Summary
Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sofisticado sistema de entrega y monitoreo.
Abstract
La hipertermia se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento del cáncer. Las técnicas han variado desde la inserción intratumoral de barras de hierro calientes, hasta nanopartículas magnéticas dirigidas a anticuerpos tumorales administradas sistémicamente, a temperaturas de 39 ° C (nivel de fiebre) a 1.000 ° C (electrocauterio) y tiempos de tratamiento de segundos a horas. La relación temperatura-tiempo (dosis térmica) dicta el efecto con altas dosis térmicas que resultan en la ablación tisular y dosis térmicas más bajas que resultan en efectos subletales como aumento del flujo sanguíneo, acumulación de medicamentos y estimulación inmune. Una de las terapias médicas actuales más prometedoras es la hipertermia por nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica consiste en activar nanopartículas magnéticas, que pueden administrarse sistémica o intratumoralmente, con un campo magnético alterno no invasivo y no tóxico. El tamaño, la construcción y la asociación de las nanopartículas magnéticas y la frecuencia y la intensidad de campo del campo magnético son los principales determinantes del calentamiento. Hemos desarrollado instrumentación y técnicas sofisticadas para administrar hipertermia de nanopartículas magnéticas reproducibles en modelos de animales grandes y pequeños y células cultivadas. Este enfoque, que utiliza un monitoreo continuo de la temperatura en tiempo real en múltiples ubicaciones, permite la administración de dosis térmicas bien definidas al tejido o células diana (tumor) al tiempo que limita el calentamiento del tejido no objetivo. El control y monitoreo precisos de la temperatura, en múltiples sitios, y el uso del algoritmo estándar de la industria (minutos equivalentes acumulados a 43 ° C / CEM43), permite una determinación y cuantificación precisas de la dosis térmica. Nuestro sistema, que permite una amplia variedad de temperaturas, dosis térmicas y efectos biológicos, se desarrolló a través de una combinación de adquisiciones comerciales y desarrollos internos de ingeniería y biología. Este sistema ha sido optimizado de una manera que permite la rápida conversión entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo diseñar, desarrollar e implementar una técnica y un sistema efectivos para administrar hipertermia de terapia de nanopartículas magnéticas (mNP) reproducible y precisa.
Introduction
La hipertermia se ha utilizado históricamente en la terapia del cáncer, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos. Aunque tiene una larga historia de uso, el método más ventajoso para administrar este tratamiento aún se está debatiendo y depende del sitio y la ubicación de la enfermedad. Los métodos para la administración de hipertermia incluyen microondas, radiofrecuencia, ultrasonido focalizado, láser y nanopartículas metálicas (como oro u óxido de hierro)1,2,3,4. Estos métodos de administración pueden conducir a un rango de temperaturas de tratamiento desde el nivel de fiebre hasta cientos de grados C. El efecto biológico de la hipertermia depende principalmente de las temperaturas utilizadas y de la duración del tratamiento5. Para este manuscrito y propósito, nos estamos centrando en la hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite cambios de temperatura enfocados, localizados, bien monitoreados y controlados, utilizando nanopartículas de óxido de hierro no tóxicas, aprobadas por la FDA.
Una trampa de otras modalidades de hipertermia es la falta de orientación celular precisa; La hipertermia no tiene una relación terapéutica inherentemente alta, por lo tanto, es necesaria una termometría cuidadosa y una focalización6. mNPH permite la inyección sistémica o intratumoral de mNPs, y el calor solo se genera donde se encuentran los mNPs, dirigiendo así el tratamiento directamente al tumor. mNPH puede ser eficaz cuando las nanopartículas magnéticas se encuentran dentro o fuera de la célula. Para la terapia del cáncer, la visión general de mNPH es que las nanopartículas magnéticas se inyectan (intratumoral o intravenosamente), luego se aplica un campo magnético alterno, lo que hace que los polos magnéticos de nanopartículas se realineen constantemente, lo que lleva a un calentamiento localizado de las células y tejidos asociados con las nanopartículas 7,8 . Al ajustar el volumen de nanopartículas y la frecuencia / fuerza del campo magnético alterno (AMF), es posible controlar cuidadosamente la temperatura generada dentro del tejido.
Este tratamiento funciona bien en tumores que están cerca de la superficie del cuerpo, ya que los tumores más profundos requieren una AMF más fuerte, por lo que el riesgo de calentamiento por corrientes de Foucault aumenta9. Existe evidencia de que la hipertermia se utiliza clínicamente como monoterapia, sin embargo, a menudo la hipertermia se combina con radioterapia o quimioterapia, lo que lleva a un efecto anticancerígeno más dirigido10,11,12. La evidencia clínica de hipertermia que funciona en combinación con radioterapia se revisa en una publicación anterior13. Nuestro laboratorio ha tratado con éxito una variedad de animales, desde ratones hasta cerdos y cánceres caninos espontáneos, utilizando el método mNPH12,14,15. Este protocolo está diseñado para aquellos interesados en investigar los efectos del tratamiento de la hipertermia localizada, ya sea solo o en combinación con otras terapias.
Uno de los factores más importantes en la hipertermia es poder medir y comprender, en tiempo real, la dosis térmica que se administra al tejido diana/tumoral. Una forma estándar de calcular y comparar la dosis es mediante la demostración de los minutos equivalentes acumulados de calentamiento a 43 °C; Este algoritmo permite la comparación de dosis independientes del sistema de administración, temperaturas máximas y mínimas (dentro de un rango específico) y parámetros de calentamiento / enfriamiento 5,16. El cálculo CEM funciona mejor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por ejemplo, en algunos de los estudios que hemos realizado, hemos elegido una dosis térmica de CEM43 30 (es decir, 30 min a 43 °C). La elección de esta dosis nos permitió observar efectos inmunogenéticos seguros y efectivos in vitro, tanto solos como en combinación con una sola dosis de radiación17.
Con la hipertermia de nanopartículas magnéticas, hay varios factores que deben considerarse en la construcción de un sistema de administración apropiado. El diseño de la instrumentación incluye importantes factores de seguridad, como el uso de un enfriador para garantizar que el equipo de suministro de campo magnético permanezca frío incluso cuando se opera a alta potencia, y procedimientos a prueba de fallas que evitan que el sistema se encienda si no se han activado todos los sistemas de temperatura, evaluación de potencia y control. Además, hay factores biológicos importantes que deben considerarse tanto para situaciones in vivo como in vitro. Cuando se utilizan células cultivadas, es necesario tratar en medios de crecimiento y mantener a una temperatura viable constante para evitar cambios fisiológicos que podrían afectar los resultados. Para los tipos de nanopartículas individuales, es importante conocer la tasa de absorción específica (SAR) al calcular los parámetros de calentamiento basados en AMF. Del mismo modo, es importante conocer la concentración de mNP/Fe, en células y tejidos, que es necesaria para lograr el calentamiento deseado. Los métodos in vivo requieren aún más atención a los detalles, ya que el animal debe mantenerse bajo anestesia durante el tratamiento y la temperatura corporal central del animal debe mantenerse a un nivel normal durante todo el tratamiento. Permitir que la temperatura corporal del animal baje, como sucede bajo anestesia, puede afectar los resultados generales, con respecto a la dosis térmica del tejido que se está tratando.
En este manuscrito, discutimos los métodos utilizados para diseñar y construir un sistema versátil de hipertermia de nanopartículas magnéticas, así como los factores de uso importantes que deben considerarse. El sistema descrito permite la entrega robusta, consistente, biológicamente apropiada, segura y bien controlada de la hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, debe tenerse en cuenta que los estudios de mNPH que realizamos a menudo involucran otras terapias como radiación, quimioterapia e inmunoterapia. Para que estos resultados sean significativos, es importante determinar cómo el calor suministrado puede afectar la eficacia y/o seguridad-toxicidad de otras modalidades (o viceversa) y el bienestar del animal. Por esta razón y las situaciones dosimétricas y terapéuticas mencionadas anteriormente, es esencial prestar estricta atención a la precisión de la dosificación de hipertermia de nanopartículas magnéticas y las mediciones continuas del núcleo y la temperatura objetivo. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método y una descripción sencillos y consistentes para la administración de hipertermia de nanopartículas magnéticas segura y efectiva.
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Protocol
El Programa de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (iAAALAC) y se adhiere a todas las pautas y regulaciones de UDSA y NIH (Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio). Todos los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College (IACUC). El procedimiento de eutanasia se adhiere a las Directrices AVMA 2020 para la eutanasia de animales.
1. Instrumentación/diseño del sistema
- Diseñe una antena AMF personalizada (bobina) para que sea un circuito cerrado, eligiendo formas para crear el campo magnético deseado. Utilice fórmulas y características de inductancia de la elección del generador de energía para diseñar bobinas compatibles para generar el campo deseado. Utilice diferentes diseños para experimentos in vitro e in vivo.
- Asegúrese de que la inductancia de la antena AMF esté dentro del rango aceptable del generador de energía. Suma o resta condensadores para que coincida (sintonice) la antena con el generador de energía.
- Para experimentos in vitro, diseñe una bobina helicoidal de 14 vueltas, diámetro interior 2 cm y longitud 14 cm, que pueda contener tubos de 1,5 ml, lo que permite el tratamiento de múltiples muestras simultáneamente. Aísle la bobina con un polímero de vinilo y use un espaciador de poliestireno para separar la bobina de los tubos. Los detalles de las especificaciones de diseño y las consideraciones están presentes en el Archivo Suplementario 1.
- Para experimentos in vivo, adquiera una bobina helicoidal de cuerpo entero construida a medida de un fabricante con información de diseño patentada. Use tubos cuadrados de 8 mm (ya que crea un campo más uniforme dentro del orificio de la bobina) y un concentrador en el área de tratamiento objetivo. Haga que el concentrador tenga 5.0 cm de largo, con un total de 5 vueltas que resultan en un diámetro interno de 3.6 cm, un diámetro exterior de 5.2 cm, y tenga su ubicación en el área de tratamiento objetivo. Rodee la bobina con una carcasa de policarbonato.
- Utilice un generador AMF con potencia y frecuencia ajustables, con una potencia nominal de 10 kW o superior como fuente de alimentación. La inductancia hace coincidir la fuente de alimentación y las antenas/bobinas a un rango de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), lo que permite frecuencias que oscilan entre 30-300 kHz. Enfriar el generador utilizando agua reciclada a través de una bomba de refuerzo centrífuga, presión regulada a 50 psi.
- Enfríe las bobinas con un enfriador de capacidad de enfriamiento de 5.6 toneladas que bombea un fluido de transferencia de calor a base de etilenglicol al 25% diluido con agua a través de la antena AMF. Ajuste la temperatura del enfriador de tal manera que la antena no caliente ni enfríe la muestra.
- Para la contención del animal, construya un soporte tubular que pueda suspenderse en el centro de la bobina con un espacio de aire de 0,5 cm entre el soporte y la superficie de la bobina. Conecte una bomba de aire acondicionado ajustable que haga circular aire a través de la carcasa alrededor de la bobina y configúrela para mantener una temperatura central normal del animal. Conecte la máquina de anestesia al soporte tubular del animal cerca de la cabeza del animal para garantizar la administración adecuada de la anestesia.
- Para la contención celular, cree un aparato que haga circular el agua de un baño de agua a través del espaciador donde se colocan los tubos. Ajuste la temperatura de este baño de agua de tal manera que los tubos estén rodeados de agua a 37 ° C.
- Use sondas de fibra óptica para monitorear las temperaturas dentro del tumor, el núcleo del animal y el entorno animal o para estudios in vitro, monitoreando la temperatura del pellet celular y el agua que rodea los tubos.
- Utilice nanopartículas magnéticas de óxido de hierro que tengan un tamaño de 100 nm para todos los experimentos.
NOTA: La concentración y la tasa de absorción específica (SAR) son dos características que deben considerarse al elegir nanopartículas, ya que afectan directamente el posible calentamiento y la dosis térmica18.
2. Hipertermia in vitro
- Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/pocillo en placas de 6 pocillos, con 2 mL de medio completo.
- Determinar el tratamiento apropiado para cada pocillo, es decir, células sin mNPs y sin AMF, células con mNPs y sin AMF, células sin mNPs y AMF, células con mNPs y AMF.
NOTA: Además, asegúrese de que haya controles apropiados si combina hipertermia con otra terapia. AMF se realiza en un laboratorio de banco de investigación estándar adaptado con las capacidades de energía y refrigeración necesarias. - 24 h después del enchapado, agregue mNP a los pozos apropiados según lo determinado en el paso anterior. Añadir mNPs a una concentración de 3 mg de hierro/ml. Asegúrese de que los mNP se distribuyan por todo el pozo, ya sea creando una solución de medios de stock / mNP (eliminando los medios antiguos, agregando esta solución) o agregando los mNP directamente y agitando suavemente las placas para una distribución homogénea.
- Comience el tratamiento, 48 h después de la adición de mNPs, cuando los pozos sean ~ 80% confluentes, eliminando los medios y lavando los pozos con medios frescos. Retire el medio.
- Agregue 0.5 ml de tripsina a cada estado que se esté tratando y agite suavemente. Use un microscopio para verificar que las células estén separadas.
- Agregue 1 ml de medio a cada pocillo para recolectar las células en tubos de 1.5 ml. Recoja todas las celdas del pozo (~1 x 106 celdas). Use un tubo separado claramente etiquetado para cada pozo.
- Girar los tubos a 60 x g durante 2-3 min para permitir que las células se granulen. Retener el pellet en el medio.
- Coloque tubos en el espaciador llenos de agua dentro de la bobina. Ajuste la temperatura del baño maría de modo que el medio y el pellet de la celda se mantengan a 37 °C. Controle la temperatura dentro del tubo y el baño de agua utilizando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.
- Encienda el enfriador, verifique que el refrigerante fluya a través de la bobina. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el porcentaje de máximo al campo deseado. Opere la bobina solenoide de 14 vueltas, alimentada por un generador de 10 kW, a 165 kHz y 23,87 kA/m (300 Oe).
- Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica separada en uno de los tubos. Tratar las células hasta la dosis térmica del protocolo previamente determinada. Un ejemplo es 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).
- Resuspenda las células en el medio que está en sus tubos y vuelva a colocar en nuevas placas de 6 pocillos. Etiquete claramente las nuevas placas. El objetivo es volver a platear todas las células recolectadas (~1 x 106 celdas).
NOTA: Se deben usar nuevas placas de 6 pocillos para garantizar que las células que se cultivan reciban tratamiento. Si se usan las placas viejas, todavía podría haber células en las placas que no fueron tripsinizadas con éxito. - Si es necesario, para el siguiente procedimiento experimental, lisar las células para el análisis de expresión de ARN o proteínas.
3. Hipertermia in vivo
- Cultivo celular e inoculación
- Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Use platos/platos que proporcionen suficientes células para la inoculación del número deseado de animales. Por ejemplo, las placas de 10, 100 mm, chapadas a 100, 000 células serán confluentes con suficientes células para 20 inyecciones de ratones dentro de las 48 h.
- Tripsinizar células y recolectar usando medios RPMI puros (sin FBS o pluma/estreptococo).
- Cuente las células y cree una solución para la concentración deseada de células, basada en el volumen de inoculación y el número de ratones.
- Anestesiar ratones hembra C57Bl/6 de 6 semanas de edad usando isoflurano vaporizado y oxígeno. Coloque a los animales en una caja de plexiglás con 5% de isoflurano y 95% de oxígeno hasta que sea inducido. Una vez inducido, retirar el animal y utilizar un cono facial al 2% de isoflurano para completar los pasos 3.1.5-3.1.7 y 3.3.3-3.3.6.
NOTA: Para la anestesia durante el tratamiento, use una contención de anestesia incorporada. Siga los protocolos institucionales estándar para la anestesia en ratones. Antes de la experimentación con animales, asegúrese de la aprobación adecuada de IACUC. Después de la anestesia, devuelva al animal a la jaula y controle la recuperación para asegurarse de que no haya complicaciones. - Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento.
- Afeite el flanco derecho con una afeitadora eléctrica.
- Limpie el área de inyección con una toallita con alcohol. Inyectar 1-2 x 106 células, utilizando una jeringa de vidrio de 100 μL con una aguja de 28 G, dispersas en 50 μL de medios por vía intradérmica en el flanco derecho afeitado de los anestesiados.
- Crecimiento tumoral/inyección de nanopartículas
- Mida los tumores en 3 dimensiones usando calibradores (largo, ancho y profundidad) y calcule los volúmenes por (largo x ancho x profundidad x π)/6.
- Cuando los volúmenes tumorales alcancen los 120 mm 3 (+/- 20 mm3), colocar los animales en estudio. Diseñar el estudio, asegurándose de que haya grupos de control y tratamiento apropiados, incluidas cohortes de terapia combinada (es decir, control, mNPH, radiación y la combinación).
- Anestesiar a los ratones que vayan a recibir mNPs como se describe en 3.1.4.
- Limpie el área con una toallita con alcohol. Inyecte mNPs en el tumor 3 h antes del tratamiento con HMA. Inyecte un volumen tal que la dosis sea de 7,5 mg de hierro/cm3 del tumor.
NOTA: Los datos no publicados del laboratorio sugieren que la absorción máxima de mNP ocurre a las 3-6 h.
- Tratamiento de la HMA
- Anestesiar el ratón y colocarlo en una almohadilla térmica para mantener la temperatura central.
- Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento. Retire la marca auricular o cualquier otro objeto metálico del ratón.
- Coloque suavemente una sonda de temperatura de fibra óptica lubricada en el recto del ratón.
- Coloque un catéter en el tumor, retirando la aguja. Corte el catéter de manera que no sobresalga demasiado del tumor.
NOTA: Los catéteres de temperatura de fibra óptica se colocan y retiran mientras los ratones están bajo anestesia general, es decir, los catéteres solo están en su lugar durante el procedimiento de calentamiento del tumor. Los ratones reciben una dosis subcutánea única de un medicamento para la analgesia AINE, ketoprofeno (5 mg / kg), en el momento del procedimiento. No hemos observado molestias o morbilidades a corto o largo plazo asociadas con la colocación de los catéteres. - Inserte una sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores en el catéter. El catéter protege los sensores de la sonda de temperatura de fibra óptica.
- Pegue la sonda rectal e intratumoral a la cola del animal para asegurarse de que permanezcan en su lugar.
- Coloque el mouse en un tubo de 50 ml, diríjase hacia abajo. El tubo debe tener un orificio cerca de la cabeza donde se conectará y administrará la anestesia.
- Coloque el tubo dentro de la bobina configurada y vuelva a conectar la anestesia.
- Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica suelta en el tubo para medir la temperatura ambiente.
- Encienda el enfriador y asegúrese de que el refrigerante esté circulando.
- Compruebe y asegúrese de que el software de la computadora muestra las diversas temperaturas y comience a grabar para permitir que se muestre un cálculo CEM43 en tiempo real. El CEM43 requerido es la dosis previamente determinada.
NOTA: Antes de encender el imán, asegúrese de que no haya elementos metálicos adheridos al animal, ya que se calentarán rápidamente. Además, asegúrese de que todos en la habitación no tengan un marcapasos y que sea seguro para ellos estar allí. - Encienda el imán a un porcentaje de potencia bajo.
- Asegúrese de que las sondas de temperatura de fibra óptica registren los cambios de temperatura. Las temperaturas aumentarán una vez que se active el AMF a medida que aumenta el campo. Asegúrese de que la temperatura central del animal permanezca a 38 °C. Regule la temperatura central utilizando la camisa de aire acondicionado.
- Ajuste la fuerza del campo magnético cambiando la potencia del generador, utilizando el dial de control incorporado, que a su vez controla el nivel de temperatura en el tumor.
- Cierre la AMF una vez que se logre la dosis deseada, según lo determinado previamente por el usuario (por ejemplo, CEM43 40), dentro del tumor.
- Una vez que se haya apagado el AMF, retire el tubo de la bobina.
- Retire el ratón del tubo, extrayendo las diversas sondas y el catéter. Si es necesario, etiquete al animal con una nueva marca auricular de metal.
- Una vez que se completen los tratamientos, apague el enfriador.
- Recuperar a los animales de la anestesia asegurando que no haya complicaciones. Monitoree su comportamiento para asegurar el retorno a la normalidad.
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Representative Results
Estudios in vitro
Las células solo alcanzarán y mantendrán la temperatura deseada y la dosis térmica si la cantidad y la concentración de las nanopartículas magnéticas / hierro y el AMF se combinan adecuadamente. Cuando se utilizan nanopartículas magnéticas para calentar células in vitro (e in vivo), debe tenerse en cuenta que para lograr hipertermia en células con nanopartículas magnéticas internalizadas, será necesario un nivel específico de mNP / Fe intracelular, y será necesario el número y la proximidad de las células cargadas con mNP entre sí. Si el nivel de mNP / Fe en las células / tejidos objetivo es suficiente para lograr un efecto de calentamiento, la frecuencia y la fuerza del campo magnético se pueden ajustar para lograr la temperatura y los efectos deseados. Si se colocan correctamente, entonces se pueden realizar más estudios que analicen las diferencias genéticas y moleculares entre las diferentes dosis y tiempos17. La figura 1 representa un esquema de los métodos in vitro.
Estos métodos in vitro se pueden utilizar para investigar el ARNm celular y el cambio en la expresión de proteínas. Un ejemplo reciente de nuestro laboratorio determinó diferencias inmunogenéticas después del tratamiento CEM43 30 mNPH, un tratamiento de radiación de 8 Gy y la combinación. Pudimos identificar similitudes y diferencias en la expresión a través de vías inmunes y citotóxicas para obtener una mejor comprensión del mecanismo detrás de los efectos y cómo se combinan sinérgicamente17. Cada experimento utiliza una variedad de muestras de control ambiental y calentado. Los controles tendrán diferentes niveles de expresión de ARNm y proteínas en comparación con los que reciben tratamiento de hipertermia.
Estudios in vivo
En los estudios in vivo hay consideraciones adicionales. Independientemente de la dosis térmica objetivo, es absolutamente esencial mantener una temperatura central fisiológicamente aceptable en el animal que se está tratando. Esto puede ser un desafío con roedores bajo anestesia, ya que la temperatura central se puede perder rápidamente (a menudo son necesarias técnicas de modulación de la temperatura central, como almohadillas térmicas). Las temperaturas corporales más bajas de lo normal pueden requerir la necesidad de llevar el AMF-mNPH demasiado lejos, cuando se trata de lograr una dosis térmica específica en el tumor, lo que resulta en efectos inaceptables en el tejido no objetivo (el calentamiento por corriente de Foucault del tejido no objetivo es una de esas posibilidades). Incluso las desviaciones menores en la temperatura corporal central pueden conducir a complicaciones fisiológicas indeseables en el tumor o el tejido normal. Como se mencionó anteriormente, sin embargo, vale la pena repetirlo, para un calentamiento preciso y reproducible, es esencial lograr una coincidencia entre la concentración de tejido mNP / Fe, la frecuencia de AMF y los parámetros de monitoreo de temperatura de intensidad de campo y el tamaño y la profundidad del tejido objetivo. Debe haber una concentración inicial de mNP dentro del tumor para permitir un calentamiento medible. El nivel/capacidad de calor depende no solo de la concentración de tejido mNP (mg Fe/g de tejido) y su distribución relativa dentro del tumor, sino también de la frecuencia de la HMA y la posterior intensidad de campo. Los cambios en cualquiera de los anteriores pueden conducir a diferentes rangos de temperaturas alcanzables dentro del tejido. A través de muchos años de experiencia, hemos optimizado la concentración que utilizamos para los tratamientos preclínicos de tumores y la frecuencia y la intensidad de campo del sistema AMF para permitir una activación segura y efectiva. Debido a que es imposible medir la temperatura/dosis térmica en todos los sitios de tejido, también es esencial colocar tantas sondas de temperatura de fibra óptica como sea posible en sitios estratégicos que permitan la evaluación de eficacia y seguridad en tiempo real, como se ve en la Figura 2. Estas sondas permiten el registro de temperaturas a lo largo del experimento, lo que permite una dosimetría precisa y una historia térmica del experimento. La Figura 3 muestra las curvas generadas durante un experimento in vivo, destacando la capacidad de monitorear de cerca la temperatura y ajustar el sistema para mantener las temperaturas tumorales dentro del rango deseado. La figura 4 resume los métodos in vivo.
Estos métodos in vivo, similares a los métodos in vitro, se pueden usar para investigar diferentes tipos de cáncer, diferentes dosis de hipertermia y con varios tratamientos combinados. Por ejemplo, estudios previos en nuestro laboratorio han investigado la combinación de hipertermia y quimioterapia12. También hemos completado numerosos experimentos de hipertermia y radiación para la determinación de la eficacia y los mecanismos moleculares. Los ratones de control para estos experimentos se someten a todos los procedimientos, excepto la generación real de hipertermia. La Figura 5 contiene dos diagramas volcánicos que demuestran genes expresados diferencialmente después del tratamiento in vitro e in vivo con hipertermia mNP (mNPH). Estas cifras son ejemplos de cómo utilizamos técnicas moleculares para controlar los efectos de la hipertermia.
Figura 1: Esquema de hipertermia mNP in vitro. Este esquema demuestra el método para la hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro. Para garantizar que se produzca el calentamiento, las células deben recibir suficientes partículas y tiempo para una absorción adecuada de mNP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Colocación de catéteres para monitoreo de temperatura. Esta figura demuestra la colocación de catéteres que albergan las sondas de temperatura de fibra óptica para registrar temperaturas en diferentes lugares del tumor y / o la región tumoral. Esta figura está adaptada de la ref.19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Monitoreo de temperatura en tiempo real durante el tratamiento de un tumor de ratón. Este gráfico demuestra las lecturas de temperatura en tiempo real que permiten monitorear la temperatura corporal central, las temperaturas ambientales y las temperaturas múltiples dentro del tumor, durante un experimento in vivo. El control de las temperaturas dentro del tumor se demuestra a través de las variaciones mínimas a gran escala en la porción ampliada de la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema de hipertermia mNP in vivo. Este esquema demuestra el método para la hipertermia de nanopartículas magnéticas in vivo . La inyección de suficientes nanopartículas, así como el tiempo suficiente para la distribución y absorción, garantiza la capacidad de administrar la dosis térmica deseada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión génica diferencial. Expresión génica diferencial tras el tratamiento in vitro (A) e in vivo (B) de la hipertermia mNP. Estos diagramas de volcanes representan cambios genéticos en un eje x log 2, con importancia en el eje y, tanto para métodos mNPH in vitro como in vivo. Cada círculo representa un gen diferente, con los 20 genes expresados diferencialmente más significativos etiquetados. Cuanto más lejos esté el gen de cero en el eje x, mayor será el cambio de pliegue, y cuanto más alto sea el gen en el eje y, menor será el valor p. Aunque ambos tenían la misma dosis térmica, la hipertermia in vivo condujo a mayores cambios en la expresión génica que in vitro. Estos gráficos son ejemplos de los datos biológicos que se pueden generar utilizando el protocolo descrito. La parcela del volcán in vitro ha sido adaptada de ref.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El diseño y la implementación de este sistema proporciona la capacidad de realizar experimentos precisos y reproducibles de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. Es fundamental que el sistema esté diseñado de tal manera que la frecuencia AMF y la intensidad de campo se ajusten adecuadamente al tipo de nanopartícula magnética, la concentración y la ubicación y temperatura del tejido deseadas. Además, el monitoreo preciso de la temperatura en tiempo real es crucial para la seguridad y el cálculo de una dosis térmica precisa (minutos equivalentes acumulados a 43 °C / CEM). La colocación de las sondas, como se muestra en la Figura 1, permite el monitoreo en tiempo real de la dosis térmica y la temperatura corporal central como se ve en la Figura 2.
El primer paso en la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas es construir un sistema seguro para animales y operadores. Todos los componentes del sistema también deben entenderse bien desde un punto de vista operativo y de entrega. En esta situación, eso significa comprender el potencial de las corrientes de Foucault AMF y saber dónde se encuentran las partículas magnéticas. Las antenas, o bobinas, son un factor clave en la forma y la fuerza del campo, y el sistema de refrigeración utilizado es importante para evitar el sobrecalentamiento de la bobina20. La intensidad de campo fuera del conductor es directamente proporcional a la intensidad de corriente que fluye a través del conductor. La intensidad del campo magnético en cualquier punto del espacio que rodea al conductor es la suma vectorial de los campos producidos por los conductores en el área circundante. El campo magnético se produce en ángulo recto con el flujo de corriente y la fuerza disminuye exponencialmente, en función de la distancia desde el conductor, según la regla21 del cuadrado inverso de Biot-Savart. Por lo tanto, la tubería cuadrada se utiliza para la hipertermia in vivo para un campo más uniforme dentro de la bobina. La creación de un campo magnético con la fuerza y el volumen necesarios para un sistema potencialmente relevante clínicamente, requiere una alta corriente eléctrica. Por lo tanto, los diseños de antenas deben ser capaces de acomodar niveles significativos de potencia eléctrica. Además, las antenas AMF deben diseñarse de manera que su inductancia caiga dentro del rango aceptable del generador de energía. En las frecuencias típicamente utilizadas, la mayor parte del flujo de corriente está en la superficie del conductor de la antena, lo que significa que la superficie afecta el calentamiento resistivo que puede minimizarse eliminando los defectos de la superficie. Este calentamiento resistivo también significa que se necesita un sistema de enfriamiento de bobina para garantizar que la bobina y el ambiente no se sobrecalienten.
Una limitación del diseño de nuestro sistema es que no permite un rango total de frecuencias y campos magnéticos, pero sí permite generar campos que son apropiados para células, roedores y animales grandes. Específicamente, la intensidad de campo máxima disponible de cualquier sistema de calentamiento por inducción está directamente relacionada con el flujo de corriente en la antena (bobina). Los generadores AMF se clasifican en kilovatios, que se calculan multiplicando el voltaje disponible por la corriente disponible (amperios). Por lo tanto, un sistema de 10kW con un límite de 500 V tendría un amperaje máximo de 20 A. El diseño de las bobinas determinará qué límite se alcanza primero y, por lo tanto, el límite del sistema. La intensidad del campo magnético creado por cualquier corriente disminuye exponencialmente en función de la distancia desde el conductor. Por lo tanto, una bobina de mayor diámetro con la misma geometría que una bobina de menor diámetro, ejecutada en el mismo sistema, tendría una intensidad de campo más baja en el centro de la bobina. Por lo tanto, el tamaño y la fuerza del campo magnético requeridos están limitados por la capacidad del generador AMF. La construcción de una bobina más grande y el uso de más energía conduce a preocupaciones adicionales, principalmente el calentamiento por corrientes de Foucault.
Hay varias preocupaciones de seguridad que deben abordarse al usar este sistema para proteger a los usuarios, los animales y el sistema en sí. En primer lugar, se debe mantener una ventilación adecuada de la habitación durante el uso de anestesia. En segundo lugar, todas las áreas asociadas con la bobina deben estar libres de metal y/o conductores, incluidas las mezclas altamente salinas. Los usuarios deben quitarse los anillos y otras joyas cuando trabajen alrededor de la AMF, y las muestras no deben contener ningún tipo de metal. De mayor importancia, las personas con marcapasos u otros dispositivos u objetos implantados deben consultar con su médico antes de trabajar alrededor de la AMF. Para proteger el sistema, se debe utilizar un sistema a prueba de fallas que garantice que se satisfagan las necesidades de enfriamiento del generador y la bobina antes de aplicar energía. Además, se debe utilizar una descripción general de la cámara térmica para detectar el calentamiento no deseado.
Para los estudios in vitro, los pasos más importantes a seguir son la concentración de hierro en las células, la concentración de células, los parámetros de AMF y la evaluación de la dosis térmica. Las células pueden ser tratadas / calentadas con hipertermia de nanopartículas magnéticas colocando las nanopartículas magnéticas en el sobrenadante, las células o ambos. La cantidad de calentamiento de nanopartículas magnéticas dependerá del nivel de nanopartículas magnéticas/Fe. Si el deseo es tratar solo células con hierro internalizado, nuestra experiencia es que las células cancerosas individuales solo absorberán un número limitado de nanopartículas magnéticas y que incluso cuando la absorción es óptima, las células deben agregarse / peletizarse para crear una situación de calentamiento celular, incluso con AMF optimizada. Mantener la temperatura de los medios y las células en niveles biológicamente relevantes (cuando no se calientan) también es importante para la medición precisa del calentamiento verdadero. La bobina solenoide de 14 vueltas descrita aquí permite mantener temperaturas biológicamente relevantes sumergiendo las muestras en una columna de agua controlada térmicamente.
Para los estudios in vivo, mantener la temperatura central del animal y medir con precisión la temperatura dentro del tumor son factores clave. Este sistema de contención animal y el diseño de la bobina eliminan la deriva térmica en el entorno del animal debido a la configuración de bobina / potencia y ayudan a mantener la temperatura corporal central normal. Mantener la temperatura central del cuerpo es fundamental para obtener resultados significativos del experimento. La sonda rectal permite el monitoreo en tiempo real de la temperatura central del animal. Cuando está bajo anestesia, la temperatura central de un animal disminuye inherentemente. Para abordar esta situación, desarrollamos un sistema de calefacción ambiental que suministra aire caliente alrededor del recipiente de contención del animal, permitiendo que la temperatura central permanezca en el rango normal. Mantener la temperatura central normal es esencial para garantizar una interpretación precisa de los resultados del tratamiento de hipertermia y la eliminación de los factores ambientales. La colocación de las sondas de monitoreo de temperatura en múltiples sitios en el tejido / tumor objetivo es importante para obtener una evaluación precisa de la temperatura y la dosis térmica alcanzadas. Debido a que es extremadamente difícil, si no imposible, distribuir nanopartículas magnéticas homogéneamente dentro de un tumor, conocer los parámetros de calentamiento en múltiples sitios es esencial para lograr una dosis térmica tisular / tumoral consistente y precisa. Es importante señalar que la concentración para estudios in vitro e in vivo es variable. Esta variación se debe a que hay menos límites en el cultivo celular y las células tienen más acceso a los mNP, por lo que se puede usar una concentración más baja. In vivo, es necesaria una mayor concentración debido a la naturaleza heterogénea de los tumores y la complicada morfología 3D. Por lo tanto, el uso de la misma concentración de partículas in vivo e in vitro conduciría a que las células absorbieran muchas menos.
Este manuscrito describe los parámetros y la instrumentación necesarios para desarrollar un generador de campo magnético alterno eficaz y flexible y un sistema de bobina para tratamientos de hipertermia de nanopartículas magnéticas. Este sistema se puede utilizar tanto para estudios in vitro como in vivo. El sistema es efectivo para la hipertermia localizada / dirigida y la preservación del tejido normal, lo que lo hace atractivo, en comparación con otros sistemas de hipertermia AMF-mNP. Estos tratamientos de hipertermia pueden modificarse para investigar los efectos de diferentes dosis, con una variedad de nanopartículas o nanoportadores y tratamientos complementarios. Dado que el calentamiento de tejidos, especialmente el calentamiento de nanopartículas magnéticas, puede verse afectado por tantas variables, es esencial comprender los parámetros en una investigación. Si se cumplen estos criterios, la hipertermia magnética de nanopartículas puede abordar muchas situaciones moleculares, celulares y clínicas, incluido el control tumoral independiente y adyuvante. Aunque los métodos descritos aquí requieren un esfuerzo significativo, si se siguen las pautas, se puede realizar todo el potencial de la hipertermia mNP.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue financiado por los números de subvención: NCI P30 CA023108 y NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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