक्रमण की मात्रा की जाती है और "उत्तरजीवी" कोशिकाओं को कोलेजन मैट्रिक्स से अलग किया जाता है या सीधे आरएनए23 या मैट्रिक्स(चित्रा 1B)से डीएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया जाता है। एगरल्ड कास्ट के माइक्रोवेल के भीतर टाइप I कोलेजन में 3डी संस्कृति को एम्बेड करने से इमेज जे का उपयोग करके आक्रमण की निगरानी और विश्लेषण की अनुमति मिलती है ताकि पहले सॉफ्टवेयर के फ्रीहैंड ड्रा टूल का उपयोग करके कुल क्षेत्र का सीमांकन किया जा सके और फिर सीमांकित स्फेरॉइड क्षेत्र(चित्रा 2 ए)पर अनुपात की गणना की जा सके, और/या गोला छोड़ने वाले "स्पाइक्स" की संख्या की गणना करके । दो प्राथमिक मुरीन अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों (सेल लाइन 1 और सेल लाइन 2) का उपयोग करना, विभिन्न स्फेरॉयड आकार और आक्रामक व्यवहार को तदनुसार देखा और मात्रा निर्धारित की गई(चित्रा 2B)। सेल लाइन 1 एकल सेल आक्रमण के बराबर एक अधिक कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड गठन और "काँटेदार" आक्रमण दिखाता है, जबकि सेल लाइन 2 अधिक ढीले स्फेरॉइड बनाता है और एक सामूहिक आक्रमण पैटर्न(चित्रा 2C)दिखाता है। सह संस्कृति दो अलग ट्यूमर क्लोनल सेल लाइनों के साथ किया गया था एक ही समय में वरीयता प्राप्त(चित्रा 3A \u2012E)बाद में परख के दौरान उनकी बातचीत का पालन करने के लिए, और ट्यूमर कोशिकाओं और टी के साथ ट्यूमर गोलाकार गठन पर कोशिकाओं(चित्रा 3F \ u2012J)। आक्रामक व्यवहार के विस्तृत आकलन के लिए, इम्यूनोफ्लोर्सेंट स्टेनिंग(चित्र 4)किया गया था। एग्रिजर्जिंग कास्ट से कोलेजन मैट्रिक्स के अलग होने के बाद, अगर धुंधला हो जाता है, और ग्लास स्लाइड(चित्रा 4ए\u2012B)में स्थानांतरित किया जाता है, कॉन्फोकल इमेजिंग एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से किया गया था(चित्रा 4सी \u2012J)। एग्रिसेड कास्ट का आकार और जुड़ाव ट्यूमर और टी-कोशिकाओं(चित्रा 5)के बीच स्थानिक संबंध की मात्रा निर्धारित करने के लिए सीरियल सेक्शनिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए पैराफिन में पूरे 3डी कल्चर सिस्टम को एम्बेड करने की अनुमति देता है। अनुभाग में मौजूद टी-कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है और आगे सीडी 8(चित्रा 5डी, ई)के लिए यहां उदाहरण देने वाले सेल सतह मार्कर दाग द्वारा विशेषता है। टी कोशिकाओं है कि ट्यूमर स्फेरॉइड में घुसपैठ की है उन है कि स्पेरोइड की परिधि में बने रहे के सापेक्ष गिना जा सकता है । चित्रा 5डी, ई ट्यूमर सेल लाइन 1(डी) और सेल लाइनD2(ई)से उगाए गए ट्यूमर स्फेरॉइड में टी-कोशिकाओं की अलग घुसपैठ के उदाहरण दिखाता है। तालिका 1 परख के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप दिखाती है, और प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए प्रयोग के अंत में प्रतिनिधि और विश्लेषण योग्य नमूनों की उपज दिखाती है।

Figure 1
चित्रा 1: कार्यप्रवाह, विश्लेषण और प्रयोगों की समयरेखा। (A)एक 81 माइक्रोवेल और 35 माइक्रोवेल रबर मोल्ड 1x पीबीएस में 2% एग्रिस से भरे होते हैं ताकि मल्टीपल माइक्रोवेल के साथ एगरेग्मेंट कास्ट जेनरेट किया जा सके। रबर मोल्ड का व्यास 3.5 सेमी है। 35 माइक्रोवेल एगरेज कास्ट का आकार 13 एमएम x 8 एमएम है और 81 माइक्रोवेल कास्ट का साइज 13 एमएम x 13 एमएम है। एक ही पाइपिंग चरण में एगर उठे कास्ट के कक्षों में सेल सीडिंग पर स्फेरॉइड बनते हैं। टी कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति एक ही कलाकारों के भीतर किया जाता है । कार्यात्मक निगरानी और संभावित परख दिखाई जाती है। (ख)प्रयोगों की टाइमलाइन । ट्यूमर कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी किया जाता है जो दोनों कोशिका प्रकारों के बीच अधिकतम बातचीत के लिए अनुमति देता है। आक्रमण परख दो दिनों के बाद शुरू की जाती है। ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक और अस्तित्व फेनोटाइप के साथ-साथ टी-कोशिकाओं के प्रसार और अस्तित्व की निगरानी के लिए एंडपॉइंट विश्लेषण आगे दो दिनों के बाद किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आक्रमण का परिमाणीकरण। आक्रमण को छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके और प्रति स्फेरॉइड "स्पाइक्स" की संख्या गिनना। (क)कुल आक्रमण क्षेत्र की गणना कुल क्षेत्रफल के अनुपात के रूप में गोलाकार क्षेत्र में होती है । स्केल बार: 300 माइक्रोन (बी)दो अलग-अलग प्राथमिक मुरीन अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों (सेल लाइन 1 और 2) के उदाहरण विभिन्न आवर्धन और आक्रमण में विभिन्न आवर्धन और आक्रमण में टाइप I कोलेजन में। (ग)प्रति स्पाइक्स प्रति स्पाइक्स की संख्या की गणना करके आक्रमण का विश्लेषण किया जाता है (बाएं आरेख; त्रुटि सलाखों: सेल लाइन 1 के लिए 2.63, सेल लाइन 2 के लिए 1.47) और आक्रमण क्षेत्र की गणना के रूप में वर्णित (सही आरेख; त्रुटि सलाखों: सेल लाइन 1 के लिए 0.36, सेल लाइन 2 के लिए 1.28)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डाई लेबल ट्यूमर और टी कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति । (A\u2012E) दो अलग-अलग डाई-लेबल वाले प्राथमिक मुरीन अग्नाशय के कैंसर क्लोनल सेल लाइनों (हरे और लाल) और एक प्रतिनिधि माइक्रोवेल(B\u2012E)के बढ़ाया दृश्य का मिश्रण। (F\u2012J) पूर्व लेबल ट्यूमर (हरे) और टी कोशिकाओं (लाल) की सह संस्कृति । (G\u2012J) एक प्रतिनिधि माइक्रोवेल का बढ़ाया दृश्य ट्यूमर-टी-सेल सह-संस्कृति को ट्यूमर गोलाकार गठन पर दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला एगर उठे कास्ट से कोलेजन मैट्रिक्स को अलग करने के बाद किया गया था। (A\u2012B) धुंधला होने के बाद, कोलेजन पैच को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित कर दिया जाता है और ग्लास कवरस्लिप से ढका जाता है। (C\u2012F) आईएफ-दाग वाले कोलेजन पैच का उदाहरण जिसमें ट्यूमर के साथ(सी)होचस्ट,(डी)केराटिन 8,(ई)फीलॉइडिन और(एफ)ओवरले शामिल हैं। पैनल(G\u2012J)एक एकल स्फेरॉइड के संबंधित बढ़ाया दृश्य दिखाएं। स्केल बार = 300 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सेक्शनिंग। हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रसंस्करण जेल में डूबे 3 डी संस्कृति के साथ एगर उठे कास्ट को पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला करने के लिए सेक्शन और प्रोसेस किया गया था। (ए)पैराफिन ब्लॉक क्षैतिज खंड के लिए इस्तेमाल किया है कि एक ही कलाकारों के भीतर कई ट्यूमर सेल/टी सेल सह संस्कृतियों के धारावाहिक वर्गों को प्राप्त करने के लिए agarose डाली के नीचे से शुरू होता है; स्केल बार = 5 मिमी(बी)हेमटॉक्सीलिन और इओसिन-दाग वाले एक एगरेज़ कास्ट का खंड जिसमें ट्यूमर और टी-कोशिकाओं की 3 डी सह-संस्कृति होती है। स्केल बार: 1 मिमी(C)एगर उठे कलाकारों के भीतर एच एंड ई-दाग सह-संस्कृति का बढ़ाया दृश्य। टी-कोशिकाओं के सीडी 8 धुंधला सेल लाइन 1(डी)और सेल लाइन 2(ई)के साथ सह-सुसंस्कृत । C\u2012E = 200 μm में स्केल बार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटोकॉल विशिष्ट सेटअप कोशिकाओं वरीयता प्राप्त (प्रति कास्ट) विशिष्ट उपज
साइटोटॉक्सिकिटी परख 2x 81-माइक्रोवेल डाले 81,000 100,000 कोशिकाएं
आईएचसी परख 1x 81-माइक्रोवेल कास्ट 81,000 40 स्फेरॉइड
आक्रमण परख 2x 35-माइक्रोवेल डाले 35,000 50 स्फेरॉइड
यदि परख 2x 35-माइक्रोवेल डाले 35,000 50 स्फेरॉइड
कोलेजन से सेल अलगाव मैं 2x 35-माइक्रोवेल डाले 35,000 50,000 कोशिकाएं
कोलेजन मैं से आरएनए निष्कर्षण 12x 81-माइक्रोवेल डाले 243,000 400-600 एनजी/माइक्रोन

तालिका 1: प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप और उपज। तालिका प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप और प्रयोग के अंत में क्रमशः विश्लेषण योग्य नमूनों (कोशिकाओं, गोलाकार या आरएनए एकाग्रता की संख्या) की विशिष्ट उपज दिखाती है। आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; यदि = इम्यूनोफ्लोरेसेंस।

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Discussion

यहां प्रस्तुत विधि 3 डी ट्यूमर स्पेरोइड पीढ़ी का वर्णन करती है, जो टी-कोशिकाओं, सेल-आधारित कार्यात्मक और आणविक परख के साथ सह-संस्कृति की अनुमति देती है, साथ ही एक ही डिवाइस का उपयोग करके विभिन्न प्रकार की निगरानी और विश्लेषण संभावनाओं की अनुमति देती है। हमारे दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ यह है कि यह एक अलग परख के लिए 3 डी संस्कृति के हस्तांतरण की आवश्यकता नहीं है और परख भर में 3 डी संस्कृति की अखंडता को बनाए रखता है ।

यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह को आवश्यकतानुसार संशोधित किया जा सकता है। गोलाकार गठन, टी-सेल सह-संस्कृति या साइटोटॉक्सिकिटी परख के लिए इनक्यूबेशन बार, विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों या सेल लाइनों के लिए बदलने की आवश्यकता हो सकती है।

पूरे परख में कुछ कदम हैं, जिनके लिए प्रोटोकॉल का बारीकी से पालन करने की आवश्यकता होती है। ये सामान्य रूप से हैं: सह-संस्कृति के लिए दूसरी सेल लाइन जोड़ने से पहले सेल संस्कृति माध्यम को हटाना, साथ ही ईसीएम या हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रसंस्करण जेल में 3 डी संस्कृति को एम्बेड करना। अच्छी तरह से प्लेट को झुकाकर और माइक्रोपिपेट के साथ कक्ष के एक कोने को लक्षित करके सीडिंग चैंबर के माध्यम को धीरे-धीरे और सावधानीपूर्वक हटाने के लिए यह बिल्कुल महत्वपूर्ण है। जब तक एगर उठे हुए डाले में कोशिकाएं होती हैं, हम हमेशा पाइपेटर का उपयोग करने के बजाय माइक्रोपिपेट के साथ कुएं में किसी भी माध्यम को हटाने की सलाह देते हैं। माइक्रोवेल में कोशिकाओं को बाहर निकालने से रोकने के लिए ईसीएम या हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे प्रसंस्करण जेल में एक दूसरी सेल लाइन और एम्बेडिंग को धीरे-धीरे और ड्रॉप-वार करने की आवश्यकता है। कोलेजन आक्रमण परख का सबसे महत्वपूर्ण कदम कुओं के साथ अच्छी तरह से थाली में डाले उलटा करने से पहले इनक्यूबेशन बार है । समय को कम करने के कारण कोलेजन को कलाकारों से बाहर निकलना पड़ सकता है, और समय से अधिक होने से संस्कृति को माइक्रोवेल के नीचे दबाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप असमान रूप से वितरित गोलाकार आक्रमण हो सकता है। कास्ट को उलटा करने से माइक्रोवेल्स में कोशिकाएं पॉलीमराइज और जमने से पहले लिक्विड कोलेजन में पूरी तरह से डूबने में सक्षम हो जाते हैं । एगर उठे कास्ट और अच्छी प्लेट के प्लास्टिक बॉटम के बीच सतह तनाव, 3 डी स्फेरॉइड आक्रमण के दौरान "हैंगिंग-ड्रॉप"15,,24 उत्पन्न करता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेशन बार डाले को पलटने से पहले टाइप I कोलेजन में एम्बेड करने के लिए स्थापित किया गया है। अन्य ईसीएम घटकों के साथ, इस चरण को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। ध्यान दें, अवशिष्ट मीडिया को पूरी तरह से हटाने के लिए माइक्रोवेल में मौजूद कोशिकाओं के एक अनजाने नुकसान से बचने का प्रयास नहीं किया जाना चाहिए । इस अवशिष्ट मीडिया के परिणामस्वरूप जोड़ा ECM के एक मामूली कमजोर पड़ने में । अन्य परख प्रणालियों से विश्लेषण और अनुकूलन के लिए इस पर विचार किए जाने की आवश्यकता है ।

सह संस्कृति यहां वर्णित एक अधिकतम ट्यूमर के लिए अनुमति देता है/ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण से पहले टी सेल बातचीत परख है: ट्यूमर और टी कोशिकाओं को सह प्रकार मैं कोलेजन में एंबेडेडिंग से पहले 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे है और फिर अगले दो दिनों में जीवित और आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान(चित्रा 1B)। ध्यान दें, जब सह संस्कृति शुरू की गई थी, जबकि टी कोशिकाओं कोलेजन मैं में फिर से निलंबित कर दिया गया था, टी कोशिकाओं ट्यूमर सेल आक्रमण और साइटोटॉक्सिकिटी पर एक प्रभाव दिखाने में विफल रहा । यह प्रभाव टी-कोशिकाओं को कोलेजन में अधिक वितरित किए जाने और इस प्रकार गोलाकारों के चारों ओर कम केंद्रित होने के कारण हो सकता है। यह पता चलता है कि सह के दो दिनों के दौरान ट्यूमर और टी कोशिकाओं के बीच सीधी बातचीत-संस्कृति आक्रमण परख से पहले टी के आकलन के लिए महत्वपूर्ण है ट्यूमर कोशिकाओं पर सेल मध्यस्थता प्रभाव ।

फिर भी, इस 3D मॉडल के कुछ फायदे नुकसान के साथ आते हैं। यह उच्च-थ्रूपुट सेटिंग कोशिकाओं को एक पाइपिंग चरण में एगर उठे हुए में आसान और त्वरित सीडिंग की अनुमति देती है, जिसके परिणामस्वरूप एक कलाकारों के भीतर समान रूप से आकार के स्फेरॉइड की एक भीड़ होती है। हालांकि, चूंकि गोलाकार सभी एक ही कलाकारों के भीतर स्थित हैं, इसलिए उन्हें सीडिंग कक्ष के भीतर सेल संस्कृति माध्यम को हटाने के दौरान और सह-संस्कृति के लिए टी-कोशिकाओं को जोड़ते समय आसानी से हटाया जा सकता है। इसलिए, प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए उपज की मात्रा दृढ़ता से तकनीकी कौशल और अन्वेषक के अनुभव पर निर्भर है, लेकिन यह भी परख के प्रकार पर प्रदर्शन किया जा रहा है । जैसा कि तालिका 1 से पता चलता है, प्रयोग के अंत में लगभग 50% के स्फेरॉइड के संभावित नुकसान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, सीडिंग चरण के दौरान, कोशिकाएं सीडिंग कक्ष के क्षेत्र में समान रूप से वितरित नहीं हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एगर उठे कास्ट के भीतर कम या ज्यादा प्रतिनिधि स्फेरॉइड होते हैं। हमारे अनुभव से, यह प्रभाव एगरेज़ कास्ट के आकार के साथ बढ़ता है। तदनुसार, प्रयोग की योजना बनाते समय प्रतिकृति पर विचार किया जाना चाहिए।

3 डी प्रणाली के भीतर कोशिकाओं की स्थानिक बातचीत का आकलन समय चूक इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है, जो इस मॉडल में एक और निगरानी विकल्प प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, माइक्रोवेल का छोटा व्यास और बीज कोशिकाओं के लिए एकल पाइपिंग कदम, एकल सेल क्लोनिंग करने के लिए उपयुक्त हैं। अंत में, माइक्रोवेल के लिए आवश्यक कोशिकाओं की छोटी संख्या और 3 डी प्रणाली की उच्च थ्रूपुट सुविधा के कारण रोगी के नमूनों (जैसे बायोप्सी से) का विश्लेषण परख में किया जा सकता है। ट्यूमर सेल/टी-सेल इंटरैक्शन की जांच के लिए उत्तेजक या अवरुद्ध दवाओं (जैसे एंटी-पीडी-1 या एंटी-पीडी-एल1) को शामिल करना परख का तार्किक विस्तार है ।

अंत में, यहां प्रस्तुत 3 डी स्फेरॉइड सह-संस्कृति मॉडल जैविक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में कैंसर सेल आक्रमण और सह-सुसंस्कृत टी-कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिकिटी की निगरानी के लिए एक लचीला ढांचा प्रदान करता है। 3 डी संस्कृति की अखंडता को बनाए रखते हुए परिणामी क्रॉसटॉक की कल्पना की जा सकती है और इस प्रकार ट्यूमर सेल - टी-सेल इंटरैक्शन में मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम वर्जिनी ओरी, सहायक चर्चा और 3 डी सह संस्कृति मॉडल के दृष्टिकोण पर सलाह के लिए पीएचडी का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी IHC अनुभाग के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एलिजाबेथ जोंस का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन को DFG (ड्यूश Forschungsgemeinschaft) से आईएल (ली 2547/4-1) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से एडब्ल्यू (R01 CA2) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था 31291), एटीआर (R01 CA205632), GWP (R01 CA218670) के लिए, और कैंसर केंद्र के कोर ग्रांट (P30 CA51008) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

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References

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