Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantantitation af rabiesvirus i forskellige kvæghjernestrukturer

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Denne protokol præsenterer en qRT-PCR-baseret tilgang til bestemmelse af rabiesviruskerneroprotein (N) genkopinummer inden for forskellige anatomiske strukturer for kvæghjerne ved hjælp af in vitro-transskription.

Abstract

Kvægparalytisk rabies (BPR) er en form for viral encephalitis, der er af væsentlig økonomisk betydning i hele Latinamerika, hvor den udgør en stor zoonotisk risiko. Her var vores mål at bruge en laboratorieprotokol til at bestemme det relative kopinummer af rabiesvirusgenomet (RABV) i forskellige anatomiske strukturer i kvæghjernen ved hjælp af kvantitative omvendte transskriptionspolysekædereaktioner i realtid (qRT-PCR). qRT-PCR kvantificerer det specifikke antal genkopier, der er til stede i en prøve, baseret på fluorescens, der udsendes efter forstærkning, og som er direkte proportional med den mængde målkernesyre, der er til stede i prøven. Denne metode er fordelagtig på grund af dens korte varighed, reduceret risiko for kontaminering og potentiale til lettere at påvise virale nukleinsyrer i forskellige prøver sammenlignet med andre teknikker. Hjernen hos seks rabiat dyr blev opdelt i seks anatomiske strukturer, nemlig Ammons horn, cerebellum, cortex, medulla, pons og thalamus. Alle hjerner blev identificeret som positive for RABV antigener baseret på en direkte immunfluorescens test. De samme anatomiske strukturer fra hjernen hos fire RABV-negative kvæg blev også vurderet. RNA blev udvundet fra hver struktur og brugt til qRT-PCR. En analyse blev udført for at bestemme kopinumrene af RABV-gener ved hjælp af et in vitro transskriberet nukleoprotein-gen. Den standardkurve, der blev brugt til at kvantificere viralt RNA, udviste en effektivitet på 100% og linearitet på 0,99. Analyse viste, at cortex, medulla og thalamus var de ideelle CNS-portioner til brug i RABV-detektion, baseret på observationen af, at disse strukturer havde de højeste niveauer af RABV. Test specificitet var 100%. Alle prøver var positive, ingen falske positiver blev opdaget. Denne metode kan bruges til at påvise RABV i prøver, der indeholder lave niveauer af RABV under diagnosticering af BPR.

Introduction

Rabies kan bekræftes ante mortem og post mortem ved forskellige teknikker, der gør det muligt at opdage virale nukleinsyrer i hjernen, huden, urinen eller spyt1. Påvisning af rabiesviruskerneprotein (N) anvendes primært til rabiesdiagnose ved molekylære tests. Dette gen bruges også til viral genotyping. Rabies kan diagnosticeres hos dyr ved hjælp af en hvilken som helst del af den berørte hjerne; for at udelukke muligheden for rabies skal væv fra mindst to områder i hjernen dog testes2. Der findes flere diagnostiske metoder til påvisning af rabies hos dyr; Den direkte immunfluorescenstest forbliver dog standardreferenceteknikken3. Andre tests omfatter biologiske tests, der indeholder museinokulation, infektion i vævskultur og polymerasekædereaktion (PCR)4. Alle disse teknikker anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) og Verdenssundhedsorganisationen (OIE) til diagnosticering af rabies hos henholdsvis mennesker og dyr5.

Nukleinsyredetektions- og forstærkningsteknikker har revolutioneret diagnosticeringen af rabies i de senere år6, og disse teknikker spiller en vigtig rolle i den levende diagnose af human rabies. Flere PCR-baserede test er blevet evalueret som supplement til konventionelle test for rabiesdiagnoser før og efter slagtning 7,8,9,10. De fleste assays målrette rabies viral nucleoprotein gen for forstærkning , som er den mest bevarede region i det virale genom1,11. I de sidste 20 år er forskellige molekylære assays blevet udviklet til at diagnosticere RABV, og nogle af disse assays er blevet brugt til viruskarakterisering. De fleste forsøg har haft til formål at opdage bevarede gener inden for det virale genom, oftest ved hjælp af konventionelle eller kvantitative real-time polymerase kædereaktion (qRT-PCR) assays12,13.

PCR er en meget følsom diagnostisk teknik, der kan detektere genomet af et givet patogen i væv, selv når disse væv nedbrydes. Ved hjælp af PCR-baserede metoder kan minimale mængder af et infektiøst middel påvises i en klinisk prøve gennem selektiv og gentagen forstærkning af en DNA-nukleotidsekvens14. qRT-PCR, der indeholder fluorescerende sonder (f.eks. TaqMan) eller DNA-bindende farvestoffer (f.eks. SYBR Green) er blevet anvendt i forsøg med at diagnosticere RABV både ante- og post- mortem med høj følsomhed; En sådan tilgang kræver imidlertid specialiseret udstyr. For at overvinde denne begrænsning er omvendt transskriberingssløjfemedieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP) blevet foreslået på grundlag af dens lave omkostninger, enkelhed og ønskelige egenskaber til påvisning af RABV. Denne analyse er særlig vigtig , da den kan anvendes i udviklingslandene15.

qRT-PCR er baseret på detektion og kvantificering af et molekyle, hvor lysstofrørsforøgelser er i direkte forhold til mængden af PCR-produkt i en enkelt reaktion. Efterhånden som antallet af kopier af nukleinsyremålet stiger, øges fluorescensen også. Ikke-specifikke interkalke farvestoffer såsom SYBR Green DNA-bindende farvestof eller sekvensspecifikke oligonukleotid sonder transporterer en fluorophore og en quencher er almindeligt anvendt til at give fluorescerende udlæsning i qRT-PCR. Denne analyse giver fordele i forhold til konventionelle RT-PCR, der omfatter en kortere testtid (2-4 timer), reduceret risiko for forurening på grund af det lukkede rørsystem (manglende post-PCR-manipulation af forstærkede produkter) og evnen til at opdage forskellige mål samtidigt16. qRT-PCR kan bruges til at diagnosticere rabies ante mortem fra spyt og andre prøver. Denne analyse kan også bruges som en universel realtidstest til påvisning af forskellige Lyssavirusarter eller afstamninger af RABV15. I denne kombination RT-PCR tilgang, to reaktioner anvendes. Den første registrerer forskellige genetiske linages af RABV, og den anden registrerer Lyssavirus-arten. Begge trin involverer qRT-PCR-assays, hvor den første bruger hybridiseringssonder, og den anden bruger farvestoffer15. På grund af det store antal test, der har vist vellykket molekylær påvisning af RABV ved hjælp af denne teknik, anbefaler den nuværende OIE Terrestrial Manual (2018) brugen af PCR til molekylær påvisning af RABV17.

Mexico er et land med et betydeligt husdyrpotentiale. De stater med den højeste husdyrproduktion indeholder både fugtige tropiske regioner og tørre regioner, der er i fare for rabiesudbrud på grund af tilstedeværelsen af vampyrbatet Desmodus rotundus, den vigtigste sender af rabies. Det er derfor vigtigt at udvikle flere værktøjer til forebyggelse og bekæmpelse af paralytisk rabies hos kvæg i México. Baseret på dette var formålet med denne undersøgelse at anvende kvantitative qRT-PCR til at bestemme antallet af viruspartikler i forskellige anatomiske strukturer hos kvæghjerner efter døden på grund af rabiesinfektion.

Seks hjerner fra RABV-positive kvæg blev doneret af et eksternt laboratorium til brug ved udviklingen af qRT-PCR-protokollen beskrevet nedenfor. Prøverne af kvæghjernens struktur blev koldkædet transporteret til INIFAP CENID-MA-laboratoriet BSL-2-anlægget og opbevaret ved -80 °C indtil brug. Hjerner blev fremstillet af dyr fra staterne Campeche, Yucatán og Querétaro. Forud for kvitteringen blev forskellige strukturer dissekeret fra hjernen. Disse strukturer omfattede Ammon's horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, og thalamus18,19. Genetisk materiale blev udvundet som beskrevet nedenfor. RABV-diagnosen blev bekræftet ved hjælp af direkte fluorescerende antistoffer (DFA)20. Som en positiv kontrol blev musehjerner, der blev podet med RABV21, brugt. Derudover blev fire RABV-negative kvæghjerner (som bestemt af DFA) anvendt som negative kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af og gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne for anvendelse af dyr fra Den Institutionelle Dyrepleje- og Brugskomité (IACUC) under Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Prøver

  1. Brug forskellige områder af hjernen dissekeret fra 6 forskellige rabies-positive kvæg hjerner til RT-PCR analyse.

2. Direkte fluorescerende antistoffer (DFAs) for at bekræfte rabies

BEMÆRK: Påvisning af rabiesantigenet ved hjælp af DFA er en kvalitativ metode til bestemmelse af tilstedeværelsen af rabieskerneprotein ved hjælp af fluoresceinmærkede antistoffer. Testen blev udført ved hjælp af protokollen fra Dean et al. (1966)20, som beskrevet nedenfor.

  1. Gør to indtryk fra hvert væv dissekeret fra forskellige hjernestrukturer på en steril rutsjebane med en diameter på ca. 15 mm. Brug en træapplikator til at smøre en ca. 3 mm3 del af vævet på den sterile rutsjebane. For at oprette smøringen skal du forsigtigt trykke træapplikatoren mod diaset manuelt.
  2. Prøvestværnet fastgøres ved at nedsænke lysbillederne i 100 % acetone i 1 time ved -20 °C. Efter inkubation tørres rutsjebanerne på en tør klud ved 21 °C i 30 min.
  3. Der tilsættes 50 μL af det fluorescerende antikerneproteinantistof til hver hjernestrygning ved en 1:10 fortynding ved dispensering gennem en sprøjte.
  4. Indsnævr rutsjebanerne med konjugatten i et fugtigt kammer ved 37 °C i 1 time.
  5. Efter inkubation vaskes rutsjebanerne to gange med vand og med PBS for at eliminere overskydende konjugat. Lad rutsjebanerne tørre ved 21 °C. Forsigtigt blot for at fjerne overskydende væske og derefter kortvarigt lufttørre før montering.
  6. Tilsæt en dråbe på 50% fosfatglycerin for at dække overfladen af sektionen, og dæk derefter med en coverlip. Overhold sektionerne under et epifluorescensmikroskop ved 40x forstørrelse.
    1. De positive og negative kontroller (positiv kontrol: musehjerner podet med RABV, negativ kontrol: RABV-negative kvæghjerner) behandles og observeres på samme måde som prøverne.

3. Generering af positiv kontrol til RT-PCR

  1. Hent BHK-21 celler fra kimpelasmabanken. Brug celler op til 70th passage til at kopiere RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) stamme ved hjælp af passage 2.
  2. Bhk-21-cellerne opbevares og formeres i flasker, der indeholder essentielt minimumsmedium (MEM), suppleret med 10 % føtalt kalveserum (FCS) ved 37 °C i overværelse af CO2 (5 %) og under fugtige forhold. Dyrk cellerne i 25 cm2 dyrkningskolber, indtil de når 80% sammenløb og derefter subkultur.
  3. Fjern dyrkningsmediet fra cellerne og vask flasken med fosfat bufferet saltvand (PBS). Pod kulturen med 105 TCID/mL RABV-stamme ERA. Det virale inoculum inkuberes i 2 timer under konstant omrystning ved 37 °C i nærværelse af CO2 (5%) og under fugtige forhold.
  4. Fjern infektionsmediet og tilsæt MEM suppleret med 5% (serum føtalt kvæg) SFB. Inkuberes i 72 timer ved 37 °C i nærværelse af CO2 (5%) under fugtige forhold.
  5. Høst RABV 3 dage efter podning, når cellerne udviser cytopatiske virkninger. De inficerede celler fryses og tøses derefter ved 4 °C for at lyse cellerne. Mediet opsamles fra flasken, og derefter anbringes cellerne i et centrifugerør til centrifugering ved 1.050 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  6. Supernatanterne opbevares fra RABV ved -80 °C, og der tilberedes arbejdsmidler til opbevaring ved -70 °C.
  7. Intracerebrally pode virus opnået i det foregående trin i 21 dage gamle kvindelige CD1 mus. Brug en 1 mL sprøjte til at vaccinere 50 μL opløsninger indeholdende 106 MICLD50 (mus infektiøs kultur dødelig dosis 50%) doser i mus22.

4. RNA-ekstraktion

BEMÆRK: Det samlede RNA blev udvundet direkte fra kvæghjerner ved hjælp af en organisk ekstraktionsmetode i henhold til følgende protokol.

  1. Brug 100 mg hjernevæv fra hver anatomisk struktur til at udtrække det samlede RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt reagens, der indeholder guanidium isothiocyanat.
  2. Homogeniser i alt 100 mg væv fra hver struktur i 1 ml af guanidium isothiocyanat reagens ved hvirvelstrømning ved hjælp af en Dounce homogenisator med en lille pestle inde i mikrorøret i 15 s ved maksimal hastighed.
  3. Prøverne inkuberes på is i 5 min. og tilsættes derefter 200 μL kloroform. Prøverne blandes kraftigt i 15 s, inkuberes på is i 2 til 3 min, og centrifugeres derefter ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  4. Vandfasen overføres til et rent rør, og der tilsættes 500 μL isopropylalkohol. Prøverne inkuberes i 15 minutter ved 21 °C.
  5. Prøverne centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirere den vandige supernatant ved pipetter. Det isolerede RNA vil være til stede som en pellet i røret.
  6. Derefter vaskes RNA-pellet med 1 mL 75% ethanol ved pipetting og centrifuge ved 7500 x g i 5 min ved 4 °C.
  7. Supernatanten dekanteres og lufttørres RNA-pellet ved stuetemperatur (21 °C). Dernæst fortyndes pellet i 50 μL af nuklease-fri vand.
  8. RNA-koncentrationen og -kvaliteten bestemmes ved 260 nm ved hjælp af et spektrofotometer. RNA opbevares ved -80 °C, indtil det bruges.
  9. Dna fjernes fra RNA-prøver ved fordøjelse med DNase I. Der tilsættes 2 U DNase I pr. 1 μg RNA udvundet i det foregående trin. Dernæst tilsættes 5 μL 10x reaktionsbuffer og inkuberes derefter ved 37 °C i 30 min. DNase I inaktiveres ved at tilsætte 1 μL EDTA til blandingen efterfulgt af inkubation i 10 minutter ved 65 °C.

5. cDNA syntese og PCR

  1. Syntetisere første-streng cDNA ved hjælp af oligo dT og omvendt transcriptase. For hver 1 μg RNA tilsættes 1 μL oligo DT (500 μg/mL), 1 μL 10 mM dNTP-blanding og nukleasefrit destilleret vand til et slutvolumen på 12 μL. Blandingen inkuberes ved 65 °C i 5 min.
  2. Reaktionsblandingen afkøles til 4 °C. Røret centrifugeres i 30 s ved 1.050 x g, og der tilsættes derefter 4 μL reaktionsbuffer, 2 μL 0,1 M DTT og 1 μL ribonukleasehæmmer (40 U/μL).
  3. Reaktionsblandingen inkuberes ved 37 °C i 2 min., og derefter tilsættes 1 μL omvendt transskription (200 U). Derefter inkuberes reaktionsblandingen i 50 minutter ved 37 °C, og reaktionen aktiveres derefter ved 70 °C i 15 min.
  4. CDNA opbevares ved -20 °C inden brug.
    BEMÆRK: For at kontrollere kvaliteten af den syntetiserede cDNA skal du udføre forstærkningen af et 761 bp-fragment af RABV N-genet, inden du udfører syntesein vitroen. Brug den protokol, der er beskrevet af Loza-Rubio et al.11, som beskrevet i trin 5.5 nedenfor.
  5. Udfør PCR ved hjælp af Taq DNA polymerase under følgende betingelser. Udfør den reaktion, der er oprettet som følger: 10x Taq-buffer, der indeholder 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP'er, 1 U Taq polymerase, 10 μM af hver primer (SuEli+: 5' cgtrgaycaatatgagtaca 3' og SuEli-: 5' caggctcraacattcttta 3′), 2,5 μL cDNA og ultrapure vand til et sidste volumen på 50 μL.
  6. Forstærkningen udføres i en termocykel ved hjælp af følgende cykelforhold: 95 ° C i 3 min. 35 cyklusser på 95 ° C for 30 s, 60 °C for 30 s og 72 °C i 1 min. en cyklus på 72 °C i 7 min.
  7. Vurder tilstedeværelsen af 761 bp PCR-produkter ved hjælp af en 1% agarose gel.

6. In vitro-transskription

BEMÆRK: In vitro transskribering genererer mRNA af et målgen. Brug et primerpar, der forstærker det komplette RABV N-gen og et, der bruges som en positiv kontrol til qRT-PCR-analysen. Disse primere er designet til at forstærke det komplette RABV N-gen og tilføje en promotor, der genkender T7 polymerase (TAATACGACTCACTATAG).

  1. For at forstærke hele N-genet RABV skal du bruge primerne Trans-Nrab fremad (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) og vende (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) og et HI-fi PCR-sæt.
    1. For hver reaktion skal du forberede en PCR-masterblanding ved at tilføje en ren PCR-rørreaktionsbuffer 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTP' er, 10 μM af hver primer, 0,5 U af high-fidelity polymerase, 1,5 μL cDNA (tilberedt i trin 5) og ultrapure vand til et endeligt volumen på 50 μL.
    2. Der anvendes en termocykelmotor, der er indstillet til følgende betingelser for forstærkning: 94 °C i 1 min. 4 cyklusser på 94 °C i 1 min., 40 °C i 1 min. og 72 °C i 2 min. 35 cyklusser på 94 °C i 1 min., 60 °C i 1 min. og 72 °C i 2 min. sidste forlængelse på 72 °C i 2 min.
  2. At bruge PCR-produktet som skabelon til in vitro-syntesen og fjerne komponenter af den enzymatiske reaktion fra trin 6.1.2, rense PCR-produktet ved hjælp af et kolonnebaseret koncentratorsæt i overensstemmelse med producentens anvisninger og derefter kvantificere ved hjælp af et spektrofotometer.
  3. Til RNA-syntese skal der anvendes et in vitro-transskriptionssæt med følgende reaktionsblanding: 5 μL T7 Transskription 5x buffer, 1,9 μL af hvert triphosphatkernekleotid, 10 μg renset RABV N DNA VP2 DNA og 2,5 μL af enzymblandingen. Derefter inkuberes blandingen ved 37 °C i 4 timer. Derefter tilsættes 1 μL 1 U/μg RNase-Fri DNase til reaktionsblandingen og inkuberes i 15 minutter ved 37 °C for at eliminere DNA-kontaminering.
  4. Det indadskrives RNA, og koncentrer det derefter ved hjælp af phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1).
  5. Den rensede RNA-pellet opsnappes til 70 μL TE-buffer og opbevares derefter ved -80 °C, indtil den bruges.
  6. Pcr-protokollen gentages fra trin 6.1 til ca. 5 μg PCR-produkt. Efter rensning og koncentration vil det in vitro transskriberede N-gen mRNA være til stede i en koncentration på 4,711 μg/μL.
  7. Bekræft, at det in vitro transskriberede mRNA svarer til N-genet efter trin 5 i denne protokol, og brug dette som en positiv kontrol for den omvendte transskriptionspolysekædereaktion i realtid (qRT-PCR).

7. Real-time omvendt transskription polymerase kædereaktion (qRT-PCR)

  1. For qRT-PCR skal du bruge en in vitro mRNA-udskrift, der kodper det komplette N-gen som en positiv kontrol sammen med et kommercielt qRT-PCR-kit i et trin ved hjælp af hybridiseringssonder i henhold til producentens instruktioner. Brug sonden og primere beskrevet af Carneiro et al. (2010)23 til at opdage en bevaret region af RABV genet N (BRDesrot-Rev: 5' aaactcaagagaaggccaacca 3', BRDesrot-Fwd: 5 'cgtactgatgtgggggggaattg 3', og BRDesrot-Probe: 5'-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Brug følgende termiske cykelforhold: 1 cyklus på 50 °C i 10 min. og 95 °C i 2 min. 40 cyklusser på 95 °C for 15 s og 50 °C for 30 s.

8. Kalibreringskurve eller standardkurve

  1. Der udføres serielle fortyndinger af det in vitro transskriberede mRNA ved serielt at pipette 1 μg/μL mRNA i rør, indtil der opnås seks dekoplefortyndinger. Forbered rør ved et 100 μL volumen i tre eksemplarer til brug ved oprettelse af standardkurven. Udfør qRT-PCR som beskrevet i trin 7.
  2. Udfør qRT-PCR i en termocykel med en rotor ved at behandle de forskellige hjerneprøver samtidig med de kørende reaktioner for at skabe standardkurven og bruge positive kontroller, negative kontroller og supernatants isoleret fra cellekultur.
  3. For at vurdere testens detektionsgrænse, testeffektivitet og følsomhed skal der anvendes en standardkurve i tre eksemplarer under de samme betingelser.

9. QRT-PCR af biologiske prøver

  1. Til påvisning af RABV-gen N skal du bruge RNA'et fra feltprøver, positive kontroller, negative kontroller og supernatanter for cellekultur til at udføre qRT-PCR ved hjælp af PCR-sættet, der er beskrevet i trin 7.
  2. For at bestemme antallet af kopier af RABV-genomet i kvæghjerneprøverne skal der indhentes Ct-data fra standardkurven og biologiske prøver og fra dem, der interpoleres fra kalibreringskurveligningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DFA resultater viste 100%, 100%, 83,3%, 66%, og 50% positivitet for RABV i cortex, thalamus, medulla, pons, og horn, hhv. Disse resultater bekræftede de tidligere resultater, og mindst tre af de strukturer, der blev dissekeret fra hver hjerne, var positive for RABV. Figur 1viser en repræsentativ positiv DAF-farvning .

Figur 2 viser forstærkningen af et fragment af RABV N-genet (trin 5.5) med primernes første, der er rapporteret af Loza-Rubio et al.11. Dette viste, at det materiale, der blev opnået til forstærkning, var af god kvalitet.

Størrelsen af det PCR-forstærkede fragment er vist i figur 3. Ligningen af standardkurven viser forholdet mellem mængden af RABV-genetisk indhold i en prøve og størrelsen af det PCR-forstærkede fragment. Mængden af RABV-genetisk indhold (in ng) blev udledt ved interpolering af Ct-værdierne i kalibreringskurven ved hjælp af ligningen i figur 4. Ved hjælp af denne ligning blev det konstateret, at detektionsgrænsen på 1 x10 5 μg/μL viralt RNA svarede til 36 kopier af RABV-genomet. Disse resultater viser, at analysen er følsom og kan bruges til at detektere virus i prøver, der indeholder et lavt antal kopier RABV N gen. Analysens effektivitet blev beregnet ved hjælp af hældningen af standardkurven, som var -3,28. De prøver, der blev anvendt til qRT-PCR, viste forstærkning af RABV N-genet.

For at bestemme antallet af virale kopier, der var til stede, blev Ct-værdierne for hver prøve interpoleret ved hjælp af kalibreringskurveligningen. Det opnåede resultat (i nanogram) blev erstattet af følgende formel som beskrevet nedenfor fra følgende ref.24:

Antal kopier RABV N gen = (ng prøve * 6,022 x 1023) / (104 bp (længden af PCR produkt) * 1 x 109 * 650).

Forholdsvis, resultaterne af qRT-PCR assays var i overensstemmelse med dem, der opnås ved hjælp af DFA. Ifølge resultaterne af qRT-PCR-testen i tilfælde C og D (tabel 1) er thalamus den struktur, der har det højeste antal kopier af RABV N-genet. Dette tyder på, at tidlig infektion af hypothalamic og thalamic neuroner er vigtig i udviklingen af sygdommen, da disse neuroner styrer et dyrs vegetative funktioner. Kopinumrene for rabv N-genet, som blev påvist i hver struktur af hver prøve, er vist i tabel 1. Følsomheden og specificiteten af qRT-PCR-testen var begge 100%, da alle prøver var positive. Dette resultat er i overensstemmelse med de første diagnoser af prøverne.

Figure 1
Figur 1: Hjernevæv fra kvæg, der viser positiv farvning i henhold til den direkte immunfluorescenstest, der registrerer rabiesvirusprotein N i inficeret væv. En æblegrøn farve observeres ved farvning, hvor antistoffet binder sig til rabiesantigenet. Skalalinje: 50 μm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: 1,5% agarosegel, der viser forstærkningsprodukterne. Forstærkning af et 761 bp fragment af RABV N-genet for at demonstrere tilstedeværelsen og kvaliteten af cDNA, der skal anvendes i in vitro-transskription. Bane 1 indeholder en molekylvægtmarkør, linje 2: forstærkning af positiv kontrol; vognbane 3: negativ kontrol (ikke-inficeret prøve) linje 4: forstærkning af cDNA, der anvendes til in vitro-transskription. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: 1,5% agarosegel, der viser forstærkningsprodukterne. Forstærkning af det komplette N-gen er vist i bane 2. Bane 1 indeholder en molekylvægtmarkør, og bane 3 indeholder den negative forstærkningskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Standardkurve for qRT-PCR ved hjælp af in vitro transskriberet N-gen mRNA til at kvantificere antallet af kopier af RABV N-genet. Klik her for at se en større version af dette tal.

ID-hjerne struktur DAF Antal kopier (x109)
A. Ammons horn + 0.261
lillehjerne + 0.0663
cortex + 0.02
Medulla + 0.146
Pons + 30.7
thalamus + 108
b Ammons horn - 0.0251
lillehjerne + 4.64
cortex + 12.4
Medulla + 0.175
Pons \u2012 0.0721
thalamus + 121
C. Ammons horn \u2012 0.168
lillehjerne + 0.0239
cortex + 21.5
Medulla + 17.2
Pons + 1.32
thalamus + 102
D. Ammons horn + 11.8
lillehjerne + 0.0239
cortex + 8.72
Medulla + 1.25
Pons \u2012 0.0165
thalamus + 33.4
E. Ammons horn + 4.15
lillehjerne + 6.78
cortex + 1.53
Medulla + 1.41
Pons + 0.025
thalamus + 95
F. Ammons horn + 0.0221
lillehjerne \u2012 0.00023
cortex + 4.95
Medulla \u2012 0.000556
Pons + 1.02
thalamus + 89

Tabel 1: Bestemmelse af antallet af kopier af RABV N-genet inden for hver hjernestruktur. Resultaterne blev opnået fra seks anatomiske strukturer af RABV-positive kvæghjerner diagnosticeret ved hjælp af DFA. De ord, der fremhæves med fed skrift, angiver de strukturer, der har flest kopier. Resultaterne blev udtrykt som antallet af kopier af N-genet pr. milligram væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere undersøgelser har vist, at DFA kun kan påvise RABV senest syv dage efter, at prøven er blevet opbevaret ved stuetemperatur (21 °C)14. I modsætning hertil viste dette arbejde, at RT-PCR's følsomhed begynder at falde, efter at prøverne har været udsat for stuetemperatur i 12 dage. Derfor kan RABV-genomet detekteres ved qRT-PCR i prøver, der udsættes for stuetemperatur i op til 23 dage. Dette viser, at følsomheden af qRT-PCR er relativt højere for mere nedbrudte prøver. Det er dog stadig nødvendigt at udvikle enklere metoder, der ikke kompromitterer specificitet25. Den nuværende forskning viste en molekylær analyse, der besidder højere følsomhed end DFA, baseret på den observation, at det var i stand til at opdage det virale genom uanset den specifikke hjernestruktur.

Fordelene ved RT-PCR-teknikken til brug ved påvisning af infektiøse stoffer er blevet fremhævet i flere videnskabelige undersøgelser. Denne teknik kan dog udvise nogle ulemper, såsom omkostninger ved udførelse, da det kræver specialiseret udstyr. Uddannet personale er forpligtet til at håndtere molekylærbiologiske assays. Derudover skal det nævnes, at nogle af trinnene som en meget følsom teknik er afgørende for at opnå de bedste resultater. En af disse er korrekt håndtering af prøver til RNA-ekstraktion. Dette trin er afgørende, da RNA let nedbrydes, og resultaterne derfor kan blive påvirket. Overvej at vedligeholde prøven under kolde forhold (ca. 4 °C) under processen. Derudover mener, at flere runder af PCR ansøgning udføres som nævnt i trin 6.1 til at generere udskrift in vitro. Dette skyldes, at en stor mængde genetisk materiale er nødvendig for reaktionen på at give betydelige (mere end milligram) mængder DNA. Et andet afgørende aspekt af denne analyse er kravet om rensning af det genetiske materiale i kolonnerne, da DNA også kan gå tabt i dette trin.

qRT-PCR er kendt for at være lige så specifik som DFA-testen, som er den standardtest, der er godkendt af WHO og OIE. Molekylære analyser, der anvender RT-qPCR, har imidlertid vist sig at have en højere følsomhed og dermed give mulighed for analyse af prøver med en højere grad af nedbrydning for at lette påvisningen af et relativt lille antal kopier af det virale genom. Det er også meget hurtigere, reducerer risikoen for forurening og kan bruges før mortem26,27.

Bingham og van Der Merwe (2002)28 gennemførte en undersøgelse ved hjælp af DFA for at afgøre, hvilke hjernestrukturer der havde højere koncentrationer af RABV N-genet. I alt 252 hjernestrukturer fra flere arter blev evalueret. Thalamus, pons og medulla var de mest relevante hjernestrukturer, da de var positive i alle evaluerede hjerneprøver. Disse resultater er enige i de resultater, der præsenteres her, som var i overensstemmelse med DFA resultater i følgende strukturer: cortex og thalamus, 100%; medulla, 83,3%; 66%; og horn, 50%. I modsætning hertil rapporterede tidligere undersøgelser ingen falske negativer. I dette arbejde blev nogle negative resultater opdaget i komplette hjernestrukturer, der tidligere var blevet diagnosticeret som positive. Dette kan skyldes, at den del af prøven, der blev anvendt til testen, ikke indeholdt viruspartikler identificeret ved antistoffet eller den mere følsomme molekylære analyse. En anden mulig forklaring er, at prøverne ikke blev transporteret korrekt eller opbevaret før modtagelsen i laboratoriet.

Den qRT-PCR-analyse, der udføres i denne undersøgelse, kan detektere så få som 36,3 kopier af RABV N-genet pr. milligram væv. De mest egnede hjernestrukturer til qRT-PCR omfattede cortex og thalamus. Dette er baseret på observationerne af, at der blev påvist højere koncentrationer af RABV N-genet i disse strukturer, og at de også blev anset for at være positive ved hjælp af RABV-referencetesten. Testen var i stand til at påvise meget lave koncentrationer (0,00023 x 109 kopier) af virus i forskellige prøver. Ud over at kvantificere viruspartiklerne i prøven synes testen at være et godt alternativt diagnostisk og forskningsværktøj til påvisning af RABV.

Med de resultater, der er opnået ved hjælp af rabiesvirus viral genomdetekteringsprotokollen præsenteret her, forventes det, at denne teknik kan anvendes til molekylær diagnose af virussen i forskellige typer prøver, da den er i stand til at detektere minimale mængder af det virale genom. Dens største fordel i forhold til andre metoder som DFA er, at den er mere følsom og kan bruges før-mortem, som det er blevet foreslået af andre forfattere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP). Vi takker Jerzayn Fraustro Esquivel for hans samarbejde om udviklingen af videoen i forbindelse med dette dokument.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

Immunologi og infektion Problem 171 virus paralytisk rabies hos kvæg qRT-PCR diagnose zoonose hjerne
Kvantantitation af rabiesvirus i forskellige kvæghjernestrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter