Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

Den presenterade metoden utvärderar samtidigt cancer cell invasion i 3D sfäroid analyser och T-cell cytotoxicitet. Sfäroider genereras i en byggnadsställning-fri agaros multi-microwell rösterna. Samkultur och inbäddning i typ I kollagen matris utförs inom samma enhet som gör det möjligt att övervaka cancer cell invasion och T-cells medierad cytotoxicitet.

Abstract

Betydande framsteg har gjorts vid behandling av cancer med immunterapi, även om ett stort antal cancerformer fortfarande är resistenta mot behandling. Ett begränsat antal analyser möjliggör direkt övervakning och mekanistiska insikter i samspelet mellan tumör och immunceller, bland vilka, T-celler spelar en viktig roll i verkställandet av det cytotoxiska svaret hos det adaptiva immunsystemet till cancerceller. De flesta analyser är baserade på tvådimensionella (2D) samkultur av celler på grund av den relativa användarvänlighet men med begränsad representation av den invasiva tillväxt fenotyp, en av kännetecknen för cancerceller. Nuvarande tredimensionella (3D) samkultur system antingen kräver särskild utrustning eller separat övervakning för invasion av co-odlade cancerceller och interagerande T-celler.

Här beskriver vi ett tillvägagångssätt för att samtidigt övervaka invasiva beteende i 3D av cancer cell sfäroider och T-cell cytotoxicitet i samkultur. Sfäroidbildning drivs av förbättrade cell-cell interaktioner i byggnadsställning-fria agaros microwell kastar med U-formade bottnar. Både T-cells samkultur och cancer cell invasion i typ I kollagen matris utförs inom mikrobrunnar av agarose kastar utan att behöva överföra cellerna, därmed upprätthålla en intakt 3D-co-kultur system i hela analysen. Kollagenmatrisen kan separeras från agarosgjuten, vilket möjliggör immunofluorescens (IF) färgning och för konfokal avbildning av celler. Även celler kan isoleras för ytterligare tillväxt eller utsättas för analyser som för genuttryck eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Slutligen kan 3D-samkultur analyseras av immunohistokemi (IHC) efter inbäddning och snittning. Möjliga modifieringar av analysen inkluderar förändrade sammansättningar av den extracellulära matrisen (ECM) samt införandet av olika stromala eller immunceller med cancercellerna.

Introduction

Trots betydande förbättringar i cancer immunterapi under det senaste decenniet, vår mekanistiska förståelse av känslighet och resistens mot behandlingar är fortfarande ganska dålig1. Det är väletablerat att tumörer visar betydande heterogenitet, och att de dynamiska interaktionerna av tumörcellerna med deras mikromiljö samt med immuncellerna, inverkan tumörcelldöd, invasivt beteende och svar på behandlingar som inkluderar immunterapi1,2,3. Som ena armen av det adaptiva immunsystemet verkställer T-celler cellspecifik cytotoxicitet. Analysen av T-cellsigenkänning och svar på cancerceller ger mekanistiska insikter i resistens och känslighet för immunmodulerande behandlingar.

In vitro-modellering och övervakning av interaktioner mellan cancer och T-celler i en lämplig miljö har varit utmanande och hittills har resulterat i begränsade mekanistiska insikter. De flesta cellbaserade analyser förlitar sig på en tvådimensionell (2D) miljö, som saknar nyckelfunktioner som är kritiska för rekapitulering av den tredimensionella (3D) in vivo fysiologi4,5,6, nämligen rumsliga cell-cell interaktioner, kontakt med extracellulära matrisen (ECM)7, dynamisk metabolisk efterfrågan, ökad hypoxi på grund av masstillväxt8, och effekter av tumören mikromiljö (TME)9. Å andra sidan finns det fortfarande ett antal brister med de för närvarande används tredimensionella (3D) samkultur och invasion assay system: (1) den tidskrävande karaktär sfäroid generation och skörd5,10, (2) bristen på kontroll över sfäroid storlek, form och celltäthet11,12, (3) de låg-genomströmning typ analyser, (4) kravet på särskild utrustning13,14, (5) behovet av att överföra samkulturen i distinkta miljöer för olika analyser15,16,17. I synnerhet leder överföring av en samkultur assay ofta till störningar av sfäroider och förlust av samkultur integritet. Detta gäller speciellt för "lösa" sfäroider med minskad cell-cell vidhäftning. Till exempel, de flesta 3D-invasion assays kräver att sfäroider skördas efter deras första bildande och sedan återsuspenderade i ECM14,15,16. Detta resuspension steg resulterar i en förlust av kontroll över avståndet mellan sfäroider. Eftersom avståndet mellan tumör sfäroider påverkar deras invasiva beteende, denna förlust av kontroll införs hög inter-assay varians och minskar reproducerbarhet. Vidare är tillämpningen av cellfraktionationsanalyser genom på varandra följande centrifugeringssteg för bedömning av de perifera och tumörsfäroidinfiltrera immuncellerna begränsad till tumörcellpopulationer som genererar stabilare sfäroider17.

Koncept och förhållningssätt

Vårt tillvägagångssätt tar upp de ovan nämnda bristerna med hjälp av en "Allt-i-ett"—3D sfäroid samkultur modell, som inte kräver överföring av sfäroider för efterföljande analyser. Vi anpassade en spheroid formation enhet (se Tabell över material) för att generera en analys för samtidigt övervaka invasiva beteende av cancerceller och cytotoxicitet av co-odlade T-celler. Denna metod är användarvänlig, billig och möjliggör snabb och enkel hantering i en relativt hög genomströmning 3D-inställning. Beroende på vilken typ av enhet som används, upp till 81 stora likformigt stora sfäroider kan genereras i en enda pipettering steg med kontroll över den enskilda sfäroidstorleken genom att ändra antalet celler sådd. Sfäroidbildningen tvingas fram genom förstärkta cell-cell interaktioner i byggnadsställningsfria agaros multi-well-gjutna med U-formade bottnar. Vi anpassade detta 3D-system för dynamiska cellbaserade funktionella studier samt endpoint molekylära och biokemiska analyser som inkluderar fluorescens aktiverad cellsortering (FACS), immunofluorescens (IF) eller immunohistokemi (IHC) färgning samt genuttrycksanalys av den intakta 3D-samkulturen.

För funktionellastudier , inbäddning sfäroider i typ I kollagen inom agaros kastar resulterar i invasion av cancerceller från ekvidanta sfäroider och tillstånd övervakning väsentliga cellinje-specifika funktioner, såsom encelliga vs. kollektiv cell migration18,19. Vidare separeras kollagenmatrisen lätt från agarosgjuten, vilket resulterar i en 1\u20122 mm tjock lapp som innehåller flera sfäroider, som kan bearbetas ytterligare för IF-färgning och avbildning genom konfokalmikroskopi. Detta kan avslöja distinkt cell invasion och cell-matris interaktioner i en hög genomströmning screening. Även celler i kollagenmatrisen kan isoleras efter kollagenslutning och encellig dissociation för efterföljande cellodling eller analys.

För IHC-analys av sfäroider, efter fixering och snittning av agarosgjuten, är proteiner eller andra molekyler av intresse detekterbara samtidigt som de geografiska positionerna hos sfäroiderna bibehålls. I det tillvägagångssätt som beskrivs här, är sfäroider direkt inbäddade i Hydroxyethyl agaros bearbetning gel inom agarose rösterna och gelen fungerar som ett "lock" för att behålla sfäroiderna i botten av mikrobrunn. Efter paraffininbäddning av agarosgjuten20utförs seriell horisontell snittning med den nedersta av gjutna som utgångspunkt.

Detta tillvägagångssätt kontrasterar med konventionellA IHC-snittning av sfäroider som kräver skörd av celler innan inbäddning i Hydroxyethyl agarose bearbetning gel21 och riskerar störningar av sfäroider därmed förlora den rumsliga arrangemang av celler. Också cell fraktionering genom centrifugeringen för bedömning av huruvida immunceller infiltrerade eller förblev perifera till tumör sfäroider17 undviks genom direkt inbäddning.

Vidare kan 3D-samkultur utföras genom att blanda tumör- stromal eller immunceller, och därmed studera tumörcellsöverhör eller rekapitulera olika tumörmikromiljöer för analys av cell-cell interaktioner inklusive samkulturer med endotelceller16.

Denna 3D sfäroida co-kultur inställning kan användas för att utföra samkultur av olika celltyper som finns i tumören mikromiljö och att bedöma effekterna av förändrade ECM element. Förutom typ I kollagen, andra ECM komponenter (t.ex., matrigel, matrigel /kollagen blandningar, fibronectin), kan användas eftersom tumörcell invasionen påverkas av överflödet av olika substrat22. Också, mikrobrunnarna i agaros gjutna är lämpliga för sfäroidbildning av primära cellinjer och för celler med låg cell-cell adhesion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En lista och förklaring av några ofta använda ord i hela protokollet finns i Tilläggsfil 1.

1. Generering av sfäroider

  1. Preparera och autoklavera 2% agaros i 1x PBS (t.ex., 1 g agaros i 50 mL av 1x PBS) och autoklav 35- och 81-microwell gummiformar.
    FÖRSIKTIGHET: Undvik att använda lågsmältnings uppstod för att generera de agaros gjutna för IHC-bearbetning.
  2. Förbered agarose avgjutningar
    OBS: 35-mikrobrunnar används för invasion, immunofluorescens (IF) och cellisoleringsanalyser. 81-mikrobrunnsgjut används för cytotoxicitet, immunohistokemi (IHC), cellisolering och RNA-utvinningsanalyser.
    1. Efter agaros har autoklaveras, låt smält agaros svalna till ca 60\u201270 °C. I en cellkultur huva, använd aseptisk teknik och pipetten 500 μL av smält agarose till en 81-microwell gummi mögel per brunn eller 330 μL i en 35-microwell gummi mögel per brunn.
      FÖRSIKTIGHET: Undvik att skapa bubblor medan blandning eller pipettering agaros. Ta bort eventuella bubblor genom att försiktigt pipettera.
    2. Efter agarose är stelnat, försiktigt flex gummiformen för att ta bort agarose rösterna från den. Placera härmed händerna ovanför lämplig brunnsplåt och låt agarosgjutet släppa rakt in i en brunn av brunnsplattan.
      OBS: Flex gummiformen vid olika positioner för att undvika över böjning. Det kan vara bra att böja gummi mögel och tryck försiktigt från botten på samma gång.
    3. För att jämvikt agaros avgjutningar, tillsätt cellodling medium, bestående av DMEM kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (2,5 mL/well för 12-väl platta och 1 mL/well för 24-väl platta). Sätt brunnsplattan i en inkubator för cellodling (37 °C, 5 % CO2) och inkubera i 1 h.
  3. Under tiden, förbereda cellkultur för sådd.
    OBS: Det totala cellsåddtalet per agarosgjuten ska beslutas av prövaren. För murine primära bukspottskörteln cancer cellinjer, 35.000 celler/35-microwell rösterna och 81,000 cells/81-microwell rösterna (i genomsnitt 1000 celler/sfäroider) är seedade för alla följande analyser. Den genomsnittliga diametern på en sfäroid är ca 150\u2012200 μm efter 48 h.
  4. Ta bort cellodlingsmedium som omger agarospjugen med en P1000-pipett först genom att luta brunnsplattan. Ta sedan försiktigt bort mediet i såkammaren.
  5. Försiktigt utsäde den beredda tumörcell suspension drop-wise in i cellen sådd kammaren. Sätt försiktigt tillbaka brunnsplattan i cellodlingsinkubatorn (37 °C, 5 % CO2) i 15 min.
    OBS: Under detta steg cellerna kommer att bosätta sig i mikrobrunnar av agaros rösterna.
  6. Tillsätt ytterligare medium på utsidan av agarosgjuten (2,5 mL/brunn för 12-brunnsplatta och 1 mL/brunn för 24-brunnsplatta).
  7. Sätt tillbaka brunnsplattan i inkubatorn för cellodling (37 °C, 5 % CO2) i 48 h.
    OBS: Vanligtvis tar det upp till några timmar för cellerna att bilda sfäroider i mikrobrunnarna. I allmänhet är solid tumör cell sfäroider bildas efter 24 h och är stabila efter 48 h. Detta kan dock variera mellan olika cellinjer. Byt vid behov cellkulturmedium genom att försiktigt luta brunnsplattan med agarosgjutningarna och ta bort det omgivande cellodlingsmediet med en P1000-pipett. Tillsätt sedan försiktigt färskt medium genom pipettering det längs väggen i brunnen. Vanligtvis är det inte nödvändigt att ändra media inom rösterna på grund av dess lilla volym och risken för att ta bort sfäroiderna.

2. Samkultur med T-celler

  1. Resuspend det erforderliga antalet T-celler i 75 μL (35-microwell gjutna) eller i 190 μL (81-microwell gjutna) av lämplig T-cell odlingsmedium (RPMI kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 100 enheter/mL penicillin/streptomycin).
  2. Ta bort cellodlingsmediet som omger agarospjulet med en P1000-pipett först genom att luta brunnsplattan. Ta sedan långsamt och försiktigt bort mediet inom gjutet genom att försiktigt rikta in ett hörn av såddkammaren med en P200-pipett samtidigt som den väl plattan lutas med den andra handen.
  3. (Kritiskt steg 1) Eftersom det finns en risk för att ta bort sfäroider, kontroll för förlust av sfäroider genom att jämföra antalet sfäroider inom mikrobrunnarna före och efter att ha tagit bort mediet genom att titta under mikroskopet vid 10x förstoring.
  4. Utsäde försiktigt T-cellsupphängningen droppvis in i såddkammaren i agaros gjutna genom att hålla P200 pipetten ca 0,5 cm ovanför gjutna.
  5. (Kritiskt steg 2) Det finns risk för att spola ut sfäroiderna samtidigt som T-cellerna tillsätts. Därför är det kritiskt att lägga till T-cellerna mycket långsamt och ca 0,5 cm ovanför såddkammaren.
    OBS: En möjlighet att minska antalet spolade ut sfäroider är genom att peka pipetten till ett hörn av såddkammaren samtidigt som T-cellerna tillsätts, vilket innebär att endast riskera de sfäroider i detta hörn som ska spolas ut.
  6. Placera försiktigt tillbaka brunnsplattan i cellkulturinkubatorn (37 °C, 5 % CO2) i 15 min.
  7. Ta väl-plattan ut från inkubatorn och tillsätt färsk cell kultur medium (RPMI kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 100 enheter/mL penicillin/streptomycin) runt agaros gjutna genom långsamt pipettering det längs väggen i brunnen.
  8. Sätt tillbaka brunnsplattan i cellodlingsinkubatorn i 48 h.

3. Ingjutning av 3D-samkultur i typ I kollagenmatris

  1. Förbered neutraliserat kollagen typ I
    1. Späd beståndet kollagen med serum fria bas medium (RPMI) till en slutlig arbetskoncentration på 3 mg/mL. För varje 100 μL utspädd kollagen, tillsätt 11 μL av 10x PBS och 1,2 μL 1 M natriumhydroxid (NaOH).
    2. Håll på is och inkubera (neutralisera) i 1 h.
  2. Ta bort cellodlingsmediet som omger agarospjulet med en P1000-pipett först genom att luta brunnsplattan. Ta sedan långsamt och försiktigt bort mediet inom gjutet genom att försiktigt rikta in sig på ett hörn av såddkammaren med en P200-pipett samtidigt som den väl plattan är lutad med den andra handen.
    OBS: Här är det kritiskt att helt ta bort cellodlingsmediet som omger agarosgjutet.
  3. Försiktigt pipettera det neutraliserade kollagenet jag blandar drop-vis i såddkammaren i agarosgjuten genom att hålla P200-pipetten ca 0,5 cm ovanför gjutet.
  4. Sätt genast brunnsplattan i cellodlingsinkubatorn i 4 min (35-mikrobrunn) eller 5 min (81-mikrobrunn).
    VAR FÖRSIKTIG: (Kritiskt steg 3) Det är kritiskt att strikt hålla sig till den givna inkubationstiden. Annars kan det invasiva beteendet inte vara reproducerbart.
  5. Invertera brunnsplattan och låt den vändas i inkubatorn i 1 h.
    OBS: Avgjutningarna kommer att stanna fastsatt i botten av brunnsplattan på grund av ytspänning. I fall särskilda cell kultur medium med hög serumkoncentration (t.ex., RPMI kompletteras med 20% fetala nötkreatur serum) används, en ytterligare tvättsteg med 1x PBS efter att ha tagit bort mediet i brunnen kan vara nödvändigt att öka ytspänningen.
  6. Ta ut brunnsplattan från inkubatorn och invertera den tillbaka. Lägg till färskt cellkulturmedium (RPMI kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 100 enheter/mL penicillin/streptomycin) runt agarose rösterna genom långsamt pipettering det längs väggen i brunnen.
  7. Sätt tillbaka brunnsplattan i cellkulturinkubatorn i 48 h.

4. Cytotoxicitet analys

  1. Förbered 3 mL av 1x PBS med 2% fetala nötkreatur serum per agaros gjutna.
  2. Efter samkultur i 4 d, ta bort cellodlingsmediet som omger agarospjugen med en P1000-pipett genom att lätt luta brunnsplattan med den andra handen.
    OBS: Den totala tidsperioden för samkultur ska beslutas av utredaren.
  3. Fördela 1 mL på 1x PBS + 2% FBS med en P1000-pipett i såkammaren för att rubba sfäroiderna från mikrobrunnarna.
  4. Upprepa steg 4,3 två gånger med volymen i brunnen och överför den till ett 15 mL-rör.
  5. Centrifugera röret vid 300 x g i 10 s vid rumstemperatur (RT).
  6. Ta försiktigt bort supernatanten med en P1000-pipett.
  7. Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL på 1x PBS med 2% FBS och centrifug vid 300 x g i 1 min vid RT.
  8. Upprepa tvättsteget (steg 4.7).
  9. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 mL cell dissociation enzymer lösning (se Tabell of Materials).
  10. Använd en P200-pipett och pipetten uppåt och nedåt för att bryta cellklustren.
  11. Inkubera cellerna i 20 min i cellodlingsinkubatorn (37 °C, 5% CO2).
  12. Upprepa steg 4.10.
    OBS: Ta ~ 10 μL ut och utsäde på en cellodling skålen att observera (under mikroskopet vid 10x förstoring) hur väl sfäroiderna har dissociated i enstaka celler. Tillsätt vid behov 5 min ytterligare inkubation.
  13. Tillsätt 4 mL av full cell odling medium (RPMI kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 100 enheter/mL penicillin/streptomycin) och blanda genom att invertera röret 3\u20124 gånger.
  14. Centrifugera vid 400 x g i 4 min vid RT.
  15. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i FACS buffert för Annexin V färgning av apoptotiska celler.
    OBS: Härifrån på alla FACS färgning och cellanalys kan utföras.

5. Hydroxyetyl agaros bearbetning gel inbäddning för IHC snittning

OBS: Här är det avgörande att undvika att använda lågsmältande agaros för att generera de agaros avgjutningar.

  1. I slutet av samkulturen, ta bort cellodlingsmediet som omger agarosgjuten med en P1000-pipett först genom att luta brunnsplattan. Ta sedan långsamt och försiktigt bort mediet inom gjutet genom att försiktigt rikta in ett hörn av såddkammaren med en P200-pipett samtidigt som den väl plattan lutas med den andra handen.
  2. Långsamt pipettera 10% formalin först i såddkammaren genom att försiktigt rikta ett hörn av såddkammaren med en P200-pipett. Lägg sedan till 10% formalin till utsidan av den agaros gjutna tills den är helt täckt. Fixera agaros gjutna i 10% formalin för 1 d.
  3. Ta bort formalin på nästa dag.
  4. Försiktigt pipetter 210 μL (81-microwell gjuten) eller 100 μL (35-microwell gjutna) av förvjuvade och flytande hydroxyethyl agaros bearbetning gel (se tabell av material) droppvis in i såningskammaren i agaros gjutna genom att hålla P200 pipetten ca 0,5 cm ovanför gjutna.
  5. Låt hydroxyetylen agaros bearbetningsgel stelna i 10 min vid RT.
  6. Överför agarose rösterna till 1x PBS.
    OBS: För längre förvaring, bädda in gjuten i 70% etanol för att förhindra kontaminering.
  7. Torka gelsektionerna genom en etanolserie (1 h vardera: 70 % etanol, 80 % etanol, 95 % etanol, 100 % etanol [3x ändrar vardera]). Rensa sedan i en röjningslösning 3x i 1 h var (t.ex. alifatiska kolväten [t.ex., Clearit], eller xylener), och infiltrera med smält paraffin (3x i 1 h vardera), antingen manuellt eller i en vävnads processer. Bädda in gjutet i paraffinvax för efterföljande snittning vid 5 μm per sektion.
  8. Ta bort vax genom att sätta diabilder i xylener, 3x i 3 min vardera, sedan rehydrera vävnad sektioner genom en graderad alkohol serie: 100% etanol för 2 min, 95% etanol för 1 min, 80% etanol för 30 s och 70% etanol för 30 s, sedan placera i vatten.
  9. Utför värmeinducerad epitophämtning i en grönsaksångare vid 100 °C i 20 min, följt av 20 min kylning i en 10 mM natriumcitrat pH 6.0-lösning och blockera endogena peroxidaser med H2O2.
  10. Blockera sektionerna med normalt mål serum och utsätta dem för anti-CD8 antikropp (utspädning 1/25) över natten.
  11. Applicera anti-kanin-HRP konjugerade sekundära antikroppar (se Tabell av material) och utveckla färgningen med hjälp av 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) kromogen. Counterstain kärnor med en 11% Harris hematoxylin lösning (se Tabell över material).

6. Övervakning och analys av sfäroid invasion i samkultur

OBS: Tidpunkten-punkt avbildning sfäroid invasionen i kollagen I matrisen skall beslutas av utredaren. Förvärva cellodling bilder med hjälp av en inverterad mikroskop med 10x förstoring. Den idealiska tidpunkten är beroende av den cellinje som testas, samt ECM-komponenten. Mer invasiva cellinjer kommer att börja sprida sig i kollagenet inom några timmar efter att lägga till kollagen. Eftersom T-cellerna i samkulturen kan förhindra en fullständig syn på utviket från sfäroiderna vid mycket tidiga tidspunkter, tas i allmänhet bilder vid 0 h (som referens), 24 h och 48 h efter att kollagenet har lagts till.

  1. Kvanttera invasivitet genom att manuellt räkna antalet "spikar" som kommer ut från sfäroiden och/eller använder bildanalysprogramvara, t.ex.
    1. Analysera invasion som antalet "spikar" från sfäroiden genom att manuellt räkna antalet "spikar" av en sfäroid.
      OBS: Det skall beslutas av utredaren vilka utsprång från sfäroiderna betraktas som "spikar". Ett beslutskriterium kan vara längden på "spike" mätt från kanten av sfäroiden.
    2. Analysera invasion som invasionsområdet i förhållande till storleken på sfäroiden.
      1. Använd Freehand Draw Tool (Bild J) för att spåra gränsen till det totala området (invasion + sfäroid område).
      2. Klicka på Analysera på den övre menyn, klicka sedan på Mät för att visa områdesmåttet.
      3. Spåra gränsen till det totala sfäroidområdet.
      4. Klicka på Analysera på den övre menyn, klicka sedan på Mät för att visa områdesmåttet.
      5. Kopiera den uppmätta resultatlistan till ett kalkylblad och beräkna den totala invasionen/sfäroiden med hjälp av formeln: total invasion = total area/sfäroid area.

7. Immunfluorescens färgning

  1. Förbered följande.
    1. Förbered 5,4% formalin (5 mL) med hjälp av 2,3 mL av 1x PBS och 2,7 mL av 10% formalin.
    2. Förbered 0,5% Octoxynol (50 mL) med hjälp av 50 mL av 1x PBS och 2,5 mL av 10% Octoxynol (förvara på RT).
    3. Förbered IF Buffert (200 mL) med användning av 200 mL av 1x PBS, 200 mg bovint serumalbumin (BSA), 4 mL av 10% Octoxynol, 1 mL av 10% polysorbat 20 (värm upp till RT före användning; filtrera och förvara vid 4 °C).
    4. Bered blockeringslösning (5 mL) med hjälp av 5 mL IF Buffer och 500 μL getserum (värm upp till RT före användning).
    5. Håll 8-väl kammarrutbilder, glasskyddsslip och monteringsmedia redo.
  2. Dag 0
    1. Fixa hela agarose rösterna, inklusive sfäroider, över natten i 5,4% formalin vid RT i en befuktad kammare.
  3. Dag 1
    1. Ta bort cellodlingsmediet som omger agarospjugen med en P1000-pipett genom att luta brunnsplattan.
    2. Överför kollagenplåstret i en 8-brunnskammare genom att greppa ett hörn av kollagenmatrisen i den såddkammaren i den agarose gjutna med elegant spetsig spets pincett och skala bort den från agarose rösterna i en enda, självsäker rörelse.
      OBS: Kollagenplåstret ska lätt separeras från agarospjugen. Annars, använd en P1000 pipetter för att noggrant lägga till odlingsmedium i området för såddkammaren eller invertera agarose gjutna och försiktigt skaka brunnsplattan för att rubba kollagenmatrisen.
    3. Tillsätt 250 μL på 0,5% Octoxynol (se Tabell över material) per brunn. Inkubera i 1 h vid RT.
    4. Aspirera Octoxynolen och tillsätter 250 μL av blockerande lösning per brunn. Block för 1 h vid RT.
    5. Under tiden späd den primära antikroppen (utspädning för anti-keratin 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) i blockeringslösningen, beräknande för 250 μL per brunn.
    6. Tillsätt den primära antikroppen i blockerande lösning och placera kammarens glid i en befuktad kammare för inkubation över natten vid RT.
  4. Dag 2
    1. Avlägsna den primära antikroppen i blockerande lösning genom att aspirera.
    2. Tvätta 3 gånger genom att tillsätta 300 μL IF Buffer och låt den sitta i 5 min vid RT.
      OBS: Låt det bara sitta, det finns ingen anledning att lägga den på en shaker.
    3. Späd den sekundära antikroppen i blockerande lösning (för anti-keratin 8: anti-råtta, utspädning 1/500).
    4. Tillsätt 250 μL sekundär antikropp i blockerande lösning till varje brunn och inkubera i 1 h vid RT. Från och med nu skyddar du proverna från ljus.
    5. Avlägsna den sekundära antikroppen i blockerande lösning genom att aspirera.
    6. Tvätta 3 gånger med 300 μL IF Buffer genom att addera och låt den sitta i 5 min vid RT.
    7. Skölj proverna med 1x PBS och aspirera den.
    8. Ta försiktigt bort kammarens väggar glida så att endast glaset glida längst ner kvar.
    9. Tillsätt minst 200 μL monteringsmedia till ett glasskyddsslip och släpp långsamt täcket över provet.
      OBS: Undvik att skapa bubblor eftersom detta kommer att påverka bildkvaliteten. Bubblor kan förhindras genom att försiktigt placera luckan på glidets långsida i 45° vinkel eller långsamt sänka täckglidningen på glidglaset.
    10. Lägg de monterade proverna på en mörk och torr plats och låt den sitta över natten. Bildtagning kan utföras på följande dag.
      OBS: Den coverslip kan inledningsvis flytta lite en gång placeras över kollagen plåstret. Låt glasglaset sitta på ett jämnt område i några minuter. Täckningen kommer att platta ut provet så att det inte blir någon lucka kvar mellan glasglaset och täcken över tiden.

8. Isolering av celler från kollagenmatrisen

  1. Förbered följande.
    1. Förbered 1 mg/mL kollagenas 4 i seruminnehållande cellodlingsmedium (förvara alikvoterad kollagenas 4 spädningar vid -20 °C)
    2. Förbered 2,5% BSA i 1x PBS och belägga alla rör och pipettspetsar med den (filter BSA-lösning före användning).
    3. Prewarm den BSA lösning och cellodling medium före användning.
  2. Förbered 2 mL kollagenas 4 lösning (1 mg/mL) för att smälta maximalt tre kollagenmatriser från 35-microwell agaros avgjutningar.
  3. Överför upp till tre 75 μL kollagenmatriser från 35-mikrobrunnens agarose casts till ett 2,5% BSA förlackerat 15 mL-rör. Ta tag i ett hörn av kollagenmatrisen i den såddkammare som finns i den agarospjutna med elegant spetspincett och skala av den från agarose rösterna i en enda, självsäker rörelse.
  4. Avfasningsskurna spetsen på en P1000-spets med en sax. Förlackera den återstående spetsen med 2,5 % BSA och bryt ner kollagenmatrisen så mycket som möjligt genom att pipettera upp och ner. Inkubera röret i 15 min vid 37 °C.
  5. (Kritiskt steg 4) Vid varje 5 min, kontrollera om kollagenmatrisen har upplösts. Pipett upp och ner igen innan 10 μL av provet ut och utsäde det på en cellkultur skålen för observation under mikroskopet vid 10x förstoring. Lägg till ytterligare 5 min om det behövs.
  6. Fyll upp röret med 10 mL av förkrigstidens cellodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum). Blanda försiktigt genom att vända röret 3\u20124 gånger.
  7. Centrifugera röret vid 400 x g i 4 min vid RT.
  8. Ta försiktigt bort supernatanten och lämna 2 mL volym.
  9. (Kritiskt steg 5) Lämna 2 mL efter den första centrifugeringen steg som det fortfarande kan finnas oupplöst kollagen längst ner på röret som transporterar celler längs dem.
  10. Utför två tvättsteg genom att lägga till 10 mL seruminnehållande cellodlingsmedium varje gång. Centrifugera varje gång vid 400 x g i 4 min vid RT.
  11. Efter det sista tvättsteget, ta bort så mycket medium som möjligt och lämna just cellpelleten.
  12. Resuspend cell pelleten i 1 mL av cell dissociation enzymer lösning (se Tabell av material).
  13. Använd en P200-pipett och pipetten uppåt och nedåt för att bryta cellklustren.
  14. Inkubera cellerna i 20 min i cellodlingsinkubatorn (37 °C, 5% CO2).
  15. Upprepa steg 8.13.
    OBS: Ta ~ 10 μL ut och utsäde på en cellodling skålen att observera under mikroskopet vid 10x förstoring för att visa hur väl sfäroiderna har dissociated i enstaka celler. Tillsätt vid behov 5 min ytterligare inkubation.
  16. Tillsätt 4 mL av cellodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum) och blanda genom att invertera röret 3\u20124 gånger.
  17. Centrifugera vid 400 x g i 4 min vid RT.
  18. Ta bort supernatanten. Härifrån och framåt kan FACS färgning eller cellodling utföras.

9. RNA-utvinning ur kollagenmatrisen

  1. Preparera guanidiniumtiocyanat med fenol (se Tabell över material), 100% kloroform, 70% RNase-fri etanol, RNA extraktionssats (seTabell of Materials ), RNase-fria 1,5 mL rör, RNase-fria 15 mL rör och RNase-fri ddH2O.
  2. Överför upp till tolv 190 μL kollagenmatriser från 81-microwell agarose gjuter i en 15 mL rör. Ta tag i ett hörn av kollagenmatrisen i den såddkammare som finns i den agarospjutna med elegant spetspincett och skala av den från agarose rösterna i en enda, självsäker rörelse.
    OBS: Matriserna kan också frysas vid -80 °C tills de är färdiga för RNA-extraktion.
  3. Tillsätt 1 mL guanidiniumtiocyanat med fenol (se Tabell över material) till kollagenmatriserna i 15 mL-röret.
    OBS: Guanidiniumtiocyanatet med fenol måste helt täcka kollagenmatriserna.
  4. Vortexa rören för 10\u201220 s.
  5. Homogenisera matriserna med 20 G-nålar och 5 mL-sprutor tills de är helt upplösta.
  6. Låt matriserna sitta i 5 min vid RT.
  7. Tillsätt 200 μL ren kloroform till matriserna och skaka röret kraftigt i 15 s.
  8. Överför omedelbart blandningen till 1,5 mL rör.
  9. Låt blandningen sitta i minst 5 min vid RT tills faserna är separerade.
  10. Centrifugera de 1,5 mL rören vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
  11. Fyll ett nytt 1,5 mL-rör med 500 μL 70% etanol.
    OBS: Beroende på vattenfasens volym efter centrifugeringen (se steg 9.12. Detta kanske inte är 500 μL. Mängden 70% etanol bör vara lika med volymen av vattenfasen.
  12. Överför försiktigt den övre vattenfasen av de centrifugerade proverna till det 70-procentiga etanolfyllda röret och blanda noggrant genom pipettering upp och ner.
  13. (Kritiskt steg 6) Var noga med att inte störa lagren längst ner på guanidiniumtiocyanat med fenolseparation samtidigt som du tar bort den övre fasen, eftersom detta kommer att förorena RNA.
  14. Lägg till provet i en RNA-extraktionskolumn (ingår i RNA-extraktionssatsen, se Table of Materials). Från och med nu följer du tillverkarens protokoll för RNA-rening från celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D-samkulturmodellen möjliggör olika analyser som visas i figur 1A, som kan kombineras eller modifieras efter behov. I vår etablerade experimentella setup, tumör och T-celler är co-odlade i 2 dagar följt av inledande av invasionen assay för val av invasiva och / eller resistenta tumörceller (Figur 1B). Dag 4 quantitationen av invasionen utförs och "överlevande" celler isoleras från kollagenmatrisen eller direkt bearbetas för RNA23 eller DNA-extraktion från matris (Figur 1B). Inbäddning av 3D-kulturen i typ I kollagen inom mikrobrunnar av agaros rösterna möjliggör övervakning och analys av invasion genom att använda Bild J för att först avgränsa det totala området med hjälp av programvarans frihand dra verktyg och sedan beräkna förhållandet över den avgränsade sfäroidområdet (Figur 2A), och / eller genom att räkna antalet "spikar" lämnar sfäroid. Med hjälp av två primära murine pankreascancer cellinjer (cellinje 1 och cellinje 2), olika sfäroid former och invasiva beteende observerades och kvantifieras i enlighet med detta (Figur 2B). Cellinje 1 visar en mer kompakt sfäroidbildning och "taggiga" invasion, jämförbar med single cell invasion, medan cellinje 2 bildar mer lös sfäroider och visar en kollektiv invasion mönster (Figur 2C). Samkultur utfördes med två olika tumörklonal cellinjer seedade samtidigt (Figur 3A\u2012E) för att följa deras interaktioner under efterföljande analyser, och med tumörceller och T-celler vid tumör sfäroidbildning (Figur 3F\u2012J). För detaljerad bedömning av det invasiva beteendet utfördes immunofluorescerande färgning (Bild 4). Efter separation av kollagenmatrisen från agarosgjuten, OM-färgning och överföring till en glasglasskiva (Bild 4A\u2012B) utfördes konfokal avbildning på ett sätt med hög genomströmning (bild 4C\u2012J). Storleken och konsistensen av agaros gjutna tillåta inbäddning av hela 3D-kultur systemet i paraffin för seriell snittning och immunohistokemi (IHC) färgning för kvantifiering av den rumsliga relationen mellan tumör och T-celler (Figur 5). T-celler som finns i avsnittet kan identifieras och ytterligare kännetecknas av cellytan markör färgning exemplifieras här för CD8 (Figur 5D,E). T-celler som har infiltrerat tumören sfäroid kan räknas i förhållande till dem som kvar i periferin av sfäroid. Figur 5D,E visar exempel på distinkt infiltration av T-celler till tumörsfäroider som odlats från tumörcellslinje 1 (D) och cellinje 2 (E). Tabell 1 visar typiska experimentella uppställningar för analyserna, och utbytet av representativa och analysbara prover i slutet av experimentet för varje protokoll.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde, analyser och tidslinje för experiment. (A) En 81-microwell och 35-microwell gummi mögel är fyllda med 2% agaros i 1x PBS att generera en agarose gjuten med flera microwells. Diametern på en gummiform är 3,5 cm. Storleken på den 35-mikrobrunn agaros gjutna är 13 mm x 8 mm, och av 81-microwell rösterna är 13 mm x 13 mm. Sfäroider bildas på cell sådd in i kamrarna i agaros gjutna i en enda pipettering steg. Samkultur med T-celler utförs inom samma gjutna. Funktionell övervakning och potentiella analyser visas. (B) Tidslinje för experiment. Tumörceller är co-odlade med autolog T-celler för 2 dagar möjliggör en maximal interaktion mellan båda celltyperna. Invasionsanalysen initieras efter två dagar. Endpoint analyser utförs efter ytterligare två dagar för att övervaka invasiva och överlevnad fenotyp av tumörceller samt spridning och överlevnad av T-celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kvantifiering av invasion. Invasion kan kvantifieras genom bildanalys, t.ex. (A) Beräkning av den totala invasionen området som ett förhållande mellan total areal till sfäroidområdet. Skala bar: 300 μm. (B) Exempel på två olika primära murine bukspottkörtelcancer cellinjer (cellinje 1 och 2) i sfäroid bildning vid olika förstoringar och invasion i typ I kollagen. (C) Analys av invasionen utförs genom att räkna antalet spikar per sfäroid (vänster diagram; felstaplar: 2,63 för cellinje 1, 1,47 för cellinje 2) och beräkna invasionsområdet enligt beskrivningen (högerdiagram; felstaplar: 0,36 för cellinje 1, 1,28 för cellinje 2). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Samkultur med färgämnesmärkta tumör och T-celler. (A\u2012E) Blandning av två olika färgämne-märkt primära murine bukspottkörtelcancer klonala cellinjer (grön och röd) och förstorad bild av en representativ microwell (B\u2012E). (F\u2012J) Samkultur av pre-märkt tumör (grön) och T-celler (röd). (G\ u2012J) Förstorad vy av en representativ microwell visar en tumör–T-cell samkultur på tumör sfäroidbildning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Immunfluorescensfärgning. Immunofluorescens (IF) färgning utfördes efter att ha separerat kollagenmatrisen från den agaros gjutna. (A\u2012B) Efter OM-färgning överförs kollagenfläckarna till en glasrutschkana och täcks med glasskyddsslipar. (C\u2012F) Exempel på ett IF-färgat kollagenplåster inklusive tumörsfäroider med (C) Hoechst, (D) keratin 8, (E) phalloidin och (F) överlagring. Paneler (G\u2012J) Visa respektive förstorad vy av en enda sfäroid. Skala bar = 300 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Immunhistokemi snittning. Den agarose rösterna med 3D-kulturen nedsänkt i hydroxyethyl agarose bearbetning gel, var inbäddade i paraffin, avsnitts och bearbetas för immunohistokemi (IHC) färgning. (A) Paraffin block som används för horisontell snittning som börjar från botten av agaros gjutna för att få seriell avsnitt av flera tumörcell / T-cells co-kulturer inom en enda rösterna; skala bar = 5 mm. (B) Hematoxylin & eosin-färgade avsnitt av en agarose gjuten innehållande 3D samkultur av tumör och T-celler. Skala bar: 1 mm. (C) Förstorad vy över en H&E-färgade samkultur inom agaros gjutna. CD8-färgning av T-celler som samkulturerades med cellinje 1 (D) och cellinje 2 (E). Skala barer i C\u2012E = 200 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Protokollet typiska setup celler seedade (per gjutna) typisk avkastning
cytotoxicitet assay 2x 81-mikrobrunn avgjutningar 81,000 100 000 celler
IHC-analys 1x 81-microwell gjuten 81,000 40 sfäroider
Invasion assay 2x 35-mikrobrunn avgjutningar 35,000 50 sfäroider
IF-analys 2x 35-mikrobrunn avgjutningar 35,000 50 sfäroider
Cellisolering från kollagen I 2x 35-mikrobrunn avgjutningar 35,000 50 000 celler
RNA-extraktion från kollagen I 12x 81-mikrobrunn kastar 243,000 400-600 ng/μl

Tabell 1: Typisk experimentell inställning och avkastning för protokollen. Tabellen visar den typiska experimentella setup för varje protokoll och den typiska avkastningen av analysbara prover (antal celler, sfäroider eller RNA koncentration) i slutet av experimentet, respektive. IHC= immunhistokemi; IF= immunfluorescens.

Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteras här beskriver 3D tumör sfäroid generation, som möjliggör samkultur med T-celler, cell-baserade funktionella och molekylära analyser, samt en mängd olika övervakning och analys möjligheter med hjälp av en enda enhet. Den stora fördelen med vårt tillvägagångssätt är att det inte nödvändiggör överföring av 3D-kulturen till en separat analys och upprätthåller integriteten hos 3D-kulturen i hela analyserna.

Arbetsflödet som presenteras här kan ändras efter behov. Inkubationstiderna för sfäroidbildning, samkultur av T-celler eller cytotoxicitetsanalys, kan behöva ändras för olika experimentella tillstånd eller cellinjer.

Det finns några steg i hela assays, som kräver nära anslutning till protokollet. Dessa är i allmänhet: att ta bort cellodlingsmediet innan du lägger till en andra cellinje för samkultur, samt inbäddning av 3D-kulturen i ECM eller hydroxyethyl agarose processing gel inom agarose rösterna. Det är absolut avgörande att långsamt och försiktigt ta bort medlet av såddkammaren genom att luta brunnsplattan och rikta in sig på ett hörn av kammaren med en mikropipette. Så länge som agarosen innehåller celler rekommenderar vi att alltid ta bort något medium i brunnen med en mikropipette, istället för att använda en pipettor. Lägga till en andra cellinje och inbäddning i ECM eller hydroxyethyl agarose bearbetning gel måste utföras långsamt och drop-wise för att förhindra att spola ut cellerna i mikrobrunn. Det mest kritiska steget i kollageninvasionen är inkubationstiden innan invertering av rösterna i brunnsplattan med brunnarna. Minska tiden kan orsaka kollagen att hoppa av från rösterna, och överstiger tiden kan orsaka kulturen att pressas ner till botten av microwells, vilket resulterar i ojämnt fördelade sfäroid invasion. Invertera gjutna gör det möjligt för celler i mikrobrunn att helt dränka i flytande kollagen innan den polymeriserar och stelnar. Ytspänningen mellan agarosgjuten och brunnsplattans plastbotten, genererar en "hängande-drop"15,24 under 3D-sfäroidinvasionen.

Det är viktigt att notera att inkubationstiden innan invertering av rösterna har fastställts för inbäddning i typ I kollagen. Med andra ECM-komponenter måste detta steg justeras i enlighet med detta. Att notera, fullständig borttagning av kvarvarande media bör inte försöka undvika en oavsiktlig förlust av celler som finns i mikrobrunn. Detta restmedia resulterar i en lätt utspädning av den tillsatta ECM.. Detta måste beaktas för analysen och anpassning från andra analyssystem.

Den samkultur som beskrivs här möjliggör en maximal tumör/T-cellsinteraktion innan invasionen av tumörceller är assayed: Tumör och T-celler är co-odlade i 2 dagar innan inbäddning i typ I kollagen och sedan identifiera överlevande och invasiva tumörceller under de närmaste två dagarna (Figur 1B). Notera, när samkulturen inleddes medan T-celler var resuspended i kollagen jag, T-celler misslyckades med att visa en inverkan på tumör cell invasion och cytotoxicitet. Denna effekt kan bero på att T-cellerna är mer distribuerade i kollagen och därmed mindre koncentrerad runt sfäroiderna. Detta tyder på att den direkta interaktionen mellan tumör och T-celler under de två dagarna av co-kultur före invasionen analysen är avgörande för bedömning av T-cells medierad effekter på tumör cellerna.

Ändå, några av fördelarna med denna 3D-modell kommer med nackdelar. Denna hög genomströmning inställning gör det enkelt och snabbt sådd av celler i agarose rösterna i en pipettering steg, vilket resulterar i en generation av en mängd enhetligt stora sfäroider inom en gjuten. Men eftersom sfäroiderna alla är belägna inom samma gjutna, kan de också enkelt avlägsnas, t.ex. Därför är mängden avkastning för varje protokoll starkt beroende av den tekniska kompetensen och erfarenheten hos prövaren, men också på vilken typ av analys som utförs. Som tabell 1 antyder måste en eventuell förlust av sfäroider på cirka 50% i slutet av ett experiment beaktas. Dessutom, under såddsteget, celler kanske inte lika distribuera över området för sådd kammaren, vilket resulterar i mer eller mindre representativa sfäroider inom agaros rösterna. Från vår erfarenhet ökar denna effekt med storleken på den agaros gjutna. Följaktligen måste replikat beaktas medan du planerar ut experimentet.

Spatiotemporal interaktion av celler inom 3D-systemet kan bedömas av time lapse imaging, som presenterar en annan övervakning alternativ i denna modell. Vidare är mikrobrunnarnas små diameter och det enda pipetteringssteget till fröceller, lämpliga för att utföra kloning av encell. Slutligen kan patientens prover (t.ex. från biopsier) analyseras i analysen på grund av det lilla antal celler som krävs för mikrobrunnarna och hög genomströmningsfunktionen i 3D-systemet. Införandet av stimulerande eller blockerande läkemedel (t.ex. anti-PD-1 eller anti-PD-L1) att sond tumörcellen/T-cell interaktion är en logisk förlängning av analysen.

Sammanfattningsvis ger 3D sfäroid samkultur modell som presenteras här en flexibel ram för övervakning av cancer cell invasion och cytotoxicitet av co-odlade T-celler i en biologiskt relevant inställning. Den resulterande överhörning kan visualiseras samtidigt som integriteten i 3D-kulturen och därmed ge mekanistiska insikter i tumör cell – T-cell interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Virginie Ory, PhD för hjälpsamma diskussioner och råd om tillvägagångssättet i 3D-samkultur modell. Vi tackar också Elizabeth Jones för utmärkt tekniskt bistånd med IHC-snittningen. Denna studie stöddes av bidrag från DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) till YL (LI 2547/4-1) och National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), till ATR (R01 CA205632), till GWP (R01 CA218670), och Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

Cancerforskning 3D-cellkultur cancerceller samkultur kollagen cytotoxicitet invasion immunofluorescens immunohistokemi t-celler tumörsfäroid
Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter