Summary
Il protocollo descrive metodi sperimentali per ottenere sostituzioni stabili del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) classe Iattraversopotenziali sostituzioni di β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie. Sono stati studiati il confronto strutturale dell'MHC I stabilizzato da β omologo edeterologodi 2 m.
Abstract
Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) svolge un ruolo fondamentale nella presentazione del peptide antigene e nelle risposte immunitarie delle cellule T contro le malattie infettive e lo sviluppo tumorale. L'MHC I ibrido complesso con sostituzione eterologo β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie può essere stabilizzato in vitro. Questo è un mezzo fattibile per studiare l'MHC I dei mammiferi, quando l'β2m non è disponibile. Nel frattempo, è indicato che il βsostituzione di 2m non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Tuttavia, c'è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia per l'MHC ibrido I complessa con β eterologo2-microglobulina (β2m). Nel presente documento vengono presentati metodi per valutare la fattibilità βsostituzione eterologodi 2 m nello studio MHC I. Questi metodi includono la preparazione di costrutti di espressione; purificazione dei corpi di inclusione e ripiezione del complesso MHC; determinazione della termostabilità proteica; screening cristallino e determinazione della struttura. Questo studio fornisce una raccomandazione per la comprensione della funzione e della struttura dell'MHC I ed è anche significativo per la valutazione della risposta delle cellule T durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale.
Introduction
Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) esiste in tutti i vertebrati ed è un insieme di geni che determina l'immunità mediata dalle cellule agli agenti patogeni infettivi. La classe MHC I presenta peptidi endogeni, come componenti virali prodotti dopo l'infezione da virus, ai recettori delle cellule T (TCR) sulla superficie delle cellule CD8+ T per mediare l'immunità cellulare e partecipare alla regolazione immunitaria1. Uno studio strutturale dell'MHC I che si lega ai peptidi fornisce informazioni sui motivi di legame peptidico e sulle caratteristiche di presentazione da parte delle molecole MHC I, che svolge un ruolo vitale nella valutazione delle risposteimmunitarie delle cellule CD8 + T e nello sviluppo del vaccino.
Sin dalla prima cristallizzazione e determinazione strutturale dell'MHC I molecolare di Bjorkman etal. Una serie di studi di follow-up ha indicato che sebbene i geni che codificano la catena luminosa non siano associati all'MHC, la catena luminosa è una proteina chiave per l'assemblaggio delle molecole di MHC I3,4. Interagisce con i tre domini delle molecole di classe I dell'MHC su più superfici. Quando la catena luminosa è assente, le molecole di classe I dell'MHC non possono essere espresse correttamente sulla superficie delle cellule che presentano antigeni e non possono interagire con il TCR per esercitare le loro funzioni immunologiche.
MHC I è composto da una catena pesante (catena H) e catena leggera (cioè β2-microglobulina (β 2 m)), ed èassemblato attraversoil legame con un peptideadatto 5. Il segmento extracellulare della catena H è costituito da α1, α2 e α3 domini6. I domini α1 e α2 formano il solco di legame peptidico (PBG). La catena β2m agisce come una subunità strutturale del complesso di assemblaggio in MHC I, stabilizzando la conformazione del complesso, ed è un chaperone molecolare per la piegatura della catena MHC I H7,8,9. Una serie di studi hanno dimostrato che mhc I H catene da vari mammiferi come pipistrello (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primati) (Mamu -B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, topo (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cane (Carnivora) (DLA-88*50801)16,bovini (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ed equini (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 ed Eqca-N*00601)18 possono combinarsi con β eterologadi 2m(tabella 1). Queste molecole ibride sono spesso utilizzate in studi strutturali e funzionali. Tuttavia, la metodologia per lo studio funzionale e strutturale dell'MHC I ibrido con β2m non è ancora riassunta. Nel frattempo, la base strutturale per l'β2milioni tra diversi taxa rimane poco chiara.
Nel presente documento vengono riassunte la procedura per l'espressione MHC I, il ripieliatura, la cristallizzazione, la raccolta dei dati cristallini e la determinazione della struttura. Inoltre, le potenziali sostituzioni di β 2 m da diverse specievengonoanalizzate confrontando la conformazione strutturale dell'MHC I stabilizzata da β2m omologi ed eterologi. Questi metodi saranno utili per ulteriori studi strutturali MHC I e valutazione della rispostaimmunitaria delle cellule CD8 + T nel cancro e nelle malattie infettive.
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Protocol
1. Preparazione dei costrutti di espressione
- Recupera le sequenze dei geni di classe I dell'MHC (inclusi i geni previsti) dai pipistrelli dal database NCBI.
- Recuperare sequenze di catene pesanti MHC I di mammiferi superiori dal database ipd (Immuno Polymorphism Database) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e dal database UniProt (www.uniprot.org).
- Per ottenere complessi MHC solubili, mutagenizzare le sequenze per rimuovere le regioni citosoliche e transmembrane.
- Clonare i geni che codificano gli ectodomini del pipistrello Ptal-N*01:01 (GenBank n. KT98792919) (residui 1–277) e pipistrello β2m (GenBank n. XP_006920478.1) (residui 1-98) rispettivamente nei vettori pET-28a (Novagen, Pechino, Cina).
- Inserire le sequenze ottimizzate (per Escherichia coli) tra i siti NcoI ed EcoR1 di un vettore pET-28a modificato.
- Costruire plasmidi β di espressione di2m come descritto in precedenza20.
2. Sintesi peptidica
- Previsione dei peptidi
- Come descritto inprecedenza 10, per la ricerca di peptidi che possono legarsi a Ptal-N*01:01, prevedere i peptidi candidati utilizzando i corpi proteici dei virus hendra virus correlati ai pipistrelli (HeV). Per ottenere peptidi ad alta affinità basati sul modello strutturale dal server online, NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 e Rosetta FlexPepDock22 hanno previsto un potenziale binding nella frazione peptidica selezionata. Inoltre, possono essere utilizzati anche altri software e database tra cui BIMAS, Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 e SYFPEITHI, tutti integrando la previsione dell'affinità di legame peptide-MHC di classe I, il trasportatore associato all'efficienza di trasporto dell'elaborazione dell'antigene (TAP), la scissione proteasomica C-terminale e l'half-time di dissociazione delle molecole di classe I peptidico-HLA nelle loro letture.
- Per prevedere peptidi ad alta associazione, utilizzare sia il server NetMHCpan che Rosetta FlexPepDock.
NOTA: Sfortunatamente, nessuna delle previsioni prodotte corrispondeva ai dati sperimentali. Ciò può indicare che le attuali previsioni peptidiche vincolanti dell'MHC non erano adatte a mammiferi non umani e non topi come i pipistrelli, che potrebbero avere un diverso modo di legare il peptide. Pertanto, dobbiamo combinare vari software di previsione e risultati sperimentali per un'analisi completa per ottenere peptidi ad alta affinità.
- Preparazione e conservazione dei peptidi
- Piuttosto che generare peptidi personalizzati, utilizzare fornitori di servizi specializzati. Acquista tutti i peptidi commercialmente seguendo gli strumenti di previsione peptidica, che hanno un punteggio di legame più elevato. La purezza peptidica è stata determinata per essere >95% da HPLC e spettrometria di massa.
- Conservare tutti i peptidi acquistati come polvere liofilizzata a −80 °C e sciogliere in solfossido di dimetile (DMSO) prima dell'uso.
3. Purificazione dei corpi di inclusione
- Trasformazione di E. coli
- Trasformare 10 ng di plasmide contenente pipistrello MHC I Ptal-N*01:01 H catena, o umano β2m o pipistrello β2m in 100 μL di BL21(DE3) E. coli. Fare il bagno nel ghiaccio per 30 minuti.
- Scossa di calore a 42 °C per 90 s, seguita dalla balneazione nel ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere 800 μL di brodo di lisogenia (LB: estratto di lievito, triptone e NaCl; vedi tabella dei materiali)per il passo 3.1.2 e agitare a 200 rotazioni al minuto (rpm) su una piattaforma a dondolo a 37 °C per 20 minuti.
- Applicare 100 μL di sospensione batterica sulla piastra contenente la corrispondente resistenza agli antibiotici (ampicillina: 100 ng/mL), che sono gli stessi dei costrutti precedenti.
- Inoculare le culture
- Scegli un singolo clone batterico recentemente trasformato in 3 mL di LB con mezzo antibiotico (ampicillina: 100 ng / mL) e coltura a 37 ° C, mentre scuoti a 200 giri /min su una piattaforma a dondolo per attivare i batteri. Le culture possono essere inoculate a tarda notte, per essere pronte per l'induzione la mattina successiva.
- Con una notte di anticipo, trasferire 500 μL dello stock batterico attivato in 50 mL di LB con mezzo antibiotico (ampicillina: 100 ng/mL) e incubare durante la notte a 37 °C, tremando a 200 giri/min. Per comodità durante la preparazione del successivo inoculato, congelare il restante stock batterico attivato in 1 mL aliquote (500 μL di coltura con 500 μL di 40% di glicerolo) a -80 °C fino a quando non è necessaria la preparazione successiva.
- Per generare grandi quantità di proteine ricombinanti, trasferire la preparazione batterica in 2 L di LB con mezzo antibiotico (ampicillina: 100 ng/mL) ad un rapporto di 1:100, incubare a 37 °C mentre si trema a 200 giri/min. Cultura fino a raggiungere un'assorbanza di 0,6 a 600 nm. Aggiungere 1 mM di isopropil-1-tio-β-D-galactopiranoside (IPTG) (variare la concentrazione di IPTG per diversi MHC, per lo più tra 0,1 mM-1 mM) al pallone per l'induzione dell'espressione proteica.
- Batteri del raccolto
- Trasferire i batteri in bottiglie di centrifuga e centrifuga a 5000 x g per 20 min a 4 °C. Tutti i passaggi d'ora in ora in su dovrebbero essere eseguiti a 4 °C.
- Resuspend i batteri in 60 mL di tampone fosfato salina (PBS) e liberare la proteina ricombinante espressa dal disgregatore cellulare ad ultrasuoni.
NOTA: In generale, il programma che abbiamo impostato su questa macchina è ultrasonico 6S, intervallo 12S, 300 W, 99 volte).
- Purificazione dei corpi di inclusione
- Centrifugare la sospensione batterica sonicata a 12.000 x g per 30 min. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un volume appropriato di tampone di lavaggio (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Ripetere ancora una volta questo processo.
- Centrifuga a 12.000 x g per 10-20 min. Scartare il supernatante e rimescolare i corpi di inclusione nel tampone di resuspensione (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Rimuovere un campione di 20 μL (corpi di inclusione nel buffer di resuspensione) per SDS-PAGE per testare la purezza dei corpi di inclusione.
- Centrifugare la preparazione rimanente a 12.000 x g per 10-20 min. Scartare il supernatante. Pesare il pellet contenente i corpi di inclusione e aggiungere tampone di dissoluzione (6 M Gua-HCl, 10% glicerina, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) ad una concentrazione finale di 30 mg/mL. Mescolare lentamente utilizzando un agitatore magnetico a 4 °C fino a quando i corpi di inclusione non vengono sciolti nel tampone di dissoluzione.
- Centrifuga 12.000 x g per 10-20 min. Conservare i corpi di inclusione a −20 °C o −80 °C.
NOTA: Prima di procedere con la purificazione dei corpi di inclusione, confermare che l'induzione e l'espressione della proteina ricombinante hanno avuto successo. Eseguire campioni da ogni coltura (prelevati prima e dopo l'induzione IPTG) su un gel proteico; 15% SDS-PAGE (gomma concentrata SDS-PAGE: H2O, 30% acrilammide, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; Gel di separazione SDS-PAGE: H2O, 30% acrilammide, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; vedere la tabella dei materiali ) per la β2m, 10% SDS-PAGE per la catena H.
4. Ripiezione del complesso MHC
NOTA: L'efficienza dei corpi di inclusione riformuplicati influenzerà la resa delle proteine ottenute. Il folding compete con la polimerizzazione, quindi è generalmente accettato che il ripiegamento a basse concentrazioni proteiche sia il metodo di maggior successo. In questo documento, la concentrazione dei corpi di inclusione è di 30 mg/mL.
- Preparare il buffer di ripiezione.
- Variare la composizione del tampone di ripiezione a seconda della proteina. Ad esempio, il pH, la forza ionica, le condizioni redox e la presenza di ligandi influenzeranno i risultati di ripiezione. Il più comune è usare tamponi a base di Tris o HEPES a un pH neutro con la concentrazione di NaCl di 50-500 mM, ma questo dipende anche dalla proteina bersaglio. Di seguito è riportata la formula del buffer di ripiezione utilizzata in questo articolo.
- Preparare il tampone pieghevole con 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-2Na.
- Raffreddare il tampone a 4 °C in un pallone da 250-300 mL, quindi aggiungere 5 mM di glutatione ridotto (GSH) e glutatione ossidato da 0,5 mM (GSSG). Mescolare lentamente usando un agitatore magnetico a 4 °C per altri 10-20 minuti prima di aggiungere i corpi di inclusione e i peptidi.
- Iniezione e diluizione della catena MHC H e β2m
NOTA: La temperatura alla quale viene eseguito il ripiertimento può variare, anche se generalmente, al fine di ridurre al minimo l'aggregazione, 4 °C è la migliore. Usiamo la diluizione per riformlicare le proteine.- Utilizzando un ago da una siringa da 1 ml, iniettare 1 ml di corpi di inclusione hβ2m o bβ2m di corpi di inclusione in due tamponi di ripiezione (1 litro ciascuno), rispettivamente. Iniettare vicino alla barra di agitazione vigorosamente rotante per ottenere una diluizione rapida ed efficiente. β2m si riformi relativamente facilmente e rimane stabile anche in assenza della catena H.
- Dopo che β2m sono stati sciolti in soluzione di ripiezione, sciogliere i peptidi (5 mg/mL) in DMSO e iniettare rapidamente 200 μL nella soluzione di ripiezione. Mescolare lentamente per 10-20 minuti prima di aggiungere la catena H.
- Iniettare la catena H con la stessa procedura sopra descritta per β2m. La catena H è molto instabile; pertanto, l'ordine di iniezione è abbastanza importante. Iniettare 3 mL di corpi di inclusione della catena H in due diversi tamponi di ripiezione (1 litro ciascuno) rispettivamente con hβ2m o bβ2m. L'iniezione consecutiva di piccole aliquote invece della singola applicazione dell'intera quantità di proteine aumenta la resa dell'MHC riformuplicato. Lasciare procedere il ripielicamento a 4 °C per 8-10 ore.
- Concentrazione di proteine riformuplicate
- Utilizzare l'ultrafiltrazione in una camera pressurizzata con membrana MMCO da 10 kDa per la concentrazione delle proteine ripiezionanti. Questo metodo è conveniente e può essere combinato con lo scambio di buffer. Aggiungere il tampone di scambio (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) alla camera e concentrarsi su un volume finale di 30-50 mL.
- Trasferire la soluzione di ripielicamento in un tubo di centrifuga, ruotare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i precipitati.
- Trasferire con cura il supernatante e concentrarsi ulteriormente ad un volume finale di ~1 mL.
- Centrifuga a 12.000 xg per 10-20 min. Trasferire il supernatante in un tubo sterile e purificare le proteine utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni 10/300 GL.
- Raccogliere i campioni al picco e analizzarli utilizzando SDS-PAGE (15% gel di poliacrilammide).
- Raccogliere il picco complesso MHC e concentrarsi ad una concentrazione finale di 15 mg/mL.
- Diluire il complesso a 7,5 mg/mL e 15 mg/mL per la cristallizzazione.
5. Cristallizzazione, raccolta ed elaborazione dei dati
- Eseguire la cristallizzazione di MHC e peptide complessi utilizzando la tecnica di diffusione del vapore a goccia seduta.
- Scherma i complessi peptidici Ptal-N*01:01/con kit di cristallo commerciali (ad esempio, kit Crystal Screen I/II, kit Index Screen, kit PEGIon I/II e kit PEGRx).
- Sigillare la soluzione risultante ed equilibrare a 100 μL di soluzione di serbatoio a 4 o 18 °C.
- Osserva la crescita del cristallo nella cultura per 3 giorni, 1 settimana, 2 settimane, 1 mese, 3 mesi e 6 mesi. Utilizzare un microscopio per vedere se ogni goccia nella piastra di cristallo ha cristalli.
NOTA: I cristalli di Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) sono stati osservati in 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) e 25% (w/v) glicole polietilene 3.350 ad una concentrazione di 7,5 mg/mL. Cristalli di Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) sono stati osservati in 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polietilene glicole 3.350 ad una concentrazione di 7,5 mg/mL. - Per la protezione criogenica, trasferire i cristalli in una soluzione di stoccaggio contenente il 20% di glicerolo e quindi raffreddarsi rapidamente in un flusso di azoto gassoso da 100 K.
- Raccogli i dati di diffrazione dei raggi X dalla linea di fascio BL19U dell'impianto di radiazione di sincrotrone di Shanghai (Shanghai, Cina).
6. Determinazione e analisi della struttura
- Con dati strutturali ad alta risoluzione, elaborare e scalare la forza della raccolta utilizzando il programma Denzo e il pacchetto software HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
- Dopo aver scelto un modello iniziale migliore nella Protein Data Bank (PDB), determinare le strutture utilizzando la sostituzione molecolare con il programma Phaser MR in CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Il modello utilizzato era le coordinate della struttura con il codice 5F1I della Protein Data Bank (PDB).
- Utilizzate il raffinato modello a raggi X per la raffinatezza iniziale del giunto. Usa Phenix perfeziona da solo e le modalità di giunto solo per i raggi X e la raffinazione congiunta di neutroni e raggi X, rispettivamente.
- Dopo ogni ciclo di affinamento, controllare manualmente il modello rispetto a Fo − Fc e 2Fo − Fc mappe di densità nucleare positiva in Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Ciò facilita il corretto posizionamento delle acque e di alcuni atomi D. Tutte le figure delle strutture sono state create da PyMOL (http://www.pymol.org/).
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Representative Results
Lavori precedenti riportavano che il peptide HeV1 (DFANTFLP) derivato da HeV era presentato da Ptal-N*01:0110,19. Nel presente documento è stata valutata la capacità di legame di questo peptide a Ptal-N*01:01 con pipistrello omologo β2m (bβ2m) e β umanoeterologo 2m (hβ2m) (Figura 1C,1D). Sono stati formati cristalli con risoluzione più elevata, rispettivamente (Figura 1E,1F). Un cristallo è formato dal complesso Ptal-N*01:01/HeV1, che si è formato attraverso la rinaturazione con bβ2m, e la risoluzione è 2,31 Å. Un cristallo è formato dal complesso Ptal-N*01:01/HeV1, che si è formato attraverso la rinaturazione con hβ2m, e la risoluzione è 1,6 Å. Il complesso Ptal-N*01:01/HeV1 è stato formato con successoattraversola rinaturazione sia con bβ 2 m che con hβ2m(Figura 1C,1D). In questo contesto, abbiamo dimostrato che il complesso Ptal-N*01:01/HeV1 non si è formato senza la presenza di β2m(Figura 1A)e dell'H-2Kd che si piegano correttamente attraverso l'hβ2m (Figura 1B).
Le strutture di Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m e Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m sono state quindi analizzate. Nella struttura Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, residui R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 di bβ 2 m legati ai residui della catena Hattraversoil fondo del PBG e residui Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 legati al dominio α3 della catena H. Simile al complesso Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, nella struttura Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, residui conservati H31, D53, W60, Y63 di hβ2m che corrispondono a bβ2m, sono stati a contatto con il fondo del PBG e hanno conservato residui Q8, Y10, R12, N24 che corrispondono a bβ2m legati al dominio α3(figura 2A,2B).
Nelle strutture complessive Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m e Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, la deviazione media radice-media-quadrato (RMSD) dei residui 1-184 delle catene H (formando la α1α2 PBG) era di 0,248 sotto tutta lasovrapposizione di atomi C α (Figura 3A). Questa constatazione indicava che non c'era differenza tra questi due complessi. Sono state quindi confrontate le conformazioni dei peptidi simili nei complessi con βdi 2m. La struttura dell'allineamento peptidico ha mostrato che le conformazioni dei peptidi HeV1 in questi due complessi erano abbastanza simili (Figura 3B). Inoltre, le strutture di gp33 (KAVYNFATM) presentate da H-2Db e complesse con topo β2m (mβ2m) o hβ2m sono state allineate. L'RMSD del PBG α1α2 di H-2Db era 0,283 e anche le conformazioni complessive dei peptidi in queste due strutture erano simili(Figura 3C,3D). Questi dati indicano che la sostituzione di β2m tra bβ2m e hβ2m e mβ2m e hβ2m non influisce sulle conformazioni dei peptidi presentati.
L'allineamento delle sequenze ha mostrato che gli amminoacidi β2m provenienti da specie diverse sono altamente conservati(figura 4). Dall'analisi dei β2m provenienti da specie diverse è emerso che la maggior parte degli amminoacidi di β2m che formavano i legami idrogeno con la catena H dell'MHC I sono stati conservati(figura 4, tabella 2). Nel frattempo, i diversi residui erano anche amminoacidi con proprietà chimiche simili nei mammiferi. Tuttavia, i residui chiave coinvolti nel legame di β2m alla catena H dell'MHC I hanno mostrato polimorfismi nei polli, nei pesci e neglianfibi (figura 4).
Tabella 1: I vari mammiferi si combinano con β2m. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Interazioni di legame idrogeno tra eterologi β2m e catena pesante nell'MHC I di varie specie. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1: Purificazione delle proteine complesse Ptal-N*01:01/HeV1 solubili e riformuplicate e fotografie del cristallo utilizzato per l'analisi della diffrazione. La M è marcatori di peso molecolare in kDa. Il P1 sono gli aggregati. Il P2 è il complesso MHC. Il P3 è il complesso β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1 non è stato formato senza la presenza di uncomplesso H-2Kd di β 2 m. (B) è stato formato attraverso la rinaturazione con hβ 2 m. ( C ) Il complesso Ptal-N*01:01/HeV1 è stato formato attraverso la rinaturazione con bβ 2 m. ( C ) Ptal-N*01:01/HeV1 complesso è stato formato attraverso la rinaturazione con bβ 2 m. ( C ) Ptal-N*01:01/HeV1 complesso è stato formato attraverso la rinaturazione con bβ 2 m. ( C ) Ptal-N*01:01/HeV1 complesso è stato formato attraverso la rinaturazione con bβ 2 m. ( C ) Ptal-N*01:01/HeV1 complesso è stato formato attraverso la rinaturazione con bβ 2 m. ( C ) Ptal-N*01:01/HeV1 complesso è stato formato attraverso la renaturazione con bβ2m. (C) Ptal-N*01: Il profilo è marcato con le posizioni approssimative degli standard di massa molecolare di 75,0, 44,0 e 13,7 kDa. (D) Il complesso Ptal-N*01:01/ HeV1 è stato formato attraverso la rinaturazione con hβ 2 m. (E) Il cristallo è formato dal complesso Ptal-N*01:01/HeV1, che si è formatoattraversola rinaturazione con bβ2m. La freccia nera rappresenta il cristallo utilizzato per raccogliere dati durante la diffrazione dei raggi X. (F) Il cristallo è formato dal complesso Ptal-N*01:01/HeV1 che si è formato attraverso la rinaturazione con hβ2m. La freccia nera rappresenta il cristallo utilizzato per raccogliere dati durante la diffrazione dei raggi X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Legame idrogeno tra β2m e catena pesante nei complessi ibridi MHC I. Legame idrogeno tra β2m e catena H in (A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 e (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC complessi. Le interazioni di legame idrogeno sono rappresentate da una linea tratteggiata nera. Il quadrato rappresenta l'area ingrandita e visualizzata a destra nelle caselle colorate corrispondenti. Il rosso rappresenta che gli omologhi β2m e l'eterologo β2m usano gli stessi amminoacidi per formare legami idrogeno con la catena H. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Conformazione simile del complesso MHC e dei peptidi antigenici nei complessi ibridi MHC I. (A) La sovrapposizione di domini α1α2 di Ptal-N*01:01/bβ2m (verde) e Ptal-N*01:01/hβ2m (grigio). (B) La sovrapposizione del peptide HeV1 con la sovrapposizione del dominio α1α2 di ogni molecola di Ptal-N*01:01. HeV1 Peptide è rappresentato come rosa in Ptal-N*01:01/bβ2m e come giallo in Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) La sovrapposizione di domini α1α2 di H-2Db /mouse β2m (mβ2m) (verde) e H-2Db /hβ2m (grigio). (D) La sovrapposizione del peptide gp33 con la sovrapposizione del dominio α1α2 di ciascuna molecola H-2Db. Peptide gp33 è rappresentato come blu in H-2Db /mβ2m e come rosa in H-2Db /hβ2m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Allineamento della sequenza basato sulla struttura di hβ2m con β2m di altre specie. Le frecce nere denotano β-filamenti. I residui evidenziati in rosso sono completamente conservati e i residui nelle scatole blu sono altamente (>80%) Conservato. I triangoli gialli rappresentano gli amminoacidi chiave per l'interazione tra le β2m e H. L'allineamento della sequenza è stato generato utilizzando Clustal X32 ed ESPript33. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La costruzione di un complesso proteico ibrido attraverso la sostituzione eterologo da diversi taxa è una strategia comune per le indagini funzionali e strutturali quando il complesso omologo non è disponibile, come nell'MHC I e nei suoi ligandi. Tuttavia, vi è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia. Qui è stata analizzata la struttura del pipistrello MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizzata da bβ2m o hβ2m. Gli amminoacidi chiave di β2m che si legano a Ptal-N*01:01 sono stati trovati conservati tra pipistrello e umano. Dopo un'ulteriore analisi, il residuo chiave coinvolto nel legame di β2m con la catena H dell'MHC I è stato trovato conservato nei mammiferi ma polimorfo nei polli, nei pesci e negli anfibi. Questi dati indicano che la sostituzione β2m è un mezzo fattibile con cui studiare l'MHC I dei mammiferi. Tuttavia, la sostituzione tra mammiferi e uccelli, pesci o anfibi potrebbe non essere fattibile.
Gli studi strutturali svolgono un ruolo fondamentale nella comprensione dei meccanismi molecolari della presentazione peptidica da parte delle molecole di MHC I. La sostituzione β2m è comunemente usata negli studi strutturali MHC I14,16,17,18,26,27,28. Lavori precedenti hanno dimostrato che nei bovini MHC I, N*01801, murine β2m e bovini β2m si sono comportati in modo simile durante il legame con i domini α1α2 della catena N*01801 H17. Qui è stata analizzata la struttura di un singolo peptide presentata dalla stessa catena H di MHC I βdiversi β 2m. Questi dati mostrano che le conformazioni del peptide sono simili se stabilizzate da cross-taxa β2m, indicando così che la sostituzione eterologo di β2m non influisce sulla presentazione peptidica.
I peptidi antigene presentati da MHC I sono riconosciuti dal TCR per mediare l'attivazione delle cellule T29. Durante l'infezione virale, la valutazione delle risposte immunitarie delle cellule T specifiche dell'antigene migliorerà notevolmente la comprensione delle infezioni virali e delle risposte immunitarie dell'ospite. Il tetramero peptide-MHC è una tecnica importante per valutare le risposte delle cellule T; è una tecnica per tetramerizzare la molecola monomero MHC, migliorarne l'affinità e combinarla con più TCRS su cellule T. I tetrameri sono ampiamente utilizzati nella ricerca e nella diagnosiclinica 14,29,30. Recentemente, le cellule T progettate da TCR (TCR-T) sono diventate un argomento caldo nell'immunoterapia tumorale per la loro potenziale efficacia nel trattamento dei tumori maligni31. La colorazione dei tetrameri MHC I è un metodo cruciale per lo screening di specifici TCR vincolanti per peptidi antigene correlati al cancro presentati dalle molecole di MHC I29. Pertanto, la preparazione dei tetrameri MHC I svolge un ruolo vitale nello screening TCR. Oltre alla legatura della catena MHC I H, β2m si lega anche al CD8 sulla superficie della cella T, il che può portare a colorazioni non specifiche durante lo screening TCR mediante colorazione tetramero MHC I. La sostituzione β2m può diminuire questo legame non specifico del tetramero MHC I.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al protocollo. In primo luogo, sebbene E. coli rimanga l'espressione dominante ospite per le proteine ricombinanti, molte modifiche post-traslazionali non possono essere eseguite e i prodotti proteici espressi formano corpi di inclusione insolubili. Quindi, a causa della simile sostituzione di alcuni β non mammiferi2m con mammifero β2m, non è noto se il non mammifero β2m possa essere sostituito da β eterologo2m per assistere e stabilizzare la loro struttura MHC. Nel protocollo, abbiamo incluso una descrizione delle nostre analisi provate utilizzando sia il server NetMHCpan che Rosetta FlexPepDock. Sfortunatamente, nessuna delle due previsioni prodotte corrispondeva ai dati sperimentali. Ciò può indicare che le attuali previsioni peptidiche vincolanti dell'MHC non erano adatte a mammiferi non umani e non topi come i pipistrelli, che potrebbero avere un diverso modo di legare il peptide. Pertanto, dobbiamo combinare vari software di previsione e risultati sperimentali per un'analisi completa per ottenere peptidi ad alta affinità.
Nel protocollo qui descritto, il passaggio chiave è che l'MHC può essere renatured correttamente. È molto importante ottenere un complesso MHC ad alta efficienza di ripiezione. Pertanto, è fondamentale prestare attenzione per selezionare peptidi adatti e aumentare la purezza dei corpi di inclusione.
In conclusione, nel presente documento viene riassunto un protocollo per l'espressione MHC I, il ripieliatura, la cristallizzazione, la raccolta dei dati cristallini e la determinazione della struttura. Inoltre, è stata analizzata la fattibilità di βeterologidi sostituzione di 2 m nello studio MHC I. Questo studio fornisce un valido riferimento per la comprensione dell'MHC I negli studi strutturali e funzionali. Inoltre, questi dati sono significativi anche per la valutazione delle risposte delle cellule T durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal fondo aperto del laboratorio statale chiave di biotecnologia farmaceutica, Università di Nan-jing, Cina (Grant no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 81971501). William J. Liu è supportato dall'Excellent Young Scientist Program della NSFC (81822040) e dal Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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