Summary
Droge poederformuleringen voor inhalatie hebben een groot potentieel bij de behandeling van luchtwegaandoeningen. Voordat men aan menselijke studies begint, is het noodzakelijk om de werkzaamheid van de droge poederformulering in preklinische studies te evalueren. Een eenvoudige en niet-invasieve methode voor de toediening van droog poeder bij muizen via de intratracheale route wordt gepresenteerd.
Abstract
Bij de ontwikkeling van inhaleerbare droge poederformuleringen is het essentieel om hun biologische activiteiten te evalueren in preklinische diermodellen. Dit artikel introduceert een niet-invasieve methode voor intratracheale toediening van droge poederformulering bij muizen. Een droog poederlaadapparaat dat bestaat uit een 200 μL gellaadpipettip die via een driewegkraan op een spuit van 1 ml is aangesloten, wordt gepresenteerd. Een kleine hoeveelheid droog poeder (1-2 mg) wordt in de pipetpunt geladen en door 0,6 ml lucht in de spuit verspreid. Omdat pipettips wegwerpbaar en goedkoop zijn, kunnen verschillende droge poederformuleringen van tevoren in verschillende tips worden geladen. Verschillende formuleringen kunnen in hetzelfde dierproef worden geëvalueerd zonder apparaatreiniging en dosisvulling, waardoor tijd wordt bespaard en het risico op kruisbesmetting door restpoeder wordt geëlimineerd. De mate van poederdispersie kan worden geïnspecteerd door de hoeveelheid poeder die in de pipetpunt achterblijven. Een protocol van intubatie in muis met een op maat gemaakte lichtbron en een geleide canule is inbegrepen. Een goede intubatie is een van de belangrijkste factoren die de intratracheale afgifte van droge poederformulering aan het diepe longgebied van de muis beïnvloedt.
Introduction
De longroute van toediening biedt verschillende voordelen bij het leveren van therapeutische voor zowel lokale als systemische acties. Voor de behandeling van longziekten kan een hoge lokale medicijnconcentratie worden bereikt door longafgifte, waardoor de vereiste dosis wordt verlaagd en de incidentie van systemische bijwerkingen wordt verlaagd. Bovendien kunnen de relatief lage enzymatische activiteiten in de long het voortijdige medicijnmetabolisme verminderen. De longen zijn ook efficiënt voor drugabsorptie voor systemische actie toe te schrijven aan het grote en goed-doordrenkte oppervlakte, de uiterst dunne epitheliale cellaag en het hoge bloedvolume in longcapillairen1.
Geïnhaleerde droge poederformuleringen zijn op grote schaal onderzocht voor de preventie en behandeling van verschillende ziekten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, diabetes mellitus en longvaccinatie2,3,4. De drugs in de vaste staat zijn over het algemeen stabieler dan in de vloeibare vorm, en de droge poederinhalatoren zijn draagbaarder en gebruiksvriendelijker dan vernevelaars5,6. Bij de ontwikkeling van inhalatie droge poederformuleringen moeten de veiligheid, het farmacokinetische profiel en de therapeutische werkzaamheid worden geëvalueerd in preklinische diermodellen na longtoediening7. In tegenstelling tot mensen die droog poeder actief kunnen inademen, is longlevering van droog poeder aan kleine dieren een uitdaging. Het is noodzakelijk om een efficiënt protocol vast te stellen voor het leveren van droog poeder aan de longen van dieren.
Muizen worden veel gebruikt als onderzoeksdiermodellen omdat ze economisch zijn en ze goed fokken. Ze zijn ook gemakkelijk te hanteren en veel ziektemodellen zijn goed ingeburgerd. Er zijn twee belangrijke benaderingen om droog poeder toe te dienen aan de long van de muis: inhalatie en intratracheale toediening. Voor inademing wordt de muis in een kamer met alleen het hele lichaam of de neus geplaatst waar droog poeder wordt verneveld en de dieren de aerosol inademen zonder sedatie8,9. Dure apparatuur is vereist en de efficiëntie van de medicijnafgifte is laag. Hoewel de kamer voor het hele lichaam technisch minder uitdagend kan zijn, kan de blootstellingskamer alleen voor de neus de blootstelling van geneesmiddelen aan het lichaamsoppervlak minimaliseren. Hoe dan ook, het is nog steeds moeilijk om de dosis die aan de longen wordt geleverd nauwkeurig te controleren en te bepalen. Het droge poeder wordt voornamelijk afgezet in het nasopharynxgebied waar mucociliaire klaring prominent aanwezig is10. Bovendien staan muizen in de kamer tijdens het toedieningsproces onder aanzienlijke druk omdat ze beperkt zijn en geen voedsel- enwatervoorziening hebben 11. Voor intratracheale toediening verwijst het over het algemeen naar het rechtstreeks inbrengen van de stof in de luchtpijp. Er zijn twee verschillende technieken om dit te bereiken: tracheotomie en orotracheale intubatie. De eerste vereist een chirurgische procedure die een incisie in de luchtpijp maakt, die invasief is en zelden wordt gebruikt voor poedertoediening. Alleen de tweede techniek wordt hier beschreven. In vergelijking met de inhalatiemethode is intratracheale toediening de meest gebruikte methode voor longafgifte bij de muis vanwege de hoge afgifte-efficiëntie met minimaal medicijnverlies12,13. Het is een eenvoudige en snelle methode om precies een kleine hoeveelheid poeder binnen een paar milligram aan de muis te leveren. Hoewel de muis anatomisch en fysiologisch verschilt van de mens en anesthesie vereist is tijdens het intubatieproces, omzeilt intratracheale toediening de bovenste luchtwegen en biedt een effectievere manier om de biologische activiteiten van de droge poederformulering te beoordelen, zoals de longabsorptie, biologische beschikbaarheid en therapeutische effecten14,15.
Om droog poeder intratracheally toe te dienen, moet de muis worden geïntubeerd, wat een uitdaging kan zijn. In dit artikel wordt de fabricage van een op maat gemaakte droge poederinsufflator en een intubatieapparaat beschreven. De procedures van intubatie en insufflatie van droog poeder in de long van de muis worden gedemonstreerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), de Universiteit van Hong Kong. Droge poederformuleringen bereid door spray freeze drying (SFD) met 0,5% luciferase messenger RNA (mRNA), 5% synthetisch peptide PEG12KL4 en 94,5% van mannitol (m/w) worden in deze studie gebruikt om mRNA-expressie in de long aan te tonen16. De massa mediane aerodynamische diameter (MMAD) van SFD poeder is 2,4 μm. Spray gedroogd (SD) mannitol poeder worden gebruikt om het effect van luchtvolume gebruikt in poeder dispersie16te onderzoeken . De MMAD van SD poeder is 1,5 μm.
1. Vervaardiging van droge poeder insufflator en het laden van droog poeder
- (Optioneel) Neutraliseer de statische ladingen van droog poeder (in een flacon) en de 200 μL niet-filter ronde gel-laden pipet tip. Gebruik een antistatisch pistool of een balans met deïstiserende functie volgens de instructies van de fabrikant.
- Maak een weegpapier met een afmeting van ongeveer 4 cm x 4 cm. Vouw het papier diagonaal doormidden en vouw het vervolgens uit.
- Weeg 1-2 mg droog poeder op het weegpapier.
- Vul een gelbelading pipetpunt met poeder door de bredere opening van de punt. Tik zachtjes om het poeder in te pakken totdat het poeder losse agglomeraten vormt aan het smalle uiteinde van de punt (Figuur 1A). Vermijd het te strak verpakken van het poeder, omdat dit de poederdispersie kan belemmeren.
- Sluit de poederbelaste punt aan op een spuit van 1 ml via een driewegskraan (afbeelding 1B). De grootte van de spuit kan worden gewijzigd op basis van het volume lucht dat wordt gebruikt om het poeder te verspreiden. Houd de punt en spuit verticaal tijdens de aansluiting om morsen van poeder te voorkomen. Als de toediening niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, gebruik dan parafilm om de openingen van de punt af te dichten en bewaar deze tijdelijk onder geschikte omstandigheden tot toediening.
2. Fabricage van intubatieapparaat
- Lichtbron (figuur 2)
- Bereid een op maat gemaakte lichtbron voor met een led-toorts (light emitting diode) en een flexibele optische vezel met een diameter van 0,8-1 mm.
- Maak een gecentreerde opening op de heldere lens van de LED-toorts met een handboor of een boor zodat de optische vezel er nauwelijks doorheen kan.
- Steek de optische vezel door de opening. Schakel de LED-toorts in om de positie en de insteekdiepte aan te passen voor maximale helderheid aan de andere kant van de glasvezel.
- Breng de optische vezel op zijn plaats aan met heldere epoxylijm.
- Geleide canule (figuur 3)
- Neem een plastic Pasteur pipet van 1 ml(afbeelding 3A)en houd de pipet aan beide uiteinden vast.
- Gebruik een alcohollamp (of andere warmtebronnen in het laboratorium zoals een Bunsen-brander) om het midden van de pipet te verwarmen door deze op 5-10 cm boven de vlam te plaatsen (Figuur 3B). Draai de pipet om ervoor te zorgen dat deze gelijkmatig wordt verwarmd.
- Wanneer het plastic zacht en vervormbaar wordt, beweegt u de pipet weg van de vlam en rekt u de pipet voorzichtig uit.
- Knip de uitgerekt pipet in het midden met een schaar in deel A en deel B (afbeelding 3C-E). Gebruik deel A als fijne tippipet en deel B als geleide canule. Om de kans op succesvolle intubatie met de geleide canule te vergroten, maakt u een schuine kant (niet te scherp die het risico op verwonding van het dier kan verhogen) aan het einde van deel B (figuur 3F). Wanneer een 200 μL gel-ladende pipettip (voor poederlading) in de geleidekanule wordt gestoken, moet deze de canule 1-2 mm uitsteken.
OPMERKING: Een geleide canule (deel B) met de juiste afmeting (interne en externe diameter) voor intubatie kan een naald van 21 gauge erin hebben, terwijl deze ook in een naald van 17 gauge past. Meerdere pogingen kunnen nodig zijn om de pipetten uit te rekken om de juiste dimensie te bereiken. - (Optioneel): Knip een kleine opening aan het bredere uiteinde van de geleidekannula om deze flexibeler te maken, zodat het gemakkelijker is om de optische vezel vast te houden(figuur 3F). Deze opening maakt het ook mogelijk om een microsprayer aan te sluiten voor de toediening van vloeibare aerosol.
3. Intubatie
- Verdoof de muis (BALB/c, 7-9 weken) met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door intraperitoneale injectie.
- Maak een platform van plexiglas klaar en monteer het met een klem op een standaard (afbeelding 4A). Plaats de verdoofde muis op het platform (bij ongeveer 60° helling) in een liggende positie. De hoogte en hellingshoek van het platform kunnen worden aangepast door de positie van de klem op de standaard.
- Hang de muis op door de snijtanden aan een nylon floss te haken (figuur 4B). Bevestig de positie van de muis met een stuk tape of een elastiekje.
- Steek de optische vezel in de geleidekanule vóór intubatie met de punt van het vezelniveau met de opening van de geleidekanule. Schakel de LED-toorts in om op te lichten.
- Steek voorzichtig de tong van de muis uit met een tang om de luchtpijp bloot te leggen.
- Gebruik de andere hand om de geleidekanule met optische vezel erin te houden. Steek ze door de mondholte. Met de verlichting van de optische vezel kan de opening van de luchtpijp worden gevisualiseerd als een opening tussen de stembanden.
- Lijn de schuine kant van de geleidekanule uit naar de middellijn van de opening (figuur 5A). Intubeer de geleide canule voorzichtig met optische vezels in de luchtpijp door de fijnste punt van de canule op de luchtpijpopening te richten.
- Verwijder bij intubatie snel de optische vezel en laat de geleide canule in de luchtpijp (figuur 5B). Een normale ademhaling moet in acht worden genomen.
- Houd de fijne tippipet (deel A) bij de opening van de geleidekannula en insufflaat een kleine luchtwolk (ongeveer 0,2 ml) in de long van de muis. Een lichte inflatie in de borst van de muis duidt op een goede intubatie. Verwijder de fijne tippipet voordat u poedertoedient.
4. Poedertoediening
- Houd de poederbelaste punt vast die op de spuit is aangesloten, zoals beschreven in stap 1.5. Zorg ervoor dat de luchtstroom tussen de spuit en de punt is losgekoppeld.
- Trek de zuiger van de spuit naar achteren om 0,6 ml lucht terug te trekken.
OPMERKING: De hoeveelheid lucht die wordt gebruikt om het poeder te dispergeren is afhankelijk van de eigenschappen van het poeder en de hoeveelheid geladen poeder. Dit wordt verder beschreven in de resultatensectie. - Draai aan de klep van de driewegkraan om de luchtstroom tussen de spuit en de poederbelaste punt aan te sluiten.
- Steek de met poeder geladen punt in de geleidekanule die al in de luchtpijp van de muis is geplaatst (afbeelding 5C). Houd de geleide canule vast en duw de zuiger van de spuit krachtig in één continue actie om het poeder als aerosolen in de long te verspreiden.
OPMERKING: Elke voorwaartse beweging van het apparaat moet worden geminimaliseerd om verwonding van het dier te voorkomen. - Verwijder de punt en controleer of het poeder in de punt is geleegd. Zo niet, herhaal dan stap 4.1 tot en met 4.4.
OPMERKING: Als het poeder te strak is verpakt als gevolg van overmatig tikken, kan het zijn dat het niet goed wordt verspreid. - Zodra de toediening is voltooid, verwijdert u de geleidekanule uit de luchtpijp.
- Laat de muis herstellen door hem horizontaal in een liggende positie te plaatsen met zijn tong half uitsteekt om de blokkade van de luchtwegen te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer een droge poederinsufflator wordt gebruikt om poederaërosol aan de long van een dier te leveren, is het gebruikte luchtvolume van cruciaal belang omdat het de veiligheid en de efficiëntie van de poederdispersie beïnvloedt. Om de methode te optimaliseren, werden verschillende luchtvolumes (0,3 ml, 0,6 ml en 1,0 ml) gebruikt om het droge poeder (1 mg gespoten gedroogde mannitol) te dispergeren en werd het gewicht van muizen gedurende 48 uur na toediening gecontroleerd (figuur 6). Het gebruik van 0,3 ml en 0,6 ml lucht heeft geen gewichtsverlies van de muizen veroorzaakt tot 48 uur na toediening. Het verspreiden van het poeder met 1 ml lucht resulteerde in meer dan 5% van het gewichtsverlies binnen 24 uur, dat na 48 uur niet volledig werd hersteld. In dit protocol werden BALB/c muizen van 7-9 weken oud gebruikt. Afhankelijk van de soort, de stam en de leeftijd van het dier, de poedereigenschappen (bv. deeltjesgrootteverdeling, samenhang en dichtheid) en de massa van het toe te dienen poeder, kan het volume lucht dat moet worden gebruikt voor een efficiënte poederdispersie en de tolerantie van dieren door onderzoekers voor verschillende diermodellen moeten worden geoptimaliseerd.
Droge poederformulering bereid door spray freeze drying (SFD) werd aan de muizen geleverd met behulp van de hierboven beschreven methode. De SFD-formulering bevatte 0,5% van mRNA dat luciferase-eiwit uitdrukte, 5% van synthetisch peptide als leveringsvector en 94,5% van mannitol16. BALB/c muizen werden intratracheaal toegediend met 1 mg SFD-poeder dat 5 μg mRNA bevatte en de luciferaseexpressie in de longen werd na toediening na toediening geëvalueerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) (figuur 7). Het SFD-poeder werd verspreid in de diepe long en luciferase-expressie werd waargenomen. Ter vergelijking: het SFD-poeder werd gereconstitueerd in PBS (tot een eindvolume van 75 μL) en toegediend aan muizen als vloeistof met dezelfde intubatieprocedure, maar in plaats daarvan werd een microsprayer gebruikt om vloeibare aerosol16te genereren. De luciferase-expressie van de gereconstitueerde formulering was aanzienlijk hoger dan de droge poederformulering, wat te wijten kan zijn aan het poederoplossingsprobleem of een ander farmacokinetisch profiel tussen poeder en vloeibare vorm. De histologische kenmerken van de met mRNA droge poederaerosol behandelde longen werden vergeleken met onbehandelde controle- en lipopolysaccharidegroepen (LPS) (figuur 8). De longen zonder enige behandeling illustreerden een gezonde presentatie, terwijl de long die intratracheaal met 10 μg LPS werd behandeld, een onregelmatige verdeling van de luchtruimte en inflammatoire celinfiltratie in de interstitiële en alveolaire ruimten vertoonde. De met SFD-poeder behandelde longen vertoonden geen tekenen van ontsteking.
Figuur 1: Op maat gemaakte droge poeder insufflator.
(A) Poeder wordt verpakt in de buurt van het smalle uiteinde van de punt. (B) Een gel-laden pipet tip is verbonden met een 1 ml spuit via een drieweg kraan. De figuur is aangepast aan Liao et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Op maat gemaakte lichtbron voor intubatie.
Een flexibele optische vezel wordt aangesloten op een LED-toorts door een klein gaatje op de lens te maken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Canule begeleiden.
(A) Een 1 ml plastic Pasteur pipet wordt gebruikt om een geleide canule te maken. (B) De pipet wordt verzacht door verhitting. (C) De verwarmde pipet wordt uitgerekt en gesneden. (D) Deel A van de pipet wordt gebruikt als fine-tip pipet. (E&V) Deel B van de pipet wordt gebruikt als geleide canule. Er wordt een schuine kant gemaakt om de intubatieprocedure te vergemakkelijken. Een kleine opening (optioneel) kan worden gemaakt om de flexibiliteit van de canule te vergroten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Intubatieplatform.
(A) Het platform voor intubatie bestaat uit een plexiglas plaat die op een standaard is gemonteerd. (B) Een verdoofde muis wordt in een liggende positie op het platform geplaatst, opgehangen door de snijtanden met een nylon floss te haken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Schematisch schema dat de intubatieprocedure illustreert.
(A) De schuine kant van de geleidekanule is uitgelijnd met de middellijn van de luchtpijpopening. (B) De geleide canule wordt in de luchtpijp gestoken en klaar voor poedertoediening. (C) De met poeder geladen punt (verbonden met de spuit via een driewegkraan) wordt in de geleidekanule gestoken die al in de luchtpijp van de muis is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Intratracheale toediening van droog poeder met verschillende hoeveelheden lucht.
BALB/c muizen werden intratracheally toegediend met spray gedroogd (SD) mannitol poeder gedispergeerd door 0,3 ml, 0,6 ml en 1,0 ml lucht. Het lichaamsgewicht van de muizen werd gecontroleerd vóór toediening en om 18 uur, 24 uur en 48 uur na toediening. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde waarde van het percentage gewichtsverandering (n=2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Intratracheale toediening van mRNA-formulering als droog poeder en gereconstitueerde vloeibare aerosol.
BALB/c muizen werden intratracheally toegediend met spray freeze dried (SFD) 0,5% mRNA (luciferase) formulering als poederaerosol (1 mg) met behulp van op maat gemaakte droge poeder insufflator of gereconstitueerde vloeibare aerosol (1 mg in 75 μL PBS) met behulp van microsprayer. Elke muis kreeg een dosis van 5 μg mRNA. PBS (75 μL) werd gebruikt als controle. Na 24 uur na toediening (A) werden de longen geïsoleerd voor bioluminescentiebeeldvorming; B) luciferase-eiwitexpressie van de longweefsels werd gemeten. De gegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde waarde van de relatieve lichteenheid (RLU) per mg eiwit, geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA gevolgd door tukey's post-hoctest, ***p < 0,001 (n=4). De figuur is aangepast aan Qiu et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Histologie van de longen van muizen na intratracheale toediening van mRNA droge poederformulering.
A) onbehandelde controle; muizen werden intratracheaal toegediend met (B) LPS (10 mg in 25 μL PBS) en (C) spray gevriesdroogd mRNA-poeder (1 mg). Dia's werden bekeken met een rechtopstaande microscoop bij 20x vergroting (schaalbalk = 100 mm). De figuur is aangepast aan Qiu et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel worden op maat gemaakte apparaten voor droge poedersufflatie en intratracheale intubatie gepresenteerd. In de poederlaadstap wordt droog poeder in een pipetpunt van 200 μL gel geladen. Het is belangrijk om voorzichtig op de punt te tikken om de losse verpakking van poeder aan het smalle uiteinde van de punt mogelijk te maken. Als het poeder echter te strak is verpakt, komen ze vast te zitten in de punt en kunnen ze niet goed worden verspreid. Het wordt aanbevolen om de statische ladingen van het poeder en de pipetpunt te neutraliseren om het laden van poeder te vergemakkelijken, met name voor poeder met een lage dichtheid en bij een lage relatieve vochtigheid. De geleide canule is een cruciaal onderdeel van het apparaat. Het wordt gebruikt om de intubatie van poederbelaste pipetpunt in de luchtpijp van de muis te vergemakkelijken. De diameter van de geleidekanule mag niet te breed zijn; anders zal het moeilijk zijn om het in de luchtpijp te plaatsen en kan de muis verwonden. De diameter van de geleidekanule moet net breed genoeg zijn om de optische vezel en de poederbelaste pipetpunt te passen, en de pipettip moet de geleidekanule ongeveer 1-2 mm uitsteken.
Het vermogen om de opening van de luchtpijp te visualiseren is cruciaal in het intubatieproces, waardoor de geleide canule correct kan worden ingebracht. De luchtpijpopening bestaat uit wit arytenoïde kraakbeen met regelmatige openings- en sluitbeweging aan de achterkant van de keel. Met de glasvezelverlichting kon de opening van de luchtpijp gemakkelijk worden gevisualiseerd. Door een klein volume lucht door de plastic pipet met fijne punt te blazen, duidt een inflatie op de borst op een goede intubatie. Als de inflatie op de borst niet wordt waargenomen of als er weerstand wordt gevoeld tijdens het inbrengen, trekt u de geleidekanule snel in en herhaalt u de stappen opnieuw.
Er was een veel gebruikte in de handel verkrijgde droge poeder insufflator12,17,18 (Tabel van materialen; dit apparaat is nu stopgezet). Het droge poeder wordt in de monsterkamer van het apparaat geladen en door lucht uit een plastic luchtspuit van 3 ml of een luchtpomp verspreid. Om de uitgestoten dosis te meten, moet het apparaat voor en na poedertoediening worden gewogen, wat leidt tot onnauwkeurigheid, aangezien de dosis poeder meestal erg klein is (ten opzichte van de massa van het apparaat). In vergelijking met de commerciële insufflator is het grootste voordeel van het op maat gemaakte apparaat dat het succes van poederdispersie kan worden waargenomen door de afwezigheid van poeder in de transparante gelbelading pipetpunten. Omdat de pipettip licht is, kan deze ook nauwkeurig worden gewogen voor en na toediening om de uitgezonden dosis te meten. De pipetpunt wordt in de geleide canule gestoken in plaats van te worden blootgesteld aan de luchtpijp van het dier. Er is een minimaal risico op verontreiniging van de punt met het vocht of de afscheiding in de luchtpijp (wat de nauwkeurigheid van de uitgestoten dosismeting kan beïnvloeden). Omdat de pipettips wegwerpbaar en goedkoop zijn, kunnen verschillende droge poederformuleringen van tevoren in verschillende tips worden geladen. Verschillende formuleringen kunnen in hetzelfde dierproef worden geëvalueerd zonder dat het apparaat hoeft te worden gereinigd en de dosis hoeft te worden bijgevuld, waardoor tijd wordt bespaard en het risico op kruisbesmetting door restpoeder wordt geëlimineerd. Bovendien varieerde het poederdispersiepatroon dat door de commerciële insufflator werd gegenereerd tussen verschillende formuleringen. Een aantal studies meldde dat droog poeder gedispergeerd door de commerciële insufflator gemakkelijk geagglomereerd was en bij toediening19,20de diepe long niet bereikte . Daarentegen wordt gemeld dat andere formuleringen die zijn verspreid door apparaten die vergelijkbaar zijn met die van ons een hoge longdepositie hebben15,21,22.
Er zijn andere soortgelijke op maat gemaakte apparaten gemeld in de literatuur voor de toediening van poederaërosol aan de long van dieren. Chaurasiya et al. beschreven bijvoorbeeld het gebruik van een canulebuis voor intubatie en poederlading, met een spuit verbonden met de canulebuis na intubatie voor poederdispersie23. Hoewel hun aanpak gestandaardiseerde apparatuur en materiaal (bijv. otoscoop, canule en spuit) gebruikt met minder maatwerk, biedt de methode hier enkele duidelijke voordelen. Ten eerste maakt het bevestiging van de juiste intubatie vóór toediening van geneesmiddelen mogelijk. Deze stap is vooral handig voor minder ervaren gebruikers. Ten tweede kan de geleide canule fungeren als een beschermend schild om te voorkomen dat afscheiding of vocht in de luchtpijp de gelbelading pipetpunt vervuilt, waardoor een nauwkeurigere dosismeting door weging mogelijk wordt. Ten slotte kan de flexibelere geleidende canule samen met de optische vezel een gemakkelijkere intubatie mogelijk maken.
Kortom, een op maat gemaakte droge poeder insufflator die goedkoop, wegwerpbaar, reproduceerbaar en efficiënt is in het precies verspreiden van een kleine hoeveelheid poeder, wordt in dit papier geïntroduceerd. Het genoemde intubatieproces is niet-invasief, snel en kan poederformuleringen veilig en nauwkeurig aan de muizen leveren. Het kan ook worden aangenomen om vloeibare formulering toe te dienen voor longafgifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen de heer Ray Lee, de heer HC Leung en de heer Wallace So bedanken voor hun vriendelijke hulp bij het maken van de lichtbron en poederinsufflator; en de Facultaire Kernfaciliteit voor de hulp bij dierbeeldvorming. Het werk werd ondersteund door de Research Grant Council, Hong Kong (17300319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
References
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
- Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
- de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
- Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
- Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
- He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
- Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
- Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454 (2017).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Price, D. N., Muttil, P.
- Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
- Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
- Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
- Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
- Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
- Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
- Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
- Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
- Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
- Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
- Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
- Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).
