Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av rabiesvirus i olika nötkreaturs hjärnstrukturer

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Detta protokoll presenterar en qRT-PCR-baserad metod för att bestämma rabies virus nukleoprotein (N) gen kopia nummer inom olika nötkreatur hjärnan anatomiska strukturer med hjälp av in vitro transkription.

Abstract

Bovin paralytisk rabies (BPR) är en form av viral encefalit som är av betydande ekonomisk betydelse i hela Latinamerika, där det utgör en stor zoonotisk risk. Här var vårt mål att använda ett laboratorieprotokoll för att bestämma det relativa kopieringsnumret för rabiesvirusets (RABV) genom i olika nötkreatur hjärnan anatomiska strukturer med kvantitativ realtid omvänd transkription polymeras kedjereaktion (qRT-PCR). qRT-PCR kvantifierar det specifika antalet genkopior som finns i ett prov baserat på fluorescens som avges efter förstärkning och som står i direkt proportion till den mängd målkärnsyra som finns i provet. Denna metod är fördelaktig på grund av dess korta varaktighet, minskad risk för kontaminering och potential att lättare upptäcka viruskärnor i olika prover jämfört med andra tekniker. Hjärnan hos sex rabiata djur delades in i sex anatomiska strukturer, nämligen Ammons horn, lillhjärna, cortex, medulla, pons och thalamus. Alla hjärnor identifierades som positiva för RABV antigener baserat på ett direkt immunofluorescens test. Samma anatomiska strukturer från hjärnan hos fyra RABV-negativa nötkreatur bedömdes också. RNA extraherades från varje struktur och användes för qRT-PCR. En analys utfördes för att bestämma kopieringsnumren av RABV gener med hjälp av en in vitro transkriberad nukleoprotein gen. Standardkurvan som används för att kvantifiera viralt RNA uppvisade en effektivitet på 100% och linjäritet på 0,99. Analys visade att cortex, medulla och thalamus var de idealiska CNS delar för användning i RABV upptäckt, baserat på observationen att dessa strukturer hade de högsta nivåerna av RABV. Testspecifikiteten var 100%. Alla prover var positiva, inga falska positiva identifieringar upptäcktes. Denna metod kan användas för att upptäcka RABV i prover som innehåller låga nivåer av RABV under diagnos av BPR.

Introduction

Rabies kan bekräftas ante-mortem och post-mortem av olika tekniker som gör det möjligt att upptäcka virala nukleinsyror i hjärnan, huden, urinen eller saliv1. Påvisande av rabiesviruskärnan(N)används främst för rabiesdiagnos genom molekylära tester. Denna gen används också för viral genotypning. Rabies kan diagnostiseras hos djur som använder någon del av den drabbade hjärnan; för att utesluta risken för rabies måste dock vävnad från minst två regioner i hjärnan testas2. Det finns flera diagnostiska metoder för rabiesdetektering hos djur. Det direkta immunofluorescenstestet förblir dockstandardreferenstekniken 3. Andra tester inkluderar biologiska tester som innehåller mus inympning, infektion i vävnadskultur och polymeraskedjereaktion (PCR)4. Alla dessa tekniker rekommenderas av Världshälsoorganisationen (WHO) och Världsorganisationen för djurhälsa (OIE) för diagnos av rabies hos människor respektivedjur, 5.

Nukleinsyra detektion och förstärkning tekniker har revolutionerat diagnos av rabies under de senasteåren 6 och dessa tekniker spelar en viktig roll i ante mortem diagnos av mänskliga rabies. Flera PCR-baserade tester har utvärderats för att komplettera konventionella tester för ante-mortem och post-mortem rabies diagnoser7,8,9,10. De flesta analyser riktar rabies viral nukleoprotein gen för förstärkning som är den mest bevarade regionen i det viralagenomet 1,11. Under de senaste 20 åren har olika molekylära analyser utvecklats för att diagnostisera RABV, och några av dessa analyser har använts för viruskarakterisering. De flesta försök har syftat till att upptäcka bevarade gener i virusgenomet, oftast genom att använda konventionella eller kvantitativa polymeraskedjereaktioner (qRT-PCR) i realtid12,13.

PCR är en mycket känslig diagnostisk teknik som kan upptäcka arvsmassan hos en given patogen i vävnader, även när dessa vävnader bryts ned. Med hjälp av PCR-baserade metoder kan minimala mängder av ett smittämne detekteras i ett kliniskt prov genom selektiv och repetitiv förstärkning av en DNA-nukleotidsekvens14. qRT-PCR som innehåller fluorescerande sonder (t.ex. TaqMan) eller DNA-bindningsfärger (t.ex. SYBR Green) har använts i försök för att diagnostisera RABV både ante- och post- mortem med hög känslighet; Ett sådant tillvägagångssätt kräver dock specialiserad utrustning. För att övervinna denna begränsning har omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP) föreslagits, baserat på dess låga kostnad, enkelhet och önskvärda egenskaper för detektion av RABV. Denna analys är särskilt viktig eftersom den kan användas i utvecklingsländerna15.

qRT-PCR baseras på detektion och kvantifiering av en molekyl, där fluorescerande signalökningar står i direkt proportion till mängden PCR-produkt i en enda reaktion. När antalet kopior av nukleinsyramålet ökar, ökar också fluorescensen. Icke-specifika intercalating färgämnen såsom SYBR Grön DNA-bindande färgämne eller sekvensspecifika oligonucleotide sonder som bär en fluoror och en quencher används ofta för att ge fluorescerande avläsning i qRT-PCR. Denna analys erbjuder fördelar jämfört med konventionell RT-PCR som inkluderar en kortare testtid (2-4 h), minskad risk för kontaminering på grund av det slutna rörsystemet (brist på post-PCR-manipulering av förstärkta produkter) och förmågan att upptäcka olika mål samtidigt16. qRT-PCR kan användas för att diagnostisera rabies ante-mortem från saliv och andra prover. Denna analys kan också användas som ett universellt realtidstest för påvisande av olika Lyssavirusarter eller härstamningar av RABV15. I denna kombination RT-PCR-metod används två reaktioner. Den första detekterar olika genetiska linages av RABV, och den andra upptäcker Lyssaviruset. Båda stegen involverar qRT-PCR-analyser, där den första använder hybridiseringssonder och den andra använder färgämnen15. På grund av det stora antalet tester som har visat framgångsrik molekylär detektion av RABV med denna teknik rekommenderar den nuvarande OIE Terrestrial Manual (2018) användningen av PCR för molekylär detektion av RABV17.

Mexiko är ett land med stor boskapspotential. De stater som har den högsta boskapsproduktionen innehåller både fuktiga tropiska regioner och torra regioner som är i riskzonen för rabiesutbrott på grund av närvaron av vampyrfladdermus desmodus rotundus, rabies huvudsändare. Därför är det viktigt att utveckla fler verktyg för förebyggande och kontroll av bovin paralytisk rabies (BPR) i México. Baserat på detta var syftet med denna studie att använda kvantitativ qRT-PCR för att bestämma antalet viruspartiklar i olika anatomiska strukturer hos nötkreaturshjärnor efter dödsfall på grund av rabiesinfektion.

Sex hjärnor som erhållits från RABV-positiva nötkreatur donerades av ett externt laboratorium för användning i utvecklingen av qRT-PCR protokoll beskrivs nedan. Proverna av nötkreaturs hjärnstruktur transporterades till INIFAP CENID-MA-laboratoriet BSL-2 och lagrades vid -80 °C fram till användning. Hjärnor erhölls från djur från delstaterna Campeche, Yucatán och Querétaro. Före mottagandet dissekerades olika strukturer från hjärnan. Dessa strukturer inkluderade Ammons horn, lillhjärna, cortex, medulla, pons och thalamus18,19. Genetiskt material extraherades enligt beskrivningen nedan. RABV diagnos bekräftades med hjälp av direkta fluorescerande antikroppar (DFA)20. Som en positiv kontroll användes mushjärnor som inokulerades med RABV21. Dessutom användes fyra RABV-negativa nötkreatur hjärnor (som fastställts av DFA) som negativa kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie godkändes av och genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna för användning av djur som tillhandahålls av Den institutionella kommittén för djurs vård och användning (IACUC) i Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Prover

  1. Använd olika delar av hjärnan dissekerade från 6 olika rabies-positiva nötkreatur hjärnor för RT-PCR analys.

2. Direkta fluorescerande antikroppar för att bekräfta rabies

OBS: DFA:s påvisande av rabiesantigenet är en kvalitativ metod för att bestämma förekomsten av rabieskärnaoproteinet med fluoresceinmärkta antikroppar. Testet utfördes med hjälp av protokollet från Dean et al. (1966)20, enligt beskrivningen nedan.

  1. Gör två intryck från varje vävnad dissekerad från olika hjärnstrukturer på en steril glidning med cirka 15 mm diameter. Använd en träapplikator för att smeta ut en cirka 3 mm3 del av vävnaden på den sterila diabilden. För att skapa smutsen, tryck försiktigt träapplikatorn mot bilden manuellt.
  2. Fixera provutstryksbilderna genom att dränka diabilderna i 100% aceton i 1 timme vid -20 °C. Torka rutschkanorna på en torr trasa vid 21 °C i 30 min efter inkubation.
  3. Tillsätt 50 μL av fluoresceinmärkt antinukleoproteinantikropp till varje hjärnutstryk vid en utspädning på 1:10 genom att dispensera genom en spruta.
  4. Inkubera diabilderna med konjugaten i en fuktig kammare vid 37 °C i 1 timme.
  5. Efter inkubation, tvätta diabilderna två gånger med vatten och med PBS för att eliminera överskott av konjugat. Låt rutschkanorna torka vid 21 °C. Torka försiktigt för att avlägsna överflödig vätska och sedan kort lufttorka före montering.
  6. Tillsätt en droppe av 50% fosfat glycerin för att täcka sektionens yta och täck sedan med ett täckglas. Observera sektionerna under ett epifluorescensmikroskop vid 40x förstoring.
    1. Bearbeta och observera de positiva och negativa kontrollerna (positiv kontroll: mushjärnor inokulerade med RABV; negativa kontroller: RABV-negativa nötkreaturshjärnor) på samma sätt som proverna.

3. Generera positiv kontroll för RT-PCR

  1. Få BHK-21 celler från bakterieplasmabanken. Använd celler fram till den70:e passagen för att replikera RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) med passage 2.
  2. Underhåll och föröka BHK-21 celler i flaskor som innehåller minsta essentiella medium (MEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS) vid 37 °C i närvaro av CO2 (5%) och under fuktiga förhållanden. Odla cellerna i 25 cm2 odlingskolvar tills de når 80% sammanflöde och sedan subkultur.
  3. Ta bort odlingsmediet från cellerna och tvätta flaskan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inokulera kulturen med 105 TCID/ml RABV stam ERA. Inkubera virusinokulatet i 2 timmar under konstant skakning vid 37 °C i närvaro av CO2 (5%) och under fuktiga förhållanden.
  4. Ta bort infektionsmediet och tillsätt MEM kompletterat med 5% (serum fetala nötkreatur) SFB. Inkubera i 72 timmar vid 37 °C i närvaro av CO2 (5%) under fuktiga förhållanden.
  5. Skörda RABV 3 dagar efter inokulering när cellerna uppvisar cytopatiska effekter. Frys de infekterade cellerna och tina dem sedan vid 4 °C för att lysa cellerna. Samla upp mediet från flaskan och placera sedan cellerna i ett centrifugeringsrör för centrifugering vid 1 050 x g i 10 minuter vid 4 °C.
  6. Förvara supernatanter från RABV vid -80 °C och förbered arbets alikvoter för förvaring vid -70 °C.
  7. Intracerebrally inokulera viruset som erhållits i föregående steg till 21 dagar gamla kvinnliga CD1 möss. Använd en 1 ml spruta för att inokulera 50 μL lösningar som innehåller 106 MICLD50 (musens infektiösa kultur dödlig dos 50%) doser till möss22.

4. RNA-extraktion

OBS: Totalt RNA extraherades direkt från nötkreatur hjärnor med hjälp av en organisk extraktionsmetod enligt följande protokoll.

  1. Använd 100 mg hjärnvävnad från varje anatomisk struktur för att extrahera totalt RNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt reagens som innehåller guanidium isothiocyanate.
  2. Homogenisera manuellt totalt 100 mg vävnad från varje struktur i 1 ml av guanidium isothiocyanate reagens genom att virvla med en Dounce homogenisator med en liten mortel inuti mikroröret i 15 s vid maximal hastighet.
  3. Inkubera proverna på is i 5 minuter och tillsätt sedan 200 μL kloroform. Blanda proverna kraftigt i 15 s, inkubera på is i 2 till 3 minuter och centrifugera sedan vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
  4. Överför vattenfasen till ett rent rör och tillsätt 500 μL isopropylalkohol. Inkubera proverna i 15 minuter vid 21 °C.
  5. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera den vattenhaltiga supernaten genom pipetting. Det isolerade RNA kommer att finnas som en pellet i röret.
  6. Tvätta sedan RNA-pelleten med 1 ml 75% etanol genom pipetting och centrifug vid 7500 x g i 5 min vid 4 °C.
  7. Dekanta supernatanten och lufttorka RNA-pelleten vid rumstemperatur (21 °C). Späd sedan ut pelleten i 50 μL nukleasfritt vatten.
  8. Bestäm RNA-koncentrationen och kvaliteten vid 260 nm med hjälp av en spektrofotometer. Förvara RNA vid -80 °C tills det används.
  9. Ta bort DNA från RNA-prover genom matsmältning med DNase I. Tillsätt 2 U DNase I per 1 μg RNA extraherat i föregående steg. Tillsätt sedan 5 μL 10x reaktionsbuffert och inkubera sedan vid 37 °C i 30 minuter. Inaktivera DNase I genom att tillsätta 1 μL EDTA till blandningen följt av inkubation i 10 minuter vid 65 °C.

5. cDNA syntes och PCR

  1. Syntetisera första-strand cDNA med oligo dT och omvänd transkriptas. För varje 1 μg RNA tillsätt 1 μL oligo DT (500 μg/ml), 1 μL 10 mM dNTP-blandning och nukleasfritt destillerat vatten till en slutlig volym på 12 μL. Inkubera blandningen vid 65 °C i 5 minuter.
  2. Kyl reaktionsblandningen till 4 °C. Centrifugera röret i 30 s vid 1 050 x goch tillsätt sedan 4 μL reaktionsbuffert, 2 μL 0,1 M DTT och 1 μL ribonukleashämmare (40 U/μL).
  3. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 2 min och tillsätt sedan 1 μL omvänd transkriptas (200 U). Inkubera sedan reaktionsblandningen i 50 min vid 37 °C och inaktivera sedan reaktionen vid 70 °C i 15 minuter.
  4. Förvara cDNA vid -20 °C före användning.
    OBS: För att verifiera kvaliteten på den syntetiserade cDNA, utför förstärkningen av ett 761 bp fragment av RABV N genen innan syntesen in vitro. Använd protokollet som beskrivs av Loza-Rubio et al.11 enligt beskrivningen i steg 5.5 nedan.
  5. Utför PCR med Taq DNA-polymeras under följande förhållanden. Utför reaktionsuppsättningen enligt följande: 10x Taq-buffert som innehåller 20 mM MgCl2,0,2 mM dNTPs, 1 U Taq-polymeras, 10 μM av varje primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatgagtaca 3′ och SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL cDNA och ultrapurvatten till en slutlig volym på 50 μL.
  6. Utför förstärkningen i en termocyklist med följande cykelförhållanden: 95 ° C i 3 min; 35 cykler på 95 ° C för 30 s, 60 °C för 30 s och 72 °C i 1 min, en cykel på 72 °C i 7 min.
  7. Utvärdera förekomsten av 761 bp PCR-produkter med en 1% agarosgel.

6. Transkription in vitro

OBS: In vitro-transkription genererar mRNA av en målgen. Använd ett primerpar som förstärker hela RABV N-genen och en som används som en positiv kontroll för qRT-PCR-analysen. Dessa primers är utformade för att förstärka den kompletta RABV N-genen och för att lägga till en promotor som känner igen T7-polymerasen (TAATACGACTCACTATAG).

  1. För att förstärka hela N-genen RABV, använd primers Trans-Nrab framåt (5ʹ gatgagtcactcgaatgtctt 3ʹ) och omvänd (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) och en PCR-sats med hög återgivning.
    1. För varje reaktion, förbered en PCR master mix genom att lägga till en ren PCR-rörreaktionsbuffert 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTPs, 10 μM av varje primer, 0,5 U hög återgivningspolymeras, 1,5 μL cDNA (beredd i steg 5) och ultrapurvatten till en slutlig volym på 50 μL.
    2. Använd en termocyklist inställd på följande villkor för förstärkning: 94 °C i 1 min; 4 cykler på 94 °C i 1 min, 40 °C i 1 min och 72 °C i 2 min, 35 cykler på 94 °C i 1 min, 60 °C i 1 min och 72 °C i 2 min, slutlig förlängning på 72 °C i 2 minuter.
  2. För att använda PCR-produkten som mall för in vitro-syntesen och för att ta bort komponenter i den enzymatiska reaktionen från steg 6.1.2, rena PCR-produkten med hjälp av ett kolumnbaserat koncentratorkit enligt tillverkarens instruktioner och kvantifiera sedan med en spektrofotometer.
  3. För RNA-syntes, använd ett in vitro-transkriptionskit med följande reaktionsblandning: 5 μL T7 Transkription 5x buffert, 1,9 μL av varje tripfosfatnukleotid, 10 μg renat RABV N DNA VP2 DNA och 2, 5 μL enzymblandningen. Inkubera sedan blandningen vid 37 °C i 4 timmar. Tillsätt sedan 1 μL 1 U/μg RNase-Free DNase till reaktionsblandningen och inkubera i 15 min vid 37 °C för att eliminera DNA-kontaminering.
  4. Rena in vitro transkriberat RNA och koncentrera det sedan med fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1).
  5. Återanvänd den renade RNA-pelleten i 70 μL TE-buffert och förvara sedan vid -80 °C tills den används.
  6. Upprepa PCR-protokollet från steg 6.1 tills ca 5 μg PCR-produkt erhålls. Efter rening och koncentration kommer in vitro transkriberad N gen mRNA att finnas i en koncentration av 4.711 μg/μL.
  7. Bekräfta att in vitro transkriberade mRNA motsvarar N genen efter steg 5 i detta protokoll och använd detta som en positiv kontroll för realtid omvänd transkription polymeras kedjereaktion (qRT-PCR).

7. Omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR)

  1. För qRT-PCR, använd en in vitro mRNA-transkription som kodar för den kompletta N-genen som en positiv kontroll tillsammans med ett kommersiellt qRT-PCR-kit i ett steg med hybridiseringssonder enligt tillverkarens instruktioner. Använd sonden och primers som beskrivs av Carneiro et al. (2010)23 för att upptäcka en bevarad region av RABV-genen N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, och BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Använd följande termiska cykelförhållanden: 1 cykel på 50 °C i 10 min och 95 °C i 2 minuter; 40 cykler på 95 °C för 15 s och 50 °C för 30 s.

8. Kalibreringskurva eller standardkurva

  1. Utför seriella utspädningar av in vitro transkriberat mRNA genom att seriellt pipetting 1 μg/μL mRNA i rör tills sex decuple utspädningar erhålls. Förbered rör med en volym på 100 μL i tre exemplar för användning för att skapa standardkurvan. Utför qRT-PCR enligt beskrivningen i steg 7.
  2. Utför qRT-PCR i en termocyklist med en rotor genom att bearbeta de olika hjärnproverna samtidigt med de löpande reaktionerna för att skapa standardkurvan och använda positiva kontroller, negativa kontroller och supernatanter isolerade från cellkulturen.
  3. För att utvärdera testets detektionsgräns, testeffekt och känslighet, använd en standardkurva i tre exemplar under samma förhållanden.

9. qRT-PCR för biologiska prover

  1. För påvisande av RABV gen N, använd RNA från fältprover, positiva kontroller, negativa kontroller och cellkultur supernatants för att utföra qRT-PCR med hjälp av PCR kit beskrivs i steg 7.
  2. För att fastställa antalet kopior av RABV-genomet som finns i embryona från nötkreatur, erhåll ct-data från standardkurvan och biologiska prover och från de som interpoleras från ekvationen kalibreringskurva.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DFA-resultaten visade 100%, 100%, 83,3%, 66% och 50% positivitet för RABV i cortex, thalamus, medulla, pons och horn, respektive. Dessa resultat bekräftade de tidigare resultaten, och minst tre av strukturerna dissekerade från varje hjärna var positiva för RABV. En representativ positiv DAF-färgning visas i figur 1.

Figur 2 visar förstärkningen av ett fragment av RABV N-genen (steg 5.5) med de primers första som rapporterats av Loza-Rubio et al.11. Detta visade att det material som erhölls för att användas vid förstärkning var av god kvalitet.

Storleken på det PCR-förstärkta fragmentet visas i figur 3. Ekvationen av standardkurvan visar förhållandet mellan mängden rabv-genetiskt innehåll i ett prov och storleken på det PCR-förstärkta fragmentet. Mängden rabv-genetiskt innehåll (i ng) härleddes genom interpolation av Ct-värdena i kalibreringskurvan med hjälp av ekvationen som presenteras i figur 4. Med hjälp av denna ekvation konstaterades det att detektionsgränsen på 1 x10 5 μg/μL virus-RNA motsvarade 36 kopior av RABV-genomet. Dessa resultat visar att analysen är känslig och kan användas för att upptäcka viruset i prover som innehåller ett lågt antal kopior RABV N gen. Analysens effektivitet beräknades med hjälp av lutningen på standardkurvan, som var -3,28. De prover som används för qRT-PCR visade förstärkning av RABV N genen.

För att fastställa antalet virala kopior interpolerades Ct-värdena för varje prov med hjälp av kalibreringskurvans ekvation. Det erhållna resultatet (i nanogram) ersattes med den formel som beskrivs nedan från följande ref.24:

Antal kopior RABV N gen = (ng prov * 6.022 x 1023) / (104 bp (längd pcr produkt) * 1 x 109 * 650).

Jämförelsevis var resultaten av qRT-PCR-analyser förenliga med dem som erhållits med DFA. Enligt resultaten från qRT-PCR-testet i fallen C och D (tabell 1) är thalamus den struktur som har det högsta antalet kopior av RABV N-genen. Detta tyder på att tidig infektion av hypotalamus och thalamic nervceller är viktigt i utvecklingen av sjukdomen, med tanke på att dessa nervceller kontrollerar vegetativa funktioner hos ett djur. Kopieringsnumren för rabv N-genen som upptäcktes i varje struktur i varje prov visas i tabell 1. Känsligheten och specificiteten för qRT-PCR-testet var båda 100%, eftersom alla prover var positiva. Detta resultat överensstämmer med de första diagnoserna av proverna.

Figure 1
Figur 1: Nötkreatursvävnader som visar positiv färgning enligt det direkta immunofluorescenstestet som detekterar rabiesvirusprotein N i infekterade vävnader. En äppelgrön färgning observeras vid färgning, där antikroppen binder till rabiesantigenet. Skalbar: 50 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: 1,5 % agarosgel som visar förstärkningsprodukterna. Förstärkning av ett 761 bp fragment av RABV N genen för att visa förekomsten och kvaliteten på cDNA som ska användas i in vitro transkription. Körfält 1 innehåller en molekylviktsmarkör, linje 2: förstärkning av positiv kontroll; Körfält 3: negativ kontroll (icke-infekterat prov). Rad 4: förstärkning av cDNA som används för in vitro-transkription. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: 1,5 % agarosgel som visar förstärkningsprodukterna. Förstärkning av den kompletta N-genen visas i körfält 2. Körfält 1 innehåller en molekylviktsmarkör, och bana 3 innehåller den negativa förstärkningskontrollen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Standardkurvan för qRT-PCR med hjälp av in vitro transkriberat N gen mRNA för att kvantifiera antalet kopior av RABV N-genen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

ID-hjärna struktur DAF (på alla) Antal kopior (x109)
A. Ammons horn + 0.261
cerebellum + 0.0663
Cortex + 0.02
Medulla + 0.146
pons + 30.7
Thalamus + 108
B Ammons horn - 0.0251
cerebellum + 4.64
Cortex + 12.4
Medulla + 0.175
pons \u2012 0.0721
Thalamus + 121
C. Ammons horn \u2012 0.168
cerebellum + 0.0239
Cortex + 21.5
Medulla + 17.2
pons + 1.32
Thalamus + 102
D. Ammons horn + 11.8
cerebellum + 0.0239
Cortex + 8.72
Medulla + 1.25
pons \u2012 0.0165
Thalamus + 33.4
E. Ammons horn + 4.15
cerebellum + 6.78
Cortex + 1.53
Medulla + 1.41
pons + 0.025
Thalamus + 95
F. Ammons horn + 0.0221
cerebellum \u2012 0.00023
Cortex + 4.95
Medulla \u2012 0.000556
pons + 1.02
Thalamus + 89

Tabell 1: Bestämning av antalet kopior av rabv N-genen i varje hjärnstruktur. Resultaten erhölls från sex anatomiska strukturer av RABV-positiva nötkreatur hjärnor diagnostiseras med DFA. De ord som markeras i fetstil anger de strukturer som har flest kopior. Resultaten uttrycktes som antal kopior av N genen per milligram vävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidigare studier har visat att DFA endast kan upptäcka RABV inom sju dagar efter att provet förvarats i rumstemperatur (21 °C)14. Däremot visade detta arbete att känsligheten hos RT-PCR börjar minska efter att proverna har utsatts för rumstemperatur i 12 dagar. Därför kan RABV-genomet detekteras av qRT-PCR i prover som utsätts för rumstemperatur i upp till 23 dagar. Detta visar att känsligheten hos qRT-PCR är relativt högre för mer sönderdelade prover. Det är dock fortfarande nödvändigt att utveckla enklare metoder som inte äventyrar specificiteten25. Den nuvarande forskningen visade en molekylär analys som har högre känslighet än DFA, baserat på observationen att den kunde upptäcka det virala genomet oavsett den specifika hjärnstrukturen.

Fördelarna med RT-PCR-tekniken för användning vid detektering av smittämnen har lyfts fram i flera vetenskapliga studier. Denna teknik kan dock uppvisa vissa nackdelar, till exempel kostnad för utförande, eftersom det kräver specialiserad utrustning. Utbildad personal krävs för att hantera molekylärbiologiska analyser. Dessutom bör det nämnas att som en mycket känslig teknik är några av stegen avgörande för att uppnå bästa resultat. En av dessa är korrekt hantering av prover för RNA-extraktion. Detta steg är avgörande, eftersom RNA lätt försämras, och resultaten kan därför påverkas. Överväg att behålla provet under kalla förhållanden (ca 4 °C) under processen. Dessutom, tänk på att flera omgångar PCR-applikation utförs som nämnts i steg 6.1 för att generera transkriptionen in vitro. Detta beror på att en stor mängd genetiskt material är nödvändigt för att reaktionen ska ge betydande (mer än milligram) mängder DNA. En annan viktig aspekt av denna analys är kravet på rening av det genetiska materialet i kolumnerna, eftersom DNA också kan gå förlorat under detta steg.

qRT-PCR är känt för att vara lika specifikt som DFA-testet, vilket är standardtestet som godkänts av WHO och OIE. Molekylära analyser med RT-qPCR har dock visat sig ha en högre känslighet och därmed möjliggöra analys av prover med en högre grad av nedbrytning för att underlätta upptäckten av ett relativt litet antal kopior av virusgenomet. Det är också mycket snabbare, minskar risken för förorening och kan användas ante-mortem26,27.

Bingham och van Der Merwe (2002)28 genomförde en studie med DFA för att avgöra vilka hjärnstrukturer som hade högre koncentrationer av RABV N-genen. Totalt 252 hjärnstrukturer från flera arter utvärderades. Thalamus, pons och medulla var de mest relevanta hjärnstrukturerna, eftersom de var positiva i alla utvärderade hjärnprover. Dessa resultat överensstämmer med de resultat som presenteras här, som överensstämde med DFA-resultaten i följande strukturer: cortex och thalamus, 100%; medulla, 83,3%; ponnyer, 66%; och horn, 50%. Däremot rapporterade tidigare studier inga falska negativ. I detta arbete upptäcktes vissa negativa resultat i kompletta hjärnstrukturer som tidigare hade diagnostiserats som positiva. Detta kan bero på att den del av provet som användes för testet inte innehöll viruspartiklar som identifierats av antikroppen eller den känsligare molekylära analysen. En annan möjlig förklaring är att proverna inte transporterades eller lagrades ordentligt före mottagningen på laboratoriet.

QRT-PCR-analysen som utförs i denna studie kunde upptäcka så få som 36,3 kopior av RABV N genen per milligram vävnad. De mest lämpliga hjärnstrukturerna för qRT-PCR inkluderade cortex och thalamus. Detta baseras på observationerna att högre koncentrationer av RABV N-genen upptäcktes i dessa strukturer och att de också befanns vara positiva med hjälp av RABV-referenstestet. Testet kunde upptäcka mycket låga koncentrationer (0,00023 x 109 kopior) av viruset i olika prover. Förutom att kvantifiera viruspartiklarna i provet verkar testet ge ett bra alternativt diagnostiskt och forskningsverktyg för detektion av RABV.

Med de resultat som erhållits med hjälp av rabiesviruset viral genomdetekteringsprotokoll som presenteras här, förväntas denna teknik kunna tillämpas för molekylär diagnos av viruset i olika typer av prover, eftersom det kan upptäcka minimala mängder av det virala genomet. Dess största fördel jämfört med andra metoder som DFA är att det är känsligareoch kan användas före döden , som har föreslagits av andra författare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP). Vi tackar Jerzayn Fraustro Esquivel för hans samarbete i utvecklingen av videon i samband med detta dokument.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 171 virus bovin paralytisk rabies qRT-PCR diagnos zoonos hjärna
Kvantifiering av rabiesvirus i olika nötkreaturs hjärnstrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter