Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En patient-derived Xenograft modell för Venous Missformation

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61501
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar ett detaljerat protokoll för att generera en murine xenograft modell av venous missbildning. Denna modell är baserad på subkutan injektion av patient-härledda endotelceller som innehåller hyper-aktiverande TIE2 och/eller PIK3CA genmutationer. Xenograft skador recapitulate nära de histopatologiska funktionerna i VM patient vävnad.

Abstract

Venous missbildning (VM) är en Vaskulär anomali som uppstår från nedsatt utveckling av det venous nätverket som resulterar i dilaterad och ofta dysfunktionella vener. Syftet med denna artikel är att noggrant beskriva inrättandet av en murine xenograft modell som härmar mänskliga VM och är kunna återspegla patientens heterogenitet. Hyper-aktiverande icke-ärvda (somatiska) TEK (TIE2) och PIK3CA mutationer i endotelceller (EG) har identifierats som de viktigaste drivkrafterna för patologiska fartyg utvidgningen i VM. Följande protokoll beskriver isolering, rening och utvidgning av patient-härledda EG uttrycker mutant TIE2 och/eller PIK3CA. Dessa EG injiceras subkutant i baksidan av immunodeficient athymic möss att generera ectatic Vaskulära kanaler. Skador som genereras med TIE2 eller PIK3CA-mutant EG är synligt vascularized inom 7\u20129 dagar efter injektion och rekapitulera histopatologiska funktioner av VM patient vävnad. Denna VM xenograft modell ger en tillförlitlig plattform för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som driver VM-formation och expansion. Dessutom kommer denna modell att vara avgörande för translationella studier testa effekten av nya läkemedelskandidater för att förhindra den onormala kärl utvidgningen ses i mänskliga VM.

Introduction

Defekter i utvecklingen av vasculature är den bakomliggande orsaken till många sjukdomar inklusive venous missbildning (VM). VM är en medfödd sjukdom som kännetecknas av onormal morfogenes och expansion av vener1. Viktiga studier på VM-vävnad och endotelceller (EC) har identifierat gain-of-function mutationer i två gener: TEK, som kodar tyrosinkinasreceptorn TIE2, och PIK3CA, som kodar p110α (katalytisk subenhet) isoform av PI3-kinas (PI3K)2,3,4,5. Dessa somatiska mutationer resulterar i ligand-oberoende hyperaktivering av viktiga angiogena/tillväxtsignaleringsvägar, inklusive PI3K/AKT, och resulterar därigenom i dilaterade ektatiska vener3. Trots dessa viktiga genetiska upptäckter, de efterföljande cellulära och molekylära mekanismerna utlöser onormal angiogenes och bildandet av utvidgade Vaskulär kanaler är fortfarande inte helt klarlagda.

Under normal och patologisk angiogenes, nya fartyg gro från en redan existerande vaskulär nätverk och EG genomgår en sekvens av viktiga cellulära processer inklusive spridning, migration, extracellulär matris (ECM) ombyggnad och lumenbildning6. Två- och tredimensionella (2D/3D) in vitro kulturer av EG är viktiga verktyg för att undersöka var och en av dessa cellulära egenskaper individuellt. Trots detta finns det en tydlig efterfrågan på en musmodell som rekapitulerar patologiska fartygsförstoring inom värdmikromiljöen samtidigt som den utgör en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för translationell forskning.

Upp till datum, en transgenic murine modell av VM är associerad med TIE2 gain-of-function mutationer har inte rapporterats. Nuvarande transgena VM musmodeller förlitar sig på det allestädes närvarande eller vävnadsbegränsade uttrycket för den aktiverande mutationen PIK3CA p.H1047R3,5. Dessa transgena djur ger betydande insikt i hela kroppen eller vävnadsspecifika effekter av denna hotspot PIK3CA mutation. Begränsningen av dessa modeller är bildandet av ett mycket patologiskt vaskulärt nätverk som resulterar i tidig dödlighet. Således återspeglar dessa musmodeller inte helt den sporadiska förekomsten av mutationella händelser och lokaliserad karaktär VM patologi.

Tvärtom är modeller med patienthärledd xenograft baserad på transplantation eller injektion av patologisk vävnad eller celler som härrör från patienter till immunficienta möss7. Xenograft modeller är ett kraftfullt verktyg för att bredda kunskapen om sjukdomsutveckling och upptäckt av nya terapeutiska medel8. Dessutom, med hjälp av patient-härledda celler tillåter forskare att rekapitulera mutation heterogenitet att studera spektrumet av patientens fenotyper.

Här beskriver vi ett protokoll där patient-härledda VM EG som uttrycker en mutant konstitutivt-aktiv form av TIE2 och/eller PIK3CA injiceras subkutant i baksidan av athymic naken möss. Injicerade vaskulära celler är upphängda i en ECM-ram för att främja angiogenes enligt beskrivningen i tidigare vaskulära xenograft-modeller9,10,11. Dessa VM EG genomgå betydande morfogenes och generera utvidgade, perfused patologiska fartyg i avsaknad av stödjande celler. Den beskrivna xenograft-modellen av virtuell dator ger en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för deras förmåga att hämma okontrollerad lumen expansion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patient vävnadsprover erhölls från deltagarna efter informerat samtycke från insamling och förråd av vävnadsprover och data från patienter med tumörer och vaskulära anomalier under en godkänd institutionell granskningsnämnd (IRB) per institutionell politik vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute och med godkännande av kommittén för klinisk undersökning. Alla djurprocedurer som beskrivs nedan har granskats och godkänts av CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Beredning av material och stamlösningar

  1. Beredning av komplett endotelcellstillväxtmedium (EGM)
    1. Komplettera endothelialt basalt medium (EBM) med följande tillväxtfaktorer som finns i satsen (se Tabell över material): human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF), Long Arg3 Insulin-Like Growth Factor- I (R3-IGF-I), askorbinsyra, epidermal tillväxtfaktor (EGF), gentamycinsulfat och amphotericin-B och heparin. Tillsätt 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) lösning och 20% fetala nötkreatur serum (FBS).
      OBS: Vi rekommenderar inte att man lägger till hydrokortison.
    2. Sterilt filtrera lösningen under en laminär flödeshuv genom ett 0,2 μm flasktoppfilter i en autoklaverad glasflaska och alikvotsmedia i 50 mL koniska rör och förvaras vid 4 °C upp till en vecka eller vid -20 °C i upp till ett år.
  2. Förbered kollagenas En stamlösning
    1. Förbered 50 mg/mL kollagenas En stamlösning i 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS).
    2. Sterilt filtrera lösningen under en laminär flödeshuv med 0,2 μm filter och spruta, och förvara 100 μL alikvoter vid -20 °C.
  3. Förbered vävnadsinsamlingsmedium (Buffert A)
    1. Förbered en Ca2+/Mg2+ stamlösning genom att tillsätta 0,927 g kalciumkloriddikhydrat (CaCl2.2H2O) och 1 g magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4.7H2O) till 500 mL destillerat vatten. Sterilt filtrera lösningen genom ett 0,2 μm flasktoppfilter till en autoklaverad glasflaska och förvara i rumstemperatur (RT).
    2. Komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% Ca2+/Mg2+ lösning och 2% FBS.
    3. Sterilt filtrera lösningen under en laminär flödeshuv med 0,2 μm filter och spruta och förvara alikvoter på 5 mL vid -20 °C.
  4. Fibronectin beläggning av vävnad kulturplattor
    1. Förbered beläggningsbuffert (BufferT B) genom att lösa upp 5,3 g natriumkarbonat (Na2CO3; 0,1 M) i 500 mL avjoniserat vatten. Justera buffertens pH-värde till 9,4 med hjälp av 1 M saltsyra (HCl). Filtrera under en laminär flödeshuva genom ett 0,2 μm flasktoppfilter till en autoklaverad glasflaska och förvara på RT.
    2. För beläggning, pipetter 2 mL/5 mL/10 mL buffert B per 60 mm/100 mm/145 mm vävnadsodlingsplatta, respektive. Tillsätt 1 μg/cm2 av human plasmafibronectin renad proteinlösning och fördela försiktigt vätskan på plattan.
    3. Inkubera plåt vid 37 °C, 5%CO 2 i 20 min.
    4. Aspirera Buffer B och tvätta plattan med PBS före odlingsceller.

2. Isolering av endotelceller från VM-patientvävnad

  1. Isolering av EG från solid VM-vävnad
    OBS: VM vävnad är resected genom debulking kirurgi12,13 under en IRB godkänt protokoll.
    1. Tvätta VM vävnad (vävnad provvikt varierar typiskt mellan 0,5 g och 1,5 g) i 5% PSG i PBS.
    2. Överför vävnad till en 100 mm cellodlingsfat, köttfärsvävnadsprov i små bitar med hjälp av sterila kirurgiska dissektionsverktyg och överför till ett koniskt rör på 50 mL.
    3. Tillsätt 100 μL kollagenas A stamlösning till 5 mL buffert A för en slutkoncentration på 1 mg/mL, tillsätt sedan detta i vävnaden och smälta den malda vävnaden vid 37 °C i 30 min medan du skakar innehållet var 5 min.
    4. Slipa försiktigt den rötade vävnaden vid RT med hjälp av en 6 mm, slät-yta mortskkvarn inom 50 mL koniska röret.
    5. Fortsätt att noggrant slipa smält vävnad med hjälp av en mortelstöt samtidigt som 5 mL kall PBS kompletteras med 0,5% bovint serum albumin (BSA) och 2% PSG. Upprepa detta steg fyra gånger.
    6. Filtrera lösningen genom en 100 μm cellsil i ett 50 mL koniskt rör för att avlägsna vävnadsfragment.
    7. Centrifugera cellupphängning i 5 min vid 400 x g vid RT. Fortsätt till steg 2.3.
  2. Isolering av VM EG från lesional blod som erhållits från patientens sclerotherapy
    1. Skaffa mänskliga VM lesional blod från sclerotherapy enligt en IRB godkänt protokoll.
    2. Späd lesional blod (prov volym vanligtvis varierar mellan 0,5 mL och 5 mL) i PBS till en slutlig volym på 40 mL.
    3. Centrifugera cell suspension i 5 min vid 200 x g vid RT.
  3. Inledande cellplätering
    1. Kassera supernatant och resuspend den encelliga pelleten i 1 mL av EGM.
    2. Tillsätt 9 mL komplett EGM på fibronectinbelagda (1 μg/cm²) 100 mm plattor och frö 1 mL cellupphängning.
    3. Inkubera celler vid 37 °C i en befuktad 5% CO2 atmosfär.
    4. Varannan dag ta bort 2 mL media och tillsätt 2 mL sterilt filtrerat FBS.
    5. När cellkulturer nå en sammanflyent av 40\u201250% ändra mediet för att slutföra EGM. Det tar normalt mellan 2\u20123 veckor för cellerna att nå denna confluency.
    6. Observera dagligen för uppkomsten av EG-kolonier. De kan kännas igen av deras typiska "kullerstensliknande" morfologi (Figur 1A). Mellan 3\u20125 EC-kolonier visas i varje prov.
    7. Byt medium varannan dag i ytterligare 5\u20127 dagar tills enskilda EG-kolonier börjar röra vid varandra.
  4. Manuell isolering av enskilda EG-kolonier
    1. För att skörda EG-kolonier, tvätta plattan med 5 mL PBS och aspirera manuellt med en serologisk pipett.
    2. Ta plattan till ett mikroskop och cirkla platser för flera EG-kolonier med hjälp av en markeringspenna både på lock och botten innan du returnerar den till laminär flödeshuva.
    3. Lösgör EG-kolonier genom pipettering av 50 μL av 0,05% trypsin-EDTA-lösning på de markerade områdena.
    4. Med hjälp av en liten cell skrapa eller en pipett spets, försiktigt skrapa celler från plattan.
    5. Luta plattan till närmaste kant, och skölj med 1 mL EXTRA EXTRAFUNKTION per markerat område och samla celler.
    6. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
    7. Platta de insamlade EG-kolonierna med en densitet på 1 x 104 celler/cm2 på fibronectinbelagda (1 μg/cm²) cellodlingsrätter som innehåller färsk extra bolagsstämma. Nästa dag, ändra medium för att slutföra extra bolagsstämma.
    8. Ändra mediet för att slutföra EGM varannan dag i 2\u20123 veckor tills celler når 80% konfluency.
    9. Trypsinize EC med 2 mL förvärvda 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm skål vid 37 °C i 2 min och neutralisera trypsin genom att lägga till 4 mL extrasävlar.
    10. Samla in cellupphängningen i ett 15 mL koniskt rör och centrifug vid 400 x g vid RT i 5 min. Aspirera de supernatant och resuspend cellerna i 2 mL av EGM.
    11. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Typiska celltal som erhålls är 1 x 106 celler per 60 mm cellodlingsplatta eller 2 x 106 celler per 100 mm vävnadsodlingsplatta.
    12. Pellet cellerna genom centrifugeringen vid 400 x g vid RT i 5 min och aspirera supernatanten. Gå vidare till steg 3.2.1.

3. Endotel cell val och expansion

  1. Framställning av anti-CD31-konjugerade magnetiska pärlor
    1. Vortexa injektionsflaskan som innehåller anti-CD31-konjugerade magnetiska pärlor för 30 s. Antalet pärlor som krävs är 8 x 106 pärlor/2 x 106 celler.
    2. Tvätta önskad mängd anti-CD31-konjugerade magnetiska pärlor med 1 mL tvättlösning som innehåller 0,1% BSA i PBS i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör.
    3. Placera mikrocentrifugröret i en cellisoleringsmagnet i 1 min.
    4. Aspirera supernatanten och upprepa tvättsteget.
  2. Endotelcellsrening och plätering
    1. Resuspend cell pellet erhållen i 2.4.12 i 500 μL av tvättlösning som innehåller 0,1% BSA i PBS.
    2. Tillsätt celllösning till mikrocentrifugrör som innehåller magnetiska pärlor och resuspend noggrant.
    3. Inkubera i 20 min vid 4 °C med skonsam lutning.
    4. Tillsätt 500 μL på 0,1% BSA i PBS och blanda väl.
    5. Placera röret på en cellisoleringsmagnet i 1 min.
    6. Aspirera försiktigt all vätska, som innehåller cellernas CD31-negativa fraktion utan att vidröra pärlorna.
    7. Tvätta pärlpelletsen som innehåller den CD31-positiva cellfraktionen med 1 mL på 0,1% BSA i PBS och upprepa magnetisk separation.
    8. Upprepa tvätt och magnetisk separation steg i minst 3 gånger för att rena CD31-positiv cellfraktion.
    9. Resuspend renat endotelceller i en 15 mL koniska röret och snurra ner i 5 min vid 400 x g vid RT.
    10. Ta bort supernatant och resuspend cell pellet i 1 mL extra bolagsstämma.
    11. Tillsätt 9 mL komplett EGM på fibronectinbelagda (1 μg/cm²) 100 mm plattor och frö 1 mL cellupphängning. Observera att vissa magnetiska pärlor fortfarande är knutna till cellerna i denna inledande seedning steg. De flesta pärlor tvätta bort under cellexpansion, men litet antal pärlor kan kvarstå i tidiga passager.
    12. Inkubera celler vid 37 °C i en befuktad 5% CO2 atmosfär.
    13. Byt medium varannan dag tills cellerna når 80 % konfluency (Figur 1B).
  3. Endotelcellsexpansion
    1. När celler når 80 % konfluency, lossa med 2 mL av 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm skålen vid 37 °C i 2 min.
    2. Neutralize trypsin by adding 4 mL of EGM and collect cells into one 15 mL conical tube.
    3. Centrifugera vid 400 x g vid RT i 5 min.
    4. Aspirera de supernatant, resuspend celler i 2 mL av EGM, och räkna antalet celler med en hemocytometer eller genom automatiserad cellräkning.
    5. Fröceller med en densitet på 1 x 104 celler/cm² till 145 mm fibronectinbelagda (1 μg/cm²) vävnadsodlingsplattor.
    6. Fortsätt att passageceller tills önskat cellnummer har uppfyllts. Tänk på att en konfluent 145 mm vävnadsodlingsplatta innehåller ca 8\u20129 x 106 celler och antalet celler som behövs är 2,5 x 106 celler per injektion. Endast celler mellan passage 3 och 8 bör övervägas för xenograft.

4. VM patient-härledda xenograft-protokollet

OBS: I detta protokoll använder vi 5\u20126 vecka gammal, manlig immunodeficient, athymic naken Foxn1nu möss.

Alla djurprocedurer måste godkännas av Kommittén för vård och användning av 1991 911 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC).

  1. Beredning av material dagen före injektion
    1. Pre-chill sprutor, nålar, och pipet tips i -20 °C frys över natten.
    2. Tina långsamt källaren membranet extracellulär matris (BMEM) över natten på is hink placeras vid 4 °C för att undvika ökad viskositet av gelen.
  2. Beredning av cellfjädring för injektion
    1. Trypsinize EC med 5 mL förvärvda 0,05% trypsin-EDTA per 145 mm maträtt vid 37 °C i 2 min.
    2. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 5 mL EGM och samla in celler i ett koniskt rör på 15 mL.
    3. Centrifugera vid 400 x g vid RT i 5 min.
    4. Aspirera supernatanten, resuspendcellerna i 3 mL extra bolagsstämma, och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
    5. Bestäm det totala antalet celler som behövs för alla planerade injektioner.
      OBS: Det rekommenderade antalet celler är 2,5 x 106 celler per injektion. Totalt 2 injektioner utförs vanligtvis i varje mus för tekniska dubbletter. Det är nödvändigt att beräkna ett 10% överskott av cellnummer för att redovisa förlust under överföring i sprutan.
    6. Överför volymen som innehåller det beräknade cellnumret till ett nytt koniskt rör på 50 mL och pelletceller genom centrifugering vid 400 x g vid RT i 5 min.
    7. Aspirera supernatanten och lämna en liten volym (ca 50\u201270 μL) för att lossa pelleten.
  3. Spruta förberedelse
    1. Beräkna en övervolym på 20 μL/injektion för att redovisa förlust under överföring till sprutan. Resuspend cell pelleten med 220 μL BMEM per injektion på is. Den injicerade volymen av cell suspension kommer att vara 200 μL per lesion.
    2. Blanda cellupphängningen ordentligt på is för att få en homogen cellfjädring och undvik att skapa bubblor.
    3. Med hjälp av en 1 mL pipet och 1 mL spruta, samtidigt pipet BMEM-cell blandningen i sprutan öppning genom sugkraft medan du drar kolv av spruta.
    4. Luer lås en 26G x 5/8 tums steril nål till sprutan och hålla beredda sprutor platt på is före injektion.
  4. Subkutan injektion i musen
    1. Söva mössen med 5% isofluran/syreblandning vid en flödeshastighet på 1 L/min med hjälp av en isofluran vaporizer. Se till att djuren sederas på rätt sätt (t.ex. okänslighet till tåknypor). Upprätthålla anestesi via kontinuerlig administrering av 1,5% isofluran/syre som levereras via noskon.
    2. Placera möss på magen, exponera ryggregionen där ympning kommer att ske och desinficera injektionsregionen med 70% etanol.
    3. Rulla försiktigt den förberedda sprutan för att återanvända eventuella avgjorda celler. Snärta bubblor till nåländen av sprutan och utvisa en liten volym av cellen suspensionen för att säkerställa avlägsnandet av alla bubblor.
      OBS: Två injektioner kan utföras för varje mus – till vänster och höger sida av musen tillbaka.
    4. Nyp och skapa en 'tältliknande' struktur med tummen och pekfingret och för in nålen subkutant rakt under huden. Se till att nålen bara huden är djupt genom att släppa in klämd hud för att förhindra injektion i muskelvävnad.
    5. Holding nål i 45° vinkel injicera försiktigt 200 μL av cell-suspensionen för att skapa en liten sfärisk massa (Figur 1C).
    6. Registrera musvikt med en skala, öronmärka musen och återgå till bur.
    7. Övervaka möss efter sedering för att säkerställa att de återgår till normal aktivitet.
  5. Övervakning av lesionstillväxt
    1. Med hjälp av ett bromsok, mät längden och bredden på varje stickpropp (Bild 1D).
    2. Dokumentera mätningar varannan dag fram till lesionssamling.

5. Insamling och bearbetning av vävnad

  1. Avliva möss 9 dagar efter implantation i en CO2-kammare och kontrollera vitala tecken för att bekräfta dödsfall. Utför cervikal störning på mössen som en sekundär metod för att avliva musen.
  2. Skörda xenograft lesion/plugg från flanken av musen genom dissektion med hjälp av kirurgiska forceps och sax.
    OBS: För att förhindra att de blodfyllda kärlen spricker inom stickproppen är det viktigt att undvika att vidröra lesionspluggen med dissektionsverktyg och låta överdriven omgivande vävnad som hud som sitter fast på stickproppen.
  3. Sänk den resected lesion i PBS att tvätta.
  4. Ställ in en kamerascen med en kamera. Rikta in pluggarna på en skärbräda med en linjal. Ta en bild av alla pluggar för att registrera grov kärlteckning av lesioner (Bild 1E).
  5. Fixa pluggar genom att dränka i 10% formalin över natten på RT.
  6. Tvätta pluggar i PBS följande dag och flytta dem till 70% etanol.
  7. Process lesion pluggar för paraffin inbäddning (patologi kärna).

6. Lesionssektionering

  1. Använd en mikrotom för att skära 5 μm sektioner från de uppsamlade murinskadorna på positivt laddade objektglas.
    OBS: För den efterföljande analysen är avsnitt i mitten av kontakten (ca 50\u201270 μm in i vävnaden) av betydelse.
  2. Smält paraffin vid 60 °C i 1 h före färgning.
  3. De-paraffinize och re-hydrate vävnad sekventiellt under en kemisk rök flöde huva. Därför inkubera glida i xylen i 10 min, 100% etanol (EtOH) för 5 min, 90% EtOH för 3 min, och 80% EtOH för 3 min.
  4. Skölj rutschkana i avjoniserat vatten i 5 min.

7. Hematoxylin och Eosin (H&E)

  1. Inkubera sektioner i Hematoxylin i 2 min.
  2. Placera diabilder i en färgning burk och skölj i ett handfat av en stadig ström av kranvatten tills vattnet är klart.
  3. De-hydrat diabilder genom att inkubera vävnad sekventiellt i 70% EtOH i 1 min, 80% EtOH i 1 min, 90% EtOH för 1 min, 100% EtOH i 1 min, och färska 100% EtOH i 1 min.
  4. Fläcksektioner i Eosin Y för 30 s.
  5. Skölj i färsk 100% EtOH tills lösningen är klar.
  6. Inkubera glid i xylener i 2 min. Låt glidbanor torka för 5\u201210 min under draghuven.
  7. Dispensera en droppe permanent, icke-vattenhaltig monteringsmedium över xenografts sektioner och placera coverslip ovanpå.
  8. Låt diabilder torka över natten före bildtagning.

8. Immunhistokemi

  1. Förbered antigenhämtningsbuffert (Tris-EDTA) genom att väga 0,6 g Tris-bas och 1 mL på 0,5 M EDTA till 500 mL avjoniserat vatten. Justera pH till 9,0 med hjälp av 1 M HCl. Tillsätt 250 μL av Tween-20.
  2. Inkubera avparaffinerade vävnadsglas (enligt erhållet i steg 6.2\u20126.3) i en bägare med antigenhämtningsbuffert under omrörning på ett värmeblock, under 20 min vid 95 °C.
  3. Ta bort bägaren från värmeblocket, låt lösningen svalna till 35 °C och tvätta sedan i PBS i 3 min.
  4. Block vävnad sektioner i 5% normal häst serum i PBS för 30 min vid RT.
  5. Bered en biotinylerad Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) arbetslösning genom att späda 20 μg/mL biotinylerat UEA-I i 5% normalt hästserum i PBS.
  6. Pipet 50\u2012100 μL av UEA-I arbetslösning per sektion och inkubera i 1 h vid RT i en befuktande kammare.
  7. Tvätta diabilder två gånger i PBS i 3 min.
  8. Släcka objektglassektioner i 3% väteperoxid i 5 min vid RT.
  9. Tvätta diabilder två gånger i PBS i 3 min.
  10. Förbered 5 μg/mL streptavidin pepparrot peroxidas-konjugerat i 5% normal häst serum i PBS.
  11. Pipet 50\u2012100 μL på varje vävnadsglas och inkubera i 1 h vid RT i en befuktande kammare.
  12. Tvätta diabilder två gånger i PBS i 3 min.
  13. Förbered 3,3'Diaminobenzidine (DAB) lösning enligt tillverkarens anvisningar och tillsätt 50\u2012100 μL per avsnitt.
  14. Inkubera sektioner för 10\u201215 min, kontroll och övervakning för utveckling av fläcken varje 2\u20125 min.
  15. Tvätta diabilder tre gånger i PBS i 3 min.
  16. Tillsätt en droppe Hematoxylin och inkubera i 3 min.
  17. Placera diabilder i en färgning burk och skölj i ett handfat av en stadig ström av kranvatten tills vattnet är klart.
  18. Sekventiellt inkubera objektglas i 80% EtOH i 1 min, 90% EtOH i 1 min, 100% EtOH i 1 min, och xylen i 2 min.
  19. Låt glidbanor torka för 5\u201210 min under draghuven.
  20. Dispensera en droppe permanent, icke-vattenhaltig monteringsmedium över xenografts sektioner och placera coverslip ovanpå.
  21. Låt diabilder torka över natten före bildtagning.

9. Analys av kärlkanaler som härrör från människan

OBS: Vaskularitet av VM-lesioner kvantifieras genom mätning av vaskulär område och vaskulär densitet. Endast UEA-I positiva, människa-härledda vaskulära kanaler beaktas för kvantifiering.

  1. Ta fyra till fem bilder per lesion avsnitt med en ljus fält mikroskop vid en 20x förstoring (hög effekt fält [HPF]). Ta HPF-bilder i ett x-planmönster inom lesionssektionen för att undvika överlappning (Bild 1F-H). Inkludera ett skalstreck på de bilder som tagits.
  2. Öppna HPF-bilderna i Bild J (Arkiv > Öppna). Kalibrera skallistens pixlar enligt följande. Använd verktyget för rak linje och gå över skalstången. För att omvandla de uppmätta pixlarna till mm klicka på Analysera > Ställ skala.
  3. Klicka på Analysera > Ställ in mått och välj Område och Lägg till för att överlagra.
  4. Mät den totala fältytan i en HPF med hjälp av Analysera > Mät. Spara denna mätning för kvantifiering i steg 9.8.
  5. Med hjälp av verktyget frihandsval, manuellt skissera UEA-I+ vaskulära kanaler.
    OBS: En kärlkanal definieras som vilket område som helst som är kantad med UEA-I+ - EG som kan innehålla blodkroppar.
  6. Klicka på Analysera > Mät för att kvantifiera det skisserade UEA-I+ vaskulära området (mm2/HPF).
  7. Upprepa denna mätning för alla fem HPF som tas inom en kontakt.
  8. Genomsnitt den totala vaskulär area av alla fem HPF. Det erhållna vaskulära området per HPF delas därefter med HPF-fältområdet (i mm2, steg 9,5) och uttrycks som en procent (%).
  9. För kvantifiering av vaskulär densitet, räkna antalet UEA-I+ vaskulära kanaler av varje HPF som tas. Den vaskulära densiteten är det genomsnittliga antalet UEA-I+ vaskulära kanaler som räknas per HPF-område (fartyg/mm2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver processen för att generera en murine xenograft modell av VM baserat på subkutan injektion av patient-härledda EG i baksidan av immundeficient naken möss. Endotelcellskolonier kan skördas inom 4 veckor efter den inledande cellisolering från VM-vävnad eller lesionalt blod (Figur 1A,B). Dagen efter injektionen täcker xenograft-lesionspluggen en yta på ungefär 80\u2012100 mm2. I våra händer, lesion pluggar med TIE2/PIK3CA-mutant EG är synligt vascularized och perfused inom 7\u20129 dagar från injektion 14,15 (Bild 1C-E). Omfattningen av lesion tillväxt är dock variabel och reflekterar över patienten och prov heterogenitet.

Lesionspluggar rekapitulerar noggrant de histopatologiska egenskaperna hos mänsklig VM-vävnad: förstorade kärlkanaler som kantas av ett tunt lager av endotelceller (Figur 1F\u2012H). Dessa kärlstrukturer innehåller typiskt erytrocyter, vilket bekräftar funktionella anastomoser med värdmusens vaskulatur (Figur 1F\u2012H). Immunohistokemisk färgning med hjälp av den mänskliga specifika lektin UEA-Jag kan bekräfta att celler foder kärlskador härrör från mänskliga implanterade celler snarare än mus vasculature (Figur 1H). Ett schema som sammanfattar stegen från VM-EG-isolering till dissektion av lesionsplugg presenteras i figur 2.

Figure 1
Diagram 1: Representativa resultat.
(A) Representativ bild av primär blandad cellkultur tre veckor efter isolering från VM vävnad före EG-urval. Typisk endotelcellskoloni (EG) och förorenande fibroblast (FB). (B) Bild av en renad (CD31 bead-urval) endotel cell kultur från VM patient-härledda vävnad. Skala bar = 200 μm. (C) Lesionen kommer att bilda en sfärisk struktur. Vascularization är synlig på grund av blåaktig färg genom huden på nakna möss. (D) Streckade linjer visar hur lesionsstorleken kodas om genom att mäta längden (L) och bredden (W) med hjälp av ett bromsok. (E) Foto av synbart vascularized, xenograft lesion explant på dag 9. Skala bar = 1 cm. (F) Representativ bild av en lesion plugg avsnitt. Det x-planmönster där fem högeffektfältbilder tas för kvantifiering indikeras av vita streckade rutor. Skala bar = 1000 μm. (G\u2012H) Representativa bilder av VM lesion plug sektioner. (G) Hematoxylin och Eosin färgning och (H) immunohistokemi av humanspecifikt lectin UEA-I. Skala bar = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Schematisk för arbetsflödet för att generera en patienthärledd xenograft av virtuell dator.
(A) Endothelial celler isolerade från patienten VM lesion fast vävnad eller lesional blod är pläterade och, när 80% konfluency nås, väljs av anti CD31-konjugerade immunomagnetiska pärlor och expanderas. (B) För subkutan injektion av EG, på dag 0, hud på baksidan av musen kläms med hjälp av pekfinger och tumme för att skapa en tältliknande struktur. Lesioner mäts vid dag 1 och sedan varannan dag (röda pilar) med hjälp av ett bromsok genom experimentell dag 9. Skador dissekeras och bearbetas för histologisk analys. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en metod för att generera en patient-härledda xenograft modell av VM. Denna murine modell presenterar ett utmärkt system som gör det möjligt för forskare att få en djupare förståelse för patologiska lumen utvidgningen och kommer att vara avgörande för att utveckla effektivare och riktade terapier för behandling av VM. Detta kan enkelt anpassas för att undersöka andra typer av vaskulära anomalier såsom kapillärlymfatisk venös missbildning16. Det finns flera steg som är avgörande för den framgångsrika generationen av reproducerbara vaskulära lesioner. För det första måste de patienthärledda endotelcellerna vara rena (utan närvaro av andra celltyper) och växer exponentiellt vid tidpunkten för injektionen. Kontaminerande fibroblast eller andra mesenchymala icke-EG kan lätt kännas igen av avlånga morfologi. Vid sällsynta tillfällen är det möjligt att även efter rening med hjälp av anti-CD31 antikropp konjugerade magnetiska pärlor, ett litet antal icke-EG kvar i kulturen. Dessa kulturer kräver ytterligare rening med endotel specifika cellytan markörer. Som ett alternativt tillvägagångssätt är encellig klonal expansion av endotelceller möjlig. Detta skulle återförsäkra homogeniteten hos mutant-EG som alla celler inom en kultur skulle härröra från en enda cell. Detta tillvägagångssätt rekommenderas dock inte för VM-härledda EG som celler tenderar att toppa sina spridningsmöjligheter och konvertera till en senescent fenotyp efter 9\u201210 passager. Det är kritiskt att använda celler mellan passager 3\u20128 för xenograft experiment och att inte passageceller dagen före injektionen.

Xenograftmodellen kan modifieras för att undersöka andra vaskulära anomalier som medför olika aktiverande mutationer. Dessutom, eftersom patientvävnadsprover är svåra att komma åt för vissa laboratorier, kan xenograft-modellen anpassas genom att använda EG, såsom humant navelsträngsblod endotelceller (HUVEC), genetiskt konstruerad för att uttrycka mutationen / s kända för att orsaka dysfunktionella vaskuläratillväxt 15,17.

Antalet celler som rekommenderas för injektionen i xenograft är 2,5 x 106 celler/200 μL BMEM. Om cellantalet är otillräckligt är det dock möjligt att antingen minska antalet injektioner per djur till ett eller att minska injektionsvolymen till ett minimum av 100 μL. För den senare är det dock viktigt att bibehålla celltäthetsförhållandet t.ex.6 Vid arbete med BMEM måste alla steg utföras på is för att undvika stelning av cellfjädringen före injektion. Under injektionen är det viktigt och att nålen sätts in i en vinkel på 45° direkt under huden och bort från muskelvävnaden, eftersom injicering i muskler hindrar lesionsreproducerande och gör lesionsdissektionen svår. Totalt två injektioner kan utföras på varje mus—en till höger och en på vänster sida av varje djur. Den andra injektionen i samma mus kan fungera som en teknisk replikat. Fler injektioner på baksidan rekommenderas inte som skador växer med tiden och kan störa varandra. För statistisk analys i prekliniska studier där xenograftpluggar av behandlade mot obehandlade (endast fordon) möss jämförs rekommenderar vi användning av minst 5 djur (10 xenograft pluggar) per studiegrupp. Om den andra injektionen finns tillgänglig skulle den alternativt kunna användas som en "intern kontroll" med icke-mutant EG. Vi har använt primär icke-mutant EG, såsom HUVEC, som en kontroll och har visat att dessa celler bildade ett försumbart antal småkanaler 14,15. I dessa HUVEC kontroll lesion pluggar har vi dessutom märkt infiltration av murine-härledda Vaskulär kanaler i kontakten efter dag 9. Om den experimentella konstruktionen kräver längre inkubationstider kan dessa infiltrerande kanaler lätt uteslutas från analys genom färgning för en människospecifik markör som humanspecifik CD31-antikropp eller Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I) som inte korsreagerar med mus.

För att säkerställa att lesionen inte blir en börda för djurhälsa och välbefinnande är det viktigt att observera lesionsstorlek, registrera musvikt dagligen och uppmärksamma eventuella sidokomplikationer som blödning och blåmärken. Om lesionsvolymen överstiger 500 mm3, måste experimentet avslutas.

När kärlskador förstoras och perfunderas, måste extrem uppmärksamhet ägnas under dissekering för att undvika rupturing lesionen. Det är viktigt att undvika att röra lesionspluggen med dissektionsverktyg och lämna överdriven omgivande vävnad (såsom hud) fäst vid kontakten. Detta förhindrar kollaps av de vaskulära strukturerna inom xenograft kontakten som skulle störa korrekt analys.

Slutligen, för att upprätthålla konsistens, är det viktigt att den ursprungliga histologiska analysen börjar i mitten av kontakten (ca 50\u201270 μm i vävnaden) snarare än de gränsregioner där anastomosing mus vasculature kan vara närvarande. Det rekommenderas starkt att fläcka vävnadssektionerna med en människospecifik EG-markör, såsom UEA-I eller en alternativ människospecifik antikropp som inte kommer att korsreagera med mus, för att bekräfta att kärlstrukturer bildas av människa-härledda EG snarare än invaderande mus EG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Nora Lakes för korrekturläsning. Forskning som rapporterats i detta manuskript stöddes av National Heart, Lung, och Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del av National Institutes of Health. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Tags

Utvecklingsbiologi Utgåva 160 Venös missbildning xenograft endotelceller TIE2 PIK3CA kärllesion
En patient-derived Xenograft modell för Venous Missformation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. … More

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter